肿瘤防治杂志2005生 !旦箜 鲞篁 塑 』 垒 兰垦 垦兰 :!垦兰垒!! ! ! : :
脐带血单个核细胞体外诱导成 CIK细胞
及其抗肿瘤效应的实验研究
用永春 , 王熙才, 苏晓三, 金丛国, 伍治平
昆明医学院第三附属医院 云南省肿瘤研究所,云南 昆明 650118
· 35 ·
《基础 ·临床研究l
Proliferation /n vitro fr()m the cord blood mononuclear cells and the anti-tumor effect of CIK cells
ZHOU Yong-chun。WANG Xi—cai,SU Xiao-san,J ING Cong—guo,ⅣU Zhi—ping
Cancer Institute of Yunnan Province,Third A{ltliated Hospital of Kunming Medical College,
Kunming 650118,P.R.China
【摘要】 目的:探索建立CIK细胞的原代培养方
法并阐明其生物学特性,为该细胞在肿瘤生物过
继免疫治疗中的运用奠定基础。方法:通过加入
4种细胞 因子(I 7、I 2、IL_1及 OKT3)将脐
带血单个核细胞(a Cs)诱导成CIl(细胞;利
用流式细胞仪测定细胞
表
关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf
型、细胞增殖情况及细
胞周期的分布;利用改良的 肼 法测定效应细
胞的体外细胞毒活性。结果:四种细胞因子的联
合运用,可诱导出大量的aK 细胞,其相对百分
率增长了163倍(从 0.14 到 22 ),增殖高峰
位于第 1O~12天,针对 K562、Hela和 yrMLC
肿瘤细胞株,CIK细胞在效靶比为 64:1时的杀
伤活性分别为 7&57土3.48、77.75:1.90和81.25:
1.51,在 32:1时分别为 62.oo土2.31、6O.83±
2.8o和 64.07士2.87,在 16:1时分别为51.43±
2.51、52.87士2.91和 54.1O士3.11,均显著高于
(细胞 及 C Cs,P一0.001;而在效靶 比
为 8:1(25.10士2.66、21.4土 1.55和 28.77±
3.56)及4:1(17.10土2.10、11.93土1.86和9.49土
2.92)时与后两者差异无统计学意义,P=0.083。
结论:1)脐带血可作为诱导 CIK细胞的重要来
源;2)联合运用细胞因子能诱导 出大量的 CⅡ(细
胞,其增殖高峰位于培养的第 l2天,适宜在此期
进行临床运用;3)CⅡ(细胞较 (细胞具有更
高的体外杀瘤活性,合理利用该细胞将为肿瘤生
物免疫治疗注入新的希望。
肿瘤 防治杂志 ,2005,12(1) 35~4O
[~BsrnAcr] OI~ECqlNE:T0 investigate the protocol for the cul—
ture of CIK cells in vitro and so to buiId the experimentaI ba~ment for
their further clinical application.METHODS:CIK cells were generated
by culture CBMNCs in the presence of four cytokines(IFN-7.IL_2,IL_
1 and 0KT3).CLK cells were analyzed by FACS to confirm the phe—
notypes,proliferation and cellular cycles. e eytotoxidty in vitro was
tested by the improved MTT assay.REsI】I :CIK cells were ex—
panded significantly by co-culturing with the four cytokines.Their reI—
ative percentage was expanded 163 folds(from 0.14 to 22%).The
proliferation peak appeared at day 1O一 12.At the ratio of 64:1 be—
tween effective cells and target cells,CIK cells had the cytotoxicities of
78.57土 3.48,77.7± 1.90 and 81.2土 1.51 respectively against the
tumor cell Iines of K562.Hda and YTM C,and at the ratio of 32。
1 the cytotoxicities were 62 00+2.31,60.83+2.8O and 64.07~2.87,
at the ratio of 16:1 they were 51.43土 2.51 and 52.87± 2.91 and
54.1O±3.11,which were all significantly higher than LAK cells and
CBM Cs,P—O.001.However at the ratios of 8:1(25.1O±2.66,
21.4±1.55,28.77±3.56)and 4:1(17.1O士 2.1O,l1.93± 1.86,9.49
±2.92),there were no significant differences among them,P=0.083.
∞ N I】s10Ns:1)Cord blood can serve as an important nmterials for
the generation of CIK cells,2)CIK cells can be proliferated greatly af—
ter co-culturing with the four cytokines.It is a suitable time for clinieaI
application at day 12,which is the proliferation peak~3)CIK cells pos—
sess higher cytotoxicity in vitro than LAK cells。and so using them
reasonably will provide a new hope for tumor’s adoptive cellular im—
munotherapy.
C ,CancerPrey Treat,2005,12(1):35— 4O
【关键词】 免疫,细胞;免疫疗法,过继;单核细胞;肿瘤/免疫学
[KEYWORDS] immunity,cellular,immunotherapy,adoptive monocytes;neoplasms/immunology
【基金项目】 云南省教育厅基金资助项目(03Y483C)
【第一作者简介】 周永春 ,女,重庆人,硕士,主要从事肿瘤生物免疫治疗及细胞生物学的研究工作。
Tel:86—87l一8185656--2029 E-mail:chungui7625@163.corn
【通讯作者简介】 王熙才,男,云南昭通人,副教授,硕士生导师,主要从事肿瘤生物免疫治疗及细胞生物学的研究工作。
Tel:86—871—8185656--2049 E-mail:wangxc20011@sina.corn
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周永春,等 脐带血单个檀 堕堡 透曼盛 塑堕垦基 旦±堕垫堕 塞堕堑童
机体的免疫状态在肿瘤的发生、发展过程中起了
举足轻重的作用,提高患者的免疫功能直接关系到疾
病的发生、发展及预后Ⅲ。近 30年来 ,肿瘤综合治疗
的理念被提出,肿瘤的生物免疫治疗成为继手术 、化疗
及放疗后的第 4大治疗模式。在该领域中,过继性免
疫细胞治疗倍受重视,但传统使用的淋巴因子激活的
杀伤(1ymphokine activated killer,LAK)细胞和肿瘤
浸润淋 巴细胞 (tumor—infiltrating lymphocytes,TIL)
等均因取材困难、扩增效率不高、免疫活性低下及伴随
诸多不良反应等原因,运用受到了限制口]。继续寻找
高效安全的免疫效应细胞成为迫切要求。我们通过联
合运用细胞因子,成功地从脐带血中诱导出了增殖活
性高、杀瘤活性强的细胞 因子诱导的杀伤 (cytokine—
induced killer,CIK)细胞,并初步研究了其生物学特
性,旨在为该细胞的临床运用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
健康足月产胎儿脐带静脉血 50 mL(枸橼酸钠抗
凝),采 自昆明医学院第二附属医院。产妇:陈××,女,
26岁,住院号:103512,各项生化指标检测正常。肿瘤细
胞株 Hela、K562和 YTMLC购 自昆 明医学 院;Rp-
MI1640培养基和淋巴细胞分离液购 自GIBCO公司,
MTT购自 AMR鳓 公司,细胞因子购 自 Bioscience
公司,CD4-FITC/CDs—PE/CD3一PC5及同型对照和CD3一
FITC/CD~6+56-PE及同型对照购自BioVision公司。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养 脐血利用淋巴细胞分离液作密度
梯度 2 500 r/min离心 30 min,提取 CBMNCs。CIK
细胞 的培 养:以 RPMI1640调 整细胞数 为 1×1O。
个/mL,接种于 24孔培养板,930 L/孔,第 1天加入
rhIFN一7 1 000 U/mL,培养 24 h后加入 rhlL一2 300
U/mL、rhlL-1 100 U/mL及 oKT3 50 ng/mL继续培
养,每隔 4 d更换培养基,调细胞数为 1×10。个/mL,
补加 rhlL一2 300 U/mL,每 8 d在补加 rhlL-2的同时
补加 OKT3 50 ng/mL。LAK细胞 的培养:以 RP—
MI1640调整细胞数为 1×10 个/mL,接种于 24孔培
养板 ,980 t,L/~L,加入 PHA 60/~g/mL及 rhlL一2 500
U/mL培养,每隔 4 d更换培养基,调整细胞数为 1×
10 个/mL,补加 rhlL-2 100 U/mL。设不加细胞因子
的 CBMNCs培养组作为对照,每 4 d更换培养基;3株
肿瘤细胞按常规方法复苏、培养和传代。
1.2.2 细胞表型检测 于培养的不同时间对以上各
组效应细胞进行分析 ,每组每次测 4个复孔 ,得到各表
型细胞的百分率及绝对数,同时荧光标记后在显微镜
下观察 CIK细胞形态。
1.2.3 细胞周期检测 取肿瘤细胞洗涤、固定,加入
Triton—xl00及Rllase 37~C孵育15 min,加入PI染液,避光
室温放置30 m_in,用流式细胞仪检测,分析DNA周期[3 。
1.2.4 改良MTT法检测细胞毒活性 LAK和 CIK
细胞于培养的第 8天及第 12天检测,设立不同的效靶
比(64:1、32 :1、16:1、8 :1和 4:1),均 以
CBMNCs空白组作为对照,以下式计算效应细胞的活
性 ,结果以 A值的 土s表示。
效应细胞的细胞毒活性( )=(1一塞堕塑 嘉 )×1。。96
1.3 统计学处理
数据采用 SPSS 10统计软件包处理,计量资料采
用方差分析,两两比较采用 LSD方法,趋势图用 EX—
CEL制作。
2 结果
2.1 三种效应细胞体外增殖情况及表型分析
CIK细胞从培养的第 4天起出现快速增殖,增殖高
峰期在 10~12 d,随后细胞数量减少,增殖的细胞主要
为 CD3 CD5。 的双阳性细胞 (图 1,Fig.1)。在培养过
程中,该细胞所占相对百分率由0.3 上升为 22%,增
长了163倍,绝对数增加约 1 300倍(图2,Fig.2)。LAK
细胞的增殖高峰在第 8天,随后细胞数减少(图 3,Fig.
3),增殖的细胞表型主要为 CD3 CD。。 CD5。 细胞,其
相对百分率最大增殖倍数仅为 64倍,远远低于 CIK细
胞。随培养时间的延长,CIK及 LAK细胞培养组中
CD3 、CD4 细胞均有升高,尤 以 CD3 细胞增高为甚
(图4,Fig.4)。CIK细胞培养组中的 CDs 细胞于培养
的第 4天达峰值,此后呈下降趋势;LAK 细胞组中的
CD8 细胞于第 8天达高峰,随后亦逐渐下降;对照组
CBMNCs培养体系中未出现明显的细胞表型转化,各种
细胞成分均呈递减趋势(表 1,Tab.1)。
2.2 CIK细胞形态学表现
镜下观察 :CBMNCs呈悬浮生长,大小均匀,折光
性一致,CIK组细胞经 4 d培养后部分细胞 明显增
大,可见细胞集落,胞核密度加强,体积增大,胞质内
可见分泌颗粒,胞膜光滑,未见突起(图 5,Fig.5)。用
CD。一FITC/CD16+56-PE双色荧光标记显示,CIK细胞
呈黄绿色圆型大淋 巴细胞(图 6.Fig.6),体积明显大
于普通淋巴细胞(绿色荧光,体积相对较小)。
2.3 效应细胞的体外细胞毒活性
CIK细胞对 NK敏感(K562)或非敏感株细胞(Hela、
YTMLC)及贴壁或悬浮生长的肿瘤细胞均显示出强大的
杀伤活性,且该活性随效靶浓度比的增加而增大。针对
各株靶细胞,LAK细胞组亦显示出良好的杀瘤活性,其
最适效靶浓度比为 32:1,但各浓度效靶比下的杀瘤活性
仍然低于 CIK细胞组,P=0.000;对照组 CBMNCs未显
示出活跃的细胞毒活性,P=0.000(表2,Tab.2)。
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肿瘤防治杂志2005年1月箍 鲞笙!塑 ! 』 垒 垦垦 垦垦 !垦垦垒!!』 : :! :1
2.4 细胞周期的检测
在行效应细胞毒活性测试时,3种靶细胞均处于同
步化的分裂增殖期,各株细胞均无凋亡,K562、Hela和
YTMLC细胞的增殖指数分别为 54.1、58.4和 46.6(图
7,Fig.7),为 MTT实验提供了较好的可比性。
‘ i 2
A ●
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O
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●
一
j, , ⋯
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-
A:培养前 ;B:培养后 。
图 1 CD。 CD56 细胞增殖情况
A:Before culture;B:After culture.
Fig.1 Expression of CD3 CD56 cells
55O
.
.
500
兰45O
量400
350
三300
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2 1 5 1 8 22
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时问(天)
C1 K
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图 2 CIK细胞培养增殖情况
Fig.2 Proliferation profile of CIK cells
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时 间 (天 )
· 37 ·
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LAK
图 3 LAK细胞培养增殖情况
Fig.3 Proliferation profile of LAK cells
A:培 养前;B:培养后 。
图 4 CD。 CD56 细胞增殖情况
A :Before culture;B:After culture.
Fig 4 Proliferation profile of CD3 CD56 cells
表 1 三组细胞培养不同时间的表型变化( ±s, )
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Tab 1 Phenotype chang⋯ of eIIs of th ree groups at diffe rent times r
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图 5 CIK细胞彤峦变化情况(x 400)
A:CBMN( _¨ f¨-¨ l L L~fTIIIj Lj -l I~ II
Fig 5 Morphological changes。f CIK cells{x 400
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图 6 O!K细胞形意(x B口0)
、【【nd⋯ i⋯ ⋯ ) n lJIl Ii i r L¨ ¨J L c r—L L】it I
Fig 6 Morp1cl0甜 OlK ~e]ls l×800I
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凰 7 各组靶细胞细胞周期分布
Fig 7 Cel Lula r cycles ol}he target cetls
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肿瘤防治杂志 生 旦箜 鲞箜 塑 旦! 』 垒 垦垦 垦垦 !垦垦垒!! y_ L — 旦
表 2 三组效应细胞体外杀瘤活性比较( ±s)
Tab.2 Cytotoxicity comparison of cells of three groups/n vitro ( ± 5)
3 讨论
我们通过实验,初步建立了一套有效的体外培养
CIK细胞的方法,并阐明了其重要的生物学特性。
3.1 OlK细胞的诱导培养
我们的实验选用脐带血作为来源,基于以下原因:
1)脐带血来源广泛、采集方便、保存容易,且对供者无
任何伤害;2)脐带血免疫原性低,输注脐带血 CIK细
胞存在移植物抗宿主反应(graft—versis—host—disease,
GVHD)低的优点;3)肿瘤患者外周血中总淋巴细胞
降低,各淋巴细胞亚群比例紊乱,血清中存在众多免疫
抑制因子,不利于扩增 ]。
在我们的实验 中,CIK 细胞 的培养增 幅与 Lu
等 的报道基本相同。而 LAK细胞增幅高于 Hoyle
等 的报道,可能与培养方法不同有关。培养过程中,
各细胞 因子作用各 异且加入 的顺 序 至关重要 :OKT3
与 T细胞上的 CD。抗原结合从而促进 T细胞的有丝
分裂;IL一1介 导 CBMNCs表达 白介素 2受体,与
rhIFN一7和 OKT3合用以提高 CIK细胞的毒效应,但
其对细胞的扩增不起作用;IL一2促进 T细胞的增殖;
rhlFN一丫可上调 CBMNCs表面的 IL一2受体数及肿瘤
细胞上 MHC I类分子的表达 。我们的研究结果显
示,CIK细胞 的增殖高峰位于第 12天,与 Schmidt
等 报道的第 28天有差异,可能因培养基内所含的血
清浓度不一致造成(我们的实验浓度为 15 9/6,文献报
道为 10 ),增殖高峰的存在提示 CIK细胞用于治疗
时 ,输注时间至关重要 。
3.2 OlK细胞的体外细胞毒活性
我们的实验证实,在效靶 比为 64:1、32:1和
16:1时 CIK细胞显示 出了较 LAK细胞及 CBMNCs
强的杀伤活性 ,而在 8:1及 4:1时与后两者无差异。
尽管如此,因 CIK细胞体外增殖能力远远大于 LAK
细胞及 CBMNCs,故输注后其体内活性仍可高于后两
者 ]。各效靶比间比较显示,LAK细胞的最适杀伤比
为 32:1,与既往实验相符 。CIK细胞的活性随效
靶浓度比的递增而相应增加,提示临床运用中必须保
证足够量效应细胞的输注。
3.3 OIK细胞的杀瘤机制
细胞 因子是机体抗 肿瘤作 用中的重要组成部
分 1¨ 。有文献报道 ,CIK细胞经培养后可分泌大量的
Thl类细胞因子,以促进肿瘤细胞对 CIK细胞的敏感
性 。在我们的实验中,CIK细胞组经培养后 CD。
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·4O· 周永春,等 脐带血单个核细胞使外诱昱盛 ! 塑堕垦基 堕墼堕 塞堕 窒
细胞得到大量扩增 ,间接提示其体内活性与提高 T细
胞的功能有关。CIK细胞虽然来源于 T细胞,但其在
杀瘤机制上更类似于 NK细胞,溶瘤作用是其主要作
用机制 。
3.4 CIK细胞的运用前景
随着免疫学、分子生物学及细胞生物学技术的发
展,过继性细胞免疫治疗越来越受到关注。因 CIK细
胞的运用可以在不损伤机体的前提下进行,故对骨髓
移植后微小残余病灶的清除及通过放、化疗或手术使
肿瘤缩小至最小时治疗最为有效;对于已失去手术机
会、体质较差及不能耐受大剂量放、化疗的患者,治疗
亦能减轻症状、提高生活质量及延长生存期。该疗法
与现在的常规治疗方法有极大互补性。
但如何使输注的效应细胞特异性地到达靶部位,及
如何使其穿越肿瘤细胞周围的重重屏障而保证数量、功
效不衰减等问
题
快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题
尚待进一步研究。继续探讨 CIK细胞
增殖影响因素、体内分布情况及临床适应证等课题,必
将有助于过继性细胞免疫疗法的成熟和完备。
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收稿日期:2004—05—17 修回日期:2004—10—18
(编辑 :王兴武)
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