中华肿瘤投稿版肺炎衣原体感染在H..

肺炎衣原体感染在HEp-2细胞黏附和迁移中的作用＊ 张利军 洪莉 陈宁 沈炳玲 邓艳秋 权伟 王蓓蓓 张丽莙 【摘要】 目的 观察肺炎衣原体（C.pn）感染在人喉癌细胞系（HEp-2）细胞黏附和迁移中的作用，以期阐明C.pn感染在肿瘤转移中的作用及机制。方法 C.pn增殖培养后感染HEp-2细胞, 光镜下观察细胞病变，吖啶橙染色观察细胞内C.pn包涵体的形态特点，透射电镜观察C.pn包涵体超微结构。细胞黏附实验观察C.pn感染对HEp-2细胞黏附能力的影响。创伤修复实验和Transwell实验检测C.pn感染HEp-2细胞后，细胞迁移能力的改变。结果 C.pn感染HEp-2细胞72 h后，细胞内的空泡状结构即包涵体几乎占据整个胞浆。吖啶橙染色结果显示，细胞内的包涵体呈黄绿色葡萄串状。透射电镜观察到包涵体内成熟的梨形原体（EB）明显增多，而圆形的网状体（RB）则较少。细胞黏附实验结果显示，C.pn感染HEp-2细胞2 h后，C.pn感染组黏附细胞的吸光度（A）值0.669±0.011，明显高于对照组的0.558±0.005（P<0.001），C.pn感染组的细胞黏附率为119.89%。创伤修复实验结果显示，C.pn感染HEp-2细胞24 h后，细胞向划痕中央迁移的距离明显长于对照组（P<0.05）。Transwell实验结果显示，C.pn感染HEp-2细胞12 h后，C.pn感染组的细胞迁移数目明显多于对照组（P<0.001）。结论 C.pn感染能增强HEp-2细胞的黏附能力，同时还能促进HEp-2细胞迁移，提示C.pn感染可能在喉癌转移过程中起促进作用。 【主题词】 喉肿瘤；肺炎衣原体；细胞黏附；细胞迁移；肿瘤转移 Role of Chlamydia pneumoniae infection in HEp-2 cell adhesion and migration ZHANG Li-jun, HONG Li, CHEN Ning, SHEN Bing-ling, DENG Yan-qiu, QUAN Wei, WANG Bei-bei, ZHANG Li-jun. Department of Pathophysiology, Basic Medical College, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China Corresponding author：Zhang Li-jun, E-mail: lijunwz@hotmail.com 【Abstract】 Objective To observe the effect of Chlamydia pneumoniae (C.pn) infection on human epidermoid carcinoma-2（HEp-2) cell adhesion and migration, to further clarify the role and mechanism of C.pn infection in tumor metastasis. Methods HEp-2 cells were infected with C.pn after the culture and propagation of C.pn. Cytopathic effect was observed with a microscope. Morphological characteristics of C.pn inclusions in HEp-2 cells were examined under fluorescence microscope by acridine orange staining. The ultrastructural changes of C.pn inclusions in HEp-2 cells were investigated by transmission electron microscope (TEM). Cell adhesion assay was performed to investigate the effect of C.pn infection on the adhesion of HEp-2 cells to collagenⅠ. The wound-healing assay and Transwell assay was performed to explore the effect of C.pn infection on HEp-2 cell migration. Results At 72 h post-infection, C.pn infected-HEp-2 cells were swollen and partially desquamated. Numerous vacuoles termed the inclusion were observed and C.pn inclusions occupied almost the whole cytoplasm under the light microscope. The grape-like C.pn inclusions were observed in HEp-2 cells under fluorescence microscope by acridine orange staining at 72 h after infection. Under TEM, there were more mature pear-shaped elementary bodies, but less larger and round reticulate bodies in HEp-2 cells infected with C.pn for 72 h. In the cell adhesion assay, the A value in C.pn infection group is 0.669±0.011, which was far higher than that in the control group (0.558±0.005) at 2 h after infection. There was significant statistical difference (P<0.001). The cell adhesion ratio in C.pn infection group is 119.89%. The migration distance of C.pn infected-HEp-2 cells was significantly longer than that of control cells at 24 h after infection in the wound-healing assay (P<0.05). HEp-2 cells infected with C.pn for 12 h were found to migrate more than the control cells in the Transwell assay (P<0.001). Conclusion C.pn infection can significantly promote the HEp-2 cell adhesion to collagenⅠand migration of HEp-2 cells, indicating that C.pn infection may play an important role in promoting the metastasis of laryngeal cancer. 【Subject words】 Laryngeal neoplasms; Chlamydia pneumonia; Cell adhesion; Cell migration; Neoplasm metastasis 喉癌是临床上常见的恶性肿瘤，在头颈外科恶性肿瘤中发病率仅次于鼻咽癌、上颌窦癌。近年来，喉癌在我国的发病率正日益攀升，一般认为这与吸烟、酗酒、长期吸入有害物质、乳头状瘤病毒感染及环境污染等因素有关。研究发现，肺炎衣原体（Chlamydia pneumoniae，C.pn）感染与肺癌[1-2]、喉癌[3-4]等肿瘤密切相关，但在这些研究中，C.pn感染被认为是一种促使肿瘤发生的危险因素，至于其在肿瘤发展和转移中的作用尚不清楚。而转移正是喉癌患者治疗失败和死亡的主要原因。但癌细胞转移是一个复杂而有序的多步骤、多环节、多因素参与的生物学过程。整个过程受多种因素的调控。其中，癌细胞的黏附和迁移能力是决定其侵袭性和转移性的关键因素之一[5-6]。C.pn感染可促进单核细胞、中性粒细胞[7-8]等细胞迁移。但是，C.pn感染对人喉癌细胞系（human epidermoid carcinoma-2，HEp-2）细胞黏附和迁移能力的影响，目前不甚明确。因此，本研究拟用C.pn感染HEp-2细胞，观察HEp-2细胞黏附和迁移能力的改变，探讨C.pn感染在HEp-2细胞黏附和迁移中的作用，为研究C.pn感染在喉癌转移中的作用奠定基础，为肿瘤的防治提供新思路。 材料与方法 1. 细胞株、菌种及主要试剂：HEp-2细胞购自协和医科大学细胞库，C.pn AR-39购自美国标准菌库（ATCC 53592），DMEM培养基购自北京天润善达生物科技有限公司，特级胎牛血清购自Hyclone公司，吖啶橙染料购自上海生工生物工程有限公司，Ⅰ型胶原购自Sigma公司，Transwell小室购自Coming公司。 2. 细胞培养：HEp-2细胞用DMEM培养基培养，含10% FBS、庆大霉素10μg/ml 及万古霉素25μg/ml。37ºC、5% CO2培养箱培养。 3. C.pn感染HEp-2细胞：参考相关文献[9]对C.pn进行增殖培养后，将C.pn悬液接种至90%融合的致密单层HEp-2细胞上，加入含10%FBS的DMEM培养基。25ºC、1 700 g离心50 min。37 ºC、5% CO2 条件下培养2 h。然后弃培养液，更换为衣原体生长液，置于 37ºC、5% CO2 恒温培养箱内培养72 h。 4. 吖啶橙荧光染色观察C.pn包涵体形态：C.pn感染HEp-2细胞72 h后，弃原培养液，用95%乙醇固定10 min后，PBS漂洗1次，然后加入1 μg/ml的吖啶橙荧光染料，染色3 min，再用PBS漂洗1次，荧光显微镜下观察HEp-2细胞内的C.pn包涵体形态。 5. 透射电镜观察C.pn包涵体超微结构：C.pn感染HEp-2细胞72 h后，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，然后用10%FBS的DMEM培养基重悬细胞，600 g离心10min，弃上清。细胞沉淀用2.5%戊二醛固定，4ºC过夜。然后拨离细胞团块，PBS漂洗3次，用l%四氧化锇后固定l h后，分别用50%、75%、90%和无水乙醇梯度脱水。环氧树脂包埋、固化和修块后，制备半薄切片。醋酸铀和柠檬酸铅染色后，透射电镜观察HEp-2细胞内的C.pn包涵体超微结构。 6. 细胞黏附实验：接种至24孔板的HEp-2细胞生长至90%融合时，用含1%FBS的DMEM同步化处理12 h，弃培养液，D-hank’s 清洗2次。将感染复数（multiplicity of infection, MOI）为0和1的C.pn感染HEp-2细胞，37ºC、5%CO2 培养箱孵育2 h。然后以0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，用含0.1% BSA的DMEM培养基重悬细胞，调整细胞浓度为6×104 个/ml，分别接种到已用Ⅰ型胶原包被的96孔板内，每组设4个复孔。37ºC、5%CO2 培养箱孵育1 h。弃培养液，每孔加入50 μl 0.5 mg/ml MTT，37ºC培养4 h。弃上清，每孔加DMSO 100 μl并振荡10 min，在波长为 570 nm 处测定每孔吸光度（A）值，测定细胞黏附能力。计算细胞黏附率=感染组A值/对照组A值×100%。 7. 创伤修复实验： HEp-2细胞接种至24孔板内，达到 90%融合后行同步化处理12h，弃培养液，D-hank’s清洗2次。将MOI为0和1的C.pn感染HEp-2细胞，37ºC、5%CO2培养箱孵育2 h。用无菌的移液管尖在各组孔内行直线划痕，造成“伤口”，用D-hank’s小心清洗脱落的细胞， 37ºC、5%CO2 培养箱培养24 h。应用软件（Image-ProPlus，version 4.5.1）测量HEp-2细胞迁移距离。 8. Transwell实验： HEp-2细胞同步化处理12 h后，用MOI为0和1的C.pn感染HEp-2细胞，37ºC、5%CO2 培养箱孵育2 h。之后以0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，用DMEM培养基重悬细胞，调整细胞浓度为2×106个/ml。然后向Transwell下室中加入0.6 ml含20% FBS的DMEM培养基，上室加入细胞悬液100μl，常规孵育12h。室温下甲醇固定10 min，Giemsa染色15 min，显微镜下每孔随机选取5个视野，计算平均穿膜细胞数。 9. 统计学方法： 实验数据采用统计学软件SPSS11.5进行分析，结果数据以±s表示，组间差异采用t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。 结  果 1. C.pn成功感染HEp-2细胞 在倒置相差显微镜下，正常HEp-2细胞呈梭形，胞浆丰富，折光性强（见图 1a）；C.pn感染HEp-2细胞后，细胞肿胀，折光性差，随着感染时间延长细胞脱落逐渐增多。细胞内出现空泡，即包涵体，如箭头所示（见图 1b）；感染72 h后，包涵体几乎占据整个胞浆，在一个细胞内可观察到多个包涵体（见图1b）。吖啶橙染色后，在荧光显微镜下可观察到，C.pn感染HEp-2细胞72 h后，细胞核与核仁清晰可见，胞浆内充满葡萄状包涵体，成团成簇，呈黄绿色（见图 1c）。为进一步观察C.pn包涵体的形态特征，我们应用透射电镜观察了C.pn感染HEp-2细胞72 h后的包涵体超微结构（见图1d）：包涵体体积较大，细胞核因被挤压而变形。包涵体内成熟的原体（elementary body，EB，见图1d实线箭头所示）明显增多，其特征是梨形的高电子密度物质（深黑色）被一多形细胞膜包绕，之间的低电子密度物质（灰白色）是壁膜间隙；网状体（reticulate body，RB，见图1d虚线箭头所示）则较少，特点是圆形的低电子密度物质被细胞膜包绕，壁膜间隙不明显。 2. C.pn感染增强HEp-2细胞的黏附能力 用MOI为0和1的C.pn感染HEp-2细胞2h后，细胞黏附于Ⅰ型胶原的能力明显增强。C.pn感染组黏附细胞的A值为0.669±0.011，明显高于对照组的0.558±0.005，其差异有统计学意义（P<0.001），计算C.pn感染组的细胞粘率为119.89%（见表1及图2）。 3. C.pn感染促进HEp-2细胞迁移 在创伤修复实验中，显微镜下可见HEp-2细胞从划痕边缘向中央移动；HEp-2细胞被C.pn感染后24 h，细胞向中央迁移的距离明显长于对照组（P<0.05）（见图3a、3b、3c和3d）。为进一步证实C.pn感染在HEp-2细胞迁移中的作用，我们又进行了Transwell实验。结果显示，C.pn感染HEp-2细胞12 h后，C.pn感染组的细胞迁移数目明显多于对照组（P<0.001）（见图4、表2和图5）。 讨  论 C.pn是一种严格细胞内寄生的原核细胞型微生物，作为呼吸道病原体感染人类。C.pn感染在人群中非常普遍，其以两种状态存在。一是可在细胞外存活和传播，具有感染性但无增殖能力的EB；另一是在细胞内以二分裂方式增殖，具有代谢活性但无感染性的RB。EB可被易感细胞吞入胞浆并分化为具有代谢活性的RB。RB经 48~72h 后又分化为EB形态，从感染的细胞内释放出来，从而进入另一个感染周期[9-10]。本研究用C.pn成功感染HEp-2细胞，C.pn在HEp-2细胞中可形成多个包涵体，吖啶橙染色显示包涵体呈黄绿色葡萄串状。透射电镜观察到包涵体的超微结构特点，印证了吖啶橙染色的结果。这与Wolf等在研究中，通过透射电镜所观察到C.pn包涵体的特点相一致[11]。 C.pn感染导致肿瘤发生的机制可能有两方面：一是C.pn在人体内的长期慢性感染可能通过促进炎症细胞释放炎症介质、NO和自由基等损伤细胞基因，诱导细胞发生恶性转化[12]；二是C.pn可能与其它危险因素一起对肿瘤的发生起协同作用[13]。但C.pn感染在肿瘤侵袭和转移中的作用并不清楚。肿瘤细胞的高侵袭性和转移性与其高黏附性和运动性密切相关。研究表明，C.pn感染单核细胞或巨噬细胞后，可促进这些细胞黏附于内皮细胞[14]；同时，内皮细胞被C.pn感染后，E-选择素、细胞间黏附分子-1、血管细胞黏附分子-1等黏附分子的表达均上调，也可促使单核细胞和中性粒细胞黏附于内皮细胞[15-16]。3本研究发现，HEp-2细胞被C.pn感染后，其黏附于Ⅰ型胶原的能力明显增强。Ⅰ型胶原是细胞外基质成分之一，肿瘤细胞黏附于细胞外基质，是肿瘤细胞脱离原发灶向远处转移的起始步骤[17]。因此，C.pn感染可能通过增强HEp-2细胞黏附于细胞外基质的能力，从而促进癌细胞向远处转移。 C.pn感染与细胞迁移关系密切。C.pn可刺激血管平滑肌细胞分泌单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1），而后者可促进单核细胞迁移[18]。C.pn感染内皮细胞后，刺激内皮细胞分泌白介素-8和MCP-1，从而促进单核细胞和中性粒细胞跨内皮迁移[8]。本研究结果显示，C.pn感染可促进HEp-2细胞迁移。另有研究发现，C.pn感染可诱导热休克蛋白60的产生，进而促进上皮细胞迁移和感染的肿瘤细胞的侵袭和转移[18-19]。这提示C.pn感染可能通过热休克蛋白60促进HEp-2细胞迁移，而后诱导癌细胞转移。此外，细胞迁移还与细胞的黏附性密切相关[20-21]。本实验中，我们发现C.pn感染能促进HEp-2细胞黏附于Ⅰ型胶原。因此，C.pn感染还可能通过增强HEp-2细胞黏附能力而促进其迁移，从而诱导癌细胞转移。 本研究用C.pn成功感染HEp-2细胞，观察了细胞内C.pn包涵体的形态特点，发现C.pn感染可促进HEp-2细胞的黏附和迁移，为进一步阐明C.pn感染在肿瘤侵袭和转移中的作用及机制奠定基础。 参 考 文 献 [1] Littman AJ, White E, Jackson LA, et al. 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