血府逐瘀胶囊调控EphB4EphrinB2促血管新生作用研究（可编辑）

血府逐瘀胶囊调控EphB4EphrinB2促血管新生作用研究（可编辑） 论文质量承诺书 本人承诺:所交的学位论文均按答辩专家意见进行认真修改,文字和 图 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 均无错误,内容真实可靠,并经导师审核确认,最后定稿、装订成册, 论文书写和格式均按新修订的《福建中医药大学关于研究生学位论文格式 的规定》要求。本人愿意对论文的质量负责,且文责自负。 学号:加/?/ 承诺人签字:绷孕秘衷 /琴年月日 导师承诺:本人已认真审核研究生的学位论文,该论文是在导师指导 下由研究生完成,并已按答辩专家意见进行修改,文字和图表均无错误, 内容真实可靠,论文书写和格式均按新修订的《福建中医药大学关于研究 生学位论文格式的规定》要求。本人承诺研究生所交的论文为最后定稿论 文,并对论文质量负责。 导师签字: 孚盯 日 驰净嘲剿 学位论文原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下进行的研究工作及所取 得的研究成果。据我所知,除文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不含任何其他 个人或集体已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得福建中医药大学或其他教育 机构的学位或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在 文中以明确方式标明并表示谢意。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 签字日期:房年碉?。日 学位论文作者签名:』函站红鞋 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解福建中医药大学有关保留和使用学位论文的规定,即:研 究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属福建中医药大学。学校有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许学位论文被查阅和借阅。本人授 权福建中医药大学可以公布学位论文的全部或部分内容,并编入有关数据库进行检索, 可以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文保密的学位论文在解密 后遵守此规定。 、本学位论文属于必须在以下相应方框内打“护,否则一律按“非保密论文处理: 保密论文:口本学位论文属于保密,在??年解密后适用本授权书。 公开论文:洄本学位论文不属于保密范围,适用本授权书。 、是否同意授权以下单位必须在相应方框内打“护,否则一律按“同意授权,,处理: 、叼同意授权 口不同意授权 清华大学“中国学术期刊光盘版电子杂志社”将本人学位论文进行电子和网络出 版,并编入系列数据库《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》和《中国知识 资源总库》。 、岫同意授权 口不同意授权 中国科学技术信息研究所将本人学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》,并 进行信息服务,同时本人保留在其他媒体发表论文的权利。 本人签名: 签字日期: 弓年,‘日 弛盈廛亟 签字日期. 导师签名:?』逶型荨 ;年月夕口日 目 录 中英文缩略词表?..? 中文摘要?一?一??.? ?、‘? 丽看? 实验材料?.. 实验方法?..? 结果一??.. 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 与讨论?...?. 结论... 村录? 参考文献? 致谢? 文献综述??..??.?. 作者简历?...中英文缩略词表 中文名称 英文缩写 英文全称 血府逐瘀胶囊 磷酸生理盐水缓冲液 四甲基偶氮唑蓝 ’光密度 二甲基亚砜 胎牛血清 血府逐瘀胶囊含药血清 . 经皮冠状动脉成形术 ,,’,四甲基乙二胺 匣 ,,’,’一 血管内皮生长因子 中文摘要 目的 通过比较不同药物浓度和时间作用条件下,血府逐瘀胶囊对人微血管内皮细胞 .参与血管新生的功能影响,从细胞水平验证血府逐瘀胶囊促血管新生的作用, 同时选择药物促血管新生的最佳浓度及作用时间点,在此基础上分析血府逐瘀胶囊对 /表达的影响,为下一步阐明血府逐瘀胶囊调控/双向通 路促血管适度生长的作用机制奠定前期工作基础,也为血府逐瘀胶囊的临床应用提供现 代的科学理论依据。 ’ 方法 将常规培养的人微血管内皮细胞.随机分为空白血清对照组和含药血清 干预组,人血清含量为’.%、.%、%,诱导处理时间为、、。利用 比色法和流式细胞周期测定法、迁移小室、黏附能力测定实验和体外成血管实 验分别观察各组血清对.的增.殖能力、迁移能力、黏附能力和体外成血管能力的 影响。利用实时定量和免疫印迹技术对和的表达进行检测。 结果 、对细胞活性的影响方面,在三个作用时间点,三个浓度的血府逐瘀胶囊含药血 清组与同等血清含量的空白血清组比较,值均无差异。 、对细胞增殖的影响方面,在三个作用时间点,三个浓度的血府逐瘀胶囊含药血 清组与同等血清含量的空白血清组比较,期细胞比例均无差异。 ? 、对细胞迁移的影响方面,与同等血清量的空白对照组相比,.%浓度的含药血 清组,在个作用时间点上,细胞迁移数均明显增加;.%浓度的含药血清组,在 作用时间点上,细胞迁移数明显减少,在、作用时间点上,细胞迁 移数均明显增 加;%浓度的含药血清组,在作用时间点上,细胞迁移数均明显增加,在、 作用时间点上,细胞迁移数均明显减少。 、对细胞黏附的影响方面,与同等血清量的空白对照组相比,.%浓度含药血清 组在前个作用时间点细胞黏附数无差异,仅在时细胞黏附数明显减少;.%浓度含 药血清组在前个作用时间点细胞黏附数均显著增加,在时无差异:%含药血清组 细胞黏附数在时明显减少,至时增加,时无差异。 、对促血管管腔形成方面,与同等血清含量空白对照组比较, .%含药血清组 的血管管腔数在个作用时间点上均无差异;.%含药血清组的血管一?控数只有在 时显著增加,在其它个时间点上无差异;在时%含药血清组眦’管腔数无差异, 在、时间点上均显著减少。 、与.%空白血清组比较,.%含药血清诱导细胞、对基因表达量均 没有影响,在诱导后,基因的表达上调,随后在时,基因的表达量 明显下调。 、与.%空白血清组比较,.%含药血清诱导细胞、、、对 基因表达量均没有影响。 、与.%空白血清组比较,.%含药血清诱导细胞、时,对蛋白 表达无影响,在作用时间点使蛋白表达显著上调。 结论 、血府逐瘀胶囊具有显著的促血管新生作用,其促血管新生作用存在最佳药物作 用时间点和最适宜浓度。药物作用机制与其促细胞迁移、黏附和体外成血管等环节相关。 、血府逐瘀胶囊低浓度促进、高浓度抑制的双向调控作用和短暂性的促血管新生 功效可以调控血管适度生长。 、血府逐瘀胶囊调控血管生长与其调控/的表达密切相关。 关键词:血府逐瘀胶囊,血管新生,, 本课题经费来源:国家自然基金“血府逐瘀汤调控/双向通路促血管适 度生长的作用机制研究,项目编号一. , / .., . ? %? ., .%,.% ,, , ,,,.?. . ’ . . ’ 一. ..%? .% ;?,. %? . , .%?..%?, , % , . .% % , . ..? .%?.. , ? .%? ’ .. ..%? .. ; . .% . 。 . , .. . .. :,,, 血府逐瘀胶囊调控/促血管新生的作用研究 .?一 月茜 进入世纪以来,缺血性疾病已成为危害人类健康的重大疾病之一,血管原发性 病变、外伤导致血管离断、炎症引发血管闭塞等均可导致人体组织和器官血液循环障碍, 引起缺血性病变,如局部萎缩、梗塞、坏死、伤口愈合不良等,甚至严重威胁人类生命。 “治疗性血管新生”】的提出则为治疗缺血性疾病指明了一条新出路。血管新生是指血 管内皮细胞增殖、迁移、芽生、分裂及分支形成新的毛细血管网的过程,促进血管新生 将为原本缺血的组织、器官提供新的血管,改善缺血区血流供应,防止细胞坏死,预防 或缓解缺血性病变。具有显著的促血管新生作用,被证实对缺血性疾病具有确切 疗效【】,但随后研究发现其存在严重的副作用,甚至可诱发肿瘤的形成和转移【】。近年, 在中医药促血管新生领域血府逐於汤研究显示出有别于西药的独特优势。 血府逐瘀汤出自清代名医王清任的《医林改错》方叙方,是其活 血化瘀五大名方之 一,该方各药物之间配伍严谨,方中用桃红四物汤活血化瘀而养血,可防单纯化瘀而伤 正,合用四逆散可疏肝理气,达到气行则血行的目的,加用桔梗引药上行达于胸,再加 牛膝则引瘀血下行而通利血脉。诸药合用,不仅可行血分瘀滞,还能够解气分郁结,活 血而不耗血,祛瘀又能生新,主治“胸中血府血瘀之证”。该方现已被广泛用于临床上 治疗缺血性心脑血管病证,如冠心病心绞痛、心肌梗死、短暂性脑缺血发作、脑梗死等, 不但疗效显著,而且副作用小,还未有其诱发肿瘤以及其他血管源性疾病的报道。现代 研究证明,血府逐瘀汤具有良好的改善血液流变性和微循环的作用,不仅能够扩张血管 从而增加缺血器官和组织的血流量,还具有降血脂和抗动脉粥样硬化以及抗心肌缺血损 伤等作用 。已经有一系列基础研究表明血府逐瘀汤具有显著的促血管新生作用【】, 而且其促血管新生作用呈倒型药效曲线,具有一个较适宜的浓度和时间点【,。这些 实验结果表明血府逐瘀汤对血管生长的适度调控作用。研究还发 现,血府逐瘀汤在倒 型药效曲线的两端,对血管生长无显著影响的和均上调了的表达【】, 提示的表达有可能是药物控制血管适度生长的关键因素。目前,国内外关于 促血管新生领域的研究比较明确的主要为及其受体,大量的 研究结果表明/在血管新生过程中具有重要的作用。.等人于首次发现肝癌跨膜蛋白激酶 ,,即现在的,它属于酪氨酸激酶受体家族中最大的亚族受体, 其特异性配体为”】,两者均属于膜结合蛋白。有别于其他酪氨酸激酶受体,它 们在自身活化和信号转导方面表现出独特的方式,主要包括两个方面。一方面,受体的 激活依赖于表达配、受体细胞间的相互接触;另一方面,和之间的信 福建中医药大学硕士学位论文 号转导途径是双向的,在信号转导过程中二者均可被对方激活,产生“正向信号”和?。反 向信号”。以为配体激活,引起受体自身磷酸化,进而激活下游.、 、等 ’不同途径的信号转导级联反应,此为正向信号,符合对经典信 号转导途径的认识。相反的,以为配体结合后,快速募集 到附近,将酪氨酸残基磷酸化【】,然后与接头蛋白 的结构域相结合激活下游信号通路【】,此信号为反向信号。 各种研究表明,/在动物胚胎血管形成过程中起着重要的作用。 和/或缺失会导致动物胚胎动静脉分化异常【】,抑制卵黄囊血管重塑 阻,同时影响新生血管的渗透性和完整性【,。另外,由于/之间独 特的双向信号转导功能,大量的研究表明,/的双向信号对血管新生过程 具有双向调节作用。等经过黏附、迁移、体外成血管等一系列系统的检测研究发 现,内皮细胞添加.后激活的正向信号可产生抗内皮细胞黏附、迁移和抗血 管出芽等抑制血管新生的作用;而内皮细胞添加.后激活的反向信号产生促内 皮细胞黏附、迁移和促血管出芽等促进血管新生的作用【。。/这种对血 管新生的双向调控作用正好与血府逐瘀汤促血管新生作用可以控制在一定范围内的特 点相符合,提示/可能参与血府逐瘀汤促血管新生的过程。 血府逐瘀胶囊调控/促血管新生的作用研究 实验材料 实验材料与仪器 .实验材料 中科院药物所丁健院士惠赠 人微血管内皮细胞. 血府逐瘀胶囊 天津宏仁堂药业有限公司 细胞培养板 公司 细胞培养瓶 公司 细胞培养皿 公司 冻存管 公司 离心管 公司 小室 公司 管 公司 /管 公司 头 公司 移液器 大龙兴创实验仪器北京有限公司 针式过滤器 公司 流式细胞管 , 上海精宏公司 血球计数板 美国公司 程序降温盒 .实验仪器及设备 超净工作台 苏州净化设备有限公司 二氧化碳恒温培养箱 公司 酶标仪 ? 美国宝特 数显电子恒温水浴锅 .国华电器有限公司 台式离心机 ,.上海安亭科学仪器厂 电热恒温鼓风干燥箱 一上海精宏实验设备有限公司 一德国赛多利斯股份公司 计 分析天平 奥豪斯仪器有限公司 液氮灌 . ? 超低温冰箱 ..公司 高压蒸汽灭菌器 一日本三洋电器集团 制冰机 ?日本三洋电器集团 实验室级超纯水器 .公司 倒置荧光显微镜系统 公司 福建中医药大学硕士学位论文 数控超声波清洗器 .昆山市超声仪器有限公司 流式细胞仪 美国公司 实时定量检测仪 美国公司 电泳仪 美国.公司 电泳槽 ? 美国.公司 凝胶成像分析系统美国.公司 .主要试剂 公司 .细胞培养基 公司 胎牛血清 公司 表皮细胞生长因子 公司 氢化可的松 生工生物工程有限公司 碳酸氢钠 公司 .%胰蛋白酶 公司 溶液 公司 公司 结晶紫细胞群落染色试剂盒 上海捷美基因公司 ? 公司 , 水 公司 异丙醇 国药集团化学试剂有限公司 无水乙醇 国药集团化学试剂有限公司 正丁醇 国药集团化学试剂有限公司 逆转录试剂盒 公司 . 试剂盒 公司 裂解液强 碧云天公司 .凝胶配置试剂盒 碧云天公司 .电泳液 碧云天公司 转膜液 碧云天公司 蛋白上样缓冲液 碧云天公司 蛋白浓度测定试剂盒 碧云天公司 血府逐瘀胶囊调控/促血管新生的作用研究 抗体稀释液 碧云天公司 兔抗人抗体 美国公司 兔抗人伊抗体 公司 膜 碧云天公司 化学发光试剂盒 碧云天公司 辣跟过氧化物酶标记羊抗兔二抗 碧云天公司 甲醇 国药集团化学试剂有限公司 乙酸 国药集团化学试剂有限公司 丽春红染液 碧云天公司 牛血清白蛋白 索来宝公司 缓冲液?缓冲赫溶液 索来宝公司 脱脂奶粉 索来宝公司 。 福州鼎国生物 福建中医药大学硕士学位论文 实验方法 含药血清的制备 将健康成年男性自愿者人,随机分为空白组和药物组,每组各人,空白组成员 不做任何处理,药物组每人每天给予正常服用剂量倍的血府逐瘀胶囊,连续服用天, 在末次给药后人左臂静脉采血,静置,离心分离制备空白血清和含药 血清, 水浴灭活补体,过滤分装,置于.冰箱冻存备用。 细胞的培养 .培养基的配制 将. 一干粉培养基和.碳酸氢钠完全溶解于超纯水中,调 整值到...,放置过夜,第天过滤除菌、分装,此为培养基原液。于培养 基原液中加入%的胎牛血清、 / 、/氢化可的松,制成完全培养基, 用于.的常规培养;于.培养基中加入%的胎牛血清制成实验用培养 基。培养基配置完成后置于冰箱保存。 .细胞的常规培养 ..细胞复苏:将冻存的.细胞株从液氮或.冰箱中取出后迅速放到 ?水浴锅中快速融化。将彻底融化后的冻存液吸至离心管中,再加入的 一完全培养基,室温离心,弃上清,用完全培养基重悬细胞, 移入直径细胞培养皿中,并轻轻摇晃培养皿使细胞分布均匀,放于。、% 培养箱中,次日换液。复苏后的细胞需连续传代次后方可用于实验。 。。细胞换液和传代:当培养皿中的培养基由紫红色变成橘黄色时需要换液,弃 去原培养液,用清洗次,加入新的培养基,放回培养箱继续培养。当细胞生长融 合至约?%底面积时可进行传代,弃去培养液,用清洗次,加入、.% 胰蛋白酶消化,当细胞变圆、体积回缩,细胞间隙变大时终止消化,弃去胰酶, 加入培养基并吹打细胞制成单细胞悬液,计数细胞,按照所需密度接种培养。可取生长 状态良好、处于对数生长期的细胞进行冻存或实验。 ..细胞冻存:取对数生长期的细胞,弃去原培养液,用清洗次,加入.% 胰蛋白酶消化,去胰酶,加入培养基吹打成单细胞悬液,室温离。, 去上清,缓慢加入.冻存液、胎牛血清和一培养基按体积比:: 配置而成,轻轻吹打混匀,吸至冻存管中,放入程序降温盒于.?冰箱中过夜后 取出,可在.?保存个月或液氮中长期保存。 血府逐瘀胶囊调控/促血管新生的作用研究 细胞的接种 ..细胞收集和计数:取对数生长期的细胞,弃去培养液,用清洗次,加 入.%胰蛋白酶消化后终止消化,去胰酶,加入完全培养基并吹打收集细胞制 成单细胞悬液,经血球计数板计数细胞量。 .。细胞接种量:按下列条件进行接种,接种后置于、%培养箱中培养。 ?孔板按每孔×个的细胞密度接种,每孔培养基体积为肛。 ?直径培养皿按每个皿 个的细胞密度接种,每个皿培养基体积。 ?孔培养板按每孔×个的细胞密度接种,每孔培养基体积。 .细胞的同步化处理 细胞周期检测和 实验需待细胞生长融合约一%,其余实验待细胞 完全贴壁后约.,即可吸去培养液,加入不含胎牛血清的.培养基原液, 继续培养,饥饿细胞使细胞处于同一生长周期。 .细胞的分组和给药 ..细胞分组:将经同步化处理后的细胞,随机分为以下组: ?.%空白血清组; ?.%含药血清组; ?.%空白血清组; ?.%含药血清组; ?%空白血清组; ?%含药血清组。 ..给药处理:在实验用培养基中按各组相应体积分数加入人空白血清和人含药 血清配置好各浓度空白血清培养基和含药血清培养基,孔板按/孔,孔板按 /孔,培养皿按/将配置好的培养基加入各组各孔/,于、%培 养箱中继续培养。 细胞活性测定法 取对数生长期细胞接种于孔板,经同步化、分组、给药,各组细胞培养、、 后,每孔加入、/浓度的溶液溶液配制,过滤除菌,置于 ,快速振荡分钟, 培养箱孵育小时后,小心吸去孔内液体,每孔加弘 待蓝紫色结晶充分融解后,选择为主波长,为参比波长,在酶标仪上测 定各孔的光吸收值值。每组设个复孔,实验重复次。 细胞周期测定 取对数生长期细胞接种于直径培养皿,经同步化、分组、给药,各组细胞培试剂盒说明书操作:弃去培养 养、’、后,按 福建中医药大学硕士学位论文 液,用清洗次,加入.%胰蛋白酶消化,去胰酶,加入实验用培养基 吹 打收集细胞; 室温离心,去上清,洗次,留约“的,再 加入 的 吹打、重悬细胞, ,重复次。用 室温离心 ,去上 将各组细胞密度稀释至.×个/, 室温离心 ,轻轻混匀,室温孵育 清。每份样品加肛的 ,加入 ,轻轻混匀,室温孵育 ~?,轻轻混匀,于 ,再加入 ?避光孵育 ,于冰上避光保存待上机检测。用流式细胞仪检测, 利用 软件获取数据,分析。实验重复次。 细胞迁移实验 小室 取对数生长期细胞接种于孔板,经同步化、分组、给药,各组细胞 培养、、 后,按下列步骤进行实验: 取小室,于下室孔中加入含%胎牛血清的.培 养基,再插入上层嵌套小室,放入恒温二氧化碳培养箱中平衡小 时。 各组细胞弃去培养液,用清洗次,加入.%胰蛋白酶消化,去 胰酶,沿孔壁加入实验用培养基终止消化,小心吸去实验用培基,每孔再加入无 胎牛血清培养基原液吹打收集细胞制成单细胞悬液,计数各组细胞量,将各组细胞密度 稀释至个/,并吹打均匀。 取出平衡后的小室,于各组嵌套小室中按/室分别加入已稀释 。 好的细胞悬液,置于?、%培养箱中培养 从培养箱中取出小室,终止迁移,将嵌套小室聚碳酸酯膜上室面的 细胞用棉花棒小心擦除,保留膜下室面的细胞,再按结晶紫细胞群落染色试剂盒说明书 的步骤将细胞进行固定染色,于倍倒置显微镜随机取个视野拍照,计数迁移到膜 下的细胞数。每组设个小室,实验重复次。 细胞黏附实验 取对数生长期细胞接种于孔板,经同步化、分组、给药,各组细胞培养、、 后,弃去培养液,清洗次,加入.%胰蛋白酶消化,去胰酶,加入实 验用培养基吹打收集细胞制成单细胞悬液计数各组细胞量,将各 组细胞密度稀释至× 个/,并吹打均匀,按每孔肛即个细胞/孔重新接种于孔板中,放 于培养箱中孵育后终止培养,吸去上清液及还未贴壁的细胞,洗次,按结晶 紫细胞群落染色试剂盒说明书的步骤将已贴壁的细胞进行固定染色,晾干后在倍倒 置显微镜下随机选取个视野拍照,计数黏附于孔板中的细胞。每组设个复孔, 实验重复次。 血府逐瘀胶囊调控/促血管新生的作用研究 体外成血管实验 取对数生长期细胞接种于孔板,经同步化、分组、给药,各组细胞培养、、 后,按下列步骤进行实验: 试剂盒说明书铺设基质胶:于 铺设基质胶:按 实验前一晚将.。冻存的基质胶置于冰箱解冻,将所需用品无菌孔板、无菌 头和管置于.进行预冷。实验当天将提前取出置于冰上解冻, 待其融化后与基质胶按:的比例进行配制,轻轻吹打混匀,不产生气泡,按刖孔 加入预冷的孔板中,轻轻水平晃动孔板使基质胶铺设均匀上述过 程均在冰上操 作,温度过高会使胶快速凝固,置于?、%培养箱中孵育。 体外成血管:各组细胞弃去培养液,清洗次,加入.%胰蛋白酶消 化,去胰酶,加入实验用培养基吹打收集细胞制成单细胞悬液计数各组细胞量, 将各组细胞密度稀释至×个/,并吹打均匀,按每孔重新接种于上述铺 有成血管基质胶的孔板中,置于培养箱中孵育后,即可观察到细胞出芽相 互连接形成的管腔样结构,在倍倒置显微镜下随机选取个视野拍照,计数管腔 形成数。每组设个复孔,实验重复次。 实时定量检测 取对数生长期细胞接种于孔板,经同步化、分组、给药,各组细胞培养、、 、后,弃去培养液,清洗次,每孔加入裂解细胞,提取总, 逆转录获得各组;实时定量采用 作为荧光染料,根据实时定量 试剂盒说明操作,使用美国公司 系统,检测各组、 和内参基因的值,实验数据分析采用法,和通过以下公式进 行计算:目的基因一内参基因;含药血清组一空白血清组。 基因表达量的倍数差异通过以?计算。所用引物均由公司设计合 成,经 验证引物序列见下表,程序:. : ;. : ?,?,个循环:. ,?, :?,? ? 。 福建中医药大学硕士学位论文检测 . 细胞的接种、同步化、分组和给药 取对数生长期细胞接种于直径培养皿,经同步化、分组、给药,各组细胞培 养、、后,按下列步骤进行实验: 提取细胞总蛋白:弃去培养液,洗次,吸净,加入./皿裂解 液,用细胞刮子将贴壁细胞尽可能多的刮下,移至.管中,冰上裂解, ?、离心,将离心后的上清液按刖管分装,于一?冻存备用。 蛋白浓度测定:按试剂盒说明书操作进行法测定各组蛋白浓度。 ?电泳:?灌胶:配置%分离胶,加入后立即摇匀灌入 已备好的制胶板中,胶上缓慢加入一层正丁醇压平胶面,等胶完全凝固后吸去正丁醇, 超纯水清洗后用滤纸吸干;配置%浓缩胶,加入后立即摇匀,将制胶板内的 剩余空间灌满,然后将梳子插入浓缩胶,待浓缩胶凝固后拔除梳 子。?电泳:将制备好 的胶体放入电泳槽中,将蛋白样品按体积比:加入×上样缓冲液至终浓度 为×,再于沸水中煮即可上样;浓缩胶以 电压电泳 ,待染料进入 , 分离胶后将电压调整为 ,直到染料抵达分离胶底部,终止电泳。 转膜:将凝胶、膜先在甲醇中放置?、滤纸一起放入转膜液 中平衡 ;转膜支架平放,负极向下,依次放置滤纸、凝胶、膜、滤纸,夹 紧各层置于转移槽中,接通电源,内参蛋白电压为,;目的蛋白 是,。电转结束后,用去离子水漂洗膜 ,用.%丽春红染色液染色,双蒸水漂洗脱色至可见蛋白条带,观察转膜效果。 免疫学检测:?封闭:用含%脱脂奶粉封闭液室温轻摇漂洗膜; ?加一抗:于杂交袋中,分别加入用抗体稀释液稀释后的一抗兔抗人多克 隆抗体:;兔抗人/多克隆抗体:,浸入封闭好的膜,于。摇 床摇晃过夜;?抗:取出膜,用一一与按体积比: 配置漂洗次,每次,然后加入:稀释的辣根过氧化物酶标己的二抗,室 血府逐瘀胶囊调控/促血管新生的作用研究 温孵育:?去除二抗:取出膜,用洗三次,每次。 化学发光,显影:将试剂盒中的两种显色液等体积混合液, 液/,覆盖全膜,?后,在成像仪上选择合适的曝光时间,进行成像, 最后分析蛋白条带灰度值。 数据处理 本课题所有实验数据以表示,实时定量检测数据分析采用法,以 计算药物组与对照组之间相对应基因的表达差异,或.差异为显 著 水平,其他项目实验数据两组间比较用检验,.表示差异有统计学 意义。福建中医药大学硕士学位论文 细胞活性法ב 组别 人血清含量 注:含药血清组与同等血清量的空白对照组比较,?.,??.。 如表所示:在、、三个时间点,.%、.%、%血府逐瘀胶囊含药 血清组与同等人血清含量的空白血清组比较,值均无差异,.。说 明实验条件 下,药物对细胞活性没有影响。 细胞周期检测流式结果 表药物对.细胞增殖情况的影响?, 细胞期比例% 组别 人血清含量.% .?. .?. .?. 含药血清组 .% .?. .?. .?. % .?. .? .?. .% .?. .?. 空白血清组 .?. .% .?. .?. .?. % .?. .?. .?. ??硅?爵面薄豇秉再面磊磊五甄丽面丽丙丽?巧丽?? 如表所示:在、、三个时间点,.%、.%、%血府逐瘀胶囊含药 血清组与同等人血清含量的空白血清组比较,期细胞所占比例均 无差异,.。说 明实验条件下,药物对细胞增殖没有影响。 细胞迁移能力检测结果 表药物对.细胞迁移能力的影响, 细胞迁移个数个 组别 人血清含量 .% ..?? .?.?? .?. ?? 含药血清组 .% .?.?? .?.?? .?.?? % .?.?? .?.?? .?.?? .% 空白血清组 .. .?. ,?. .% .?. .?. .?. % .?. .?. .. ?.,??.。 注:含药吡清组与同等血清量的空白对照组比较, 血府逐瘀胶囊调控/促血管新生的作用研究 如表所示:与同等人血清含量的空白血清组相比,.%浓度的含药血清在 个作用时间点上,均明显增加细胞迁移数,.,差异有统计学意义;.%浓度的含 药血清组,在作用时间点上,细胞迁移数明显减少,.,在、作用时 间点上,细胞迁移数均明显增加,.,差异有统计学意义;%浓度的含药血清组, 在作用时间点上,细胞迁移数均明显增加,.,在、作用时间点上, 细胞迁移数均明显减少,.,差异有统计学意义。说明药物在中等和低浓度条件下 促细胞迁移作用更为持久和显著,高浓度药物的促进作用虽然比中等浓度出现的更早, 但随着药物作用时间的延长,高浓度药物反而出现抑制细胞迁移的作用。 细胞黏附能力检测结果 表药物对.细胞黏附能力的影响’?, 组别 人血清含量 细胞絮誓价’ 含药血清组 空白血清组 .% .% %.% .% %.?. .?.?? ..?? .?. .?. .?. .?。?? .?. .?. .?. .?. .?. 如表所示,与同等人血清含量的空白血清组相比,.%浓度含药血清组在前个 作用时间点细胞黏附数无差异,.,仅在时细胞黏附数明显减少,.;.% 浓度含药血清组在前个作用时间点细胞黏附数均显著增加,.,差异有统计学意 义,在时无差异,.;,%含药血清组细胞黏附数在时明显减少,., 差异有统计学意 义,至时增加,.,时无差异.。说明在低浓度条件下 药物无促内皮细胞黏附作用,中浓度比高浓度含药血清促细胞黏附作用出现时间点更 早,效果更显著,持续时间更长,但随着诱导时间进一步延长,药物已无促细胞黏附作 用。 体外成血管能力检测结果 表药物对.细胞体外成血管作用的影响?, 注:含药血清组与同等血清量的空白对照组比较, ?.,??.。 ‖矿屹巧记 扭托虬蛆 抛觥至;四泓湖 妇福建中医药大学硕士学位论文 如表所示,与同等人血清含量的空白血清组比较,.%含药血清组的血管管腔 数在个作用时间点上均无差异,.;.%含药血清组的血管管腔数只有在时 显著增加,.,在其它个时间点上无差异,.;在时%含药血清组血 管管腔数无差异,.,在、时间点上均显著减少,.,差异有统计学意 义。说明.%含药血清对体外血管管腔形成没有影响,在.%浓度含药血清处理 条件下血府逐瘀胶囊促血管管腔形成的作用最显著,当浓度继续增加、作用时间延长, 促血管新生作用消失,甚至出现相反的作用,体现药物双向调控血管生长的作用。 根据以上几项实验结果显示,血府逐瘀胶囊含药血清在.%浓度诱导细胞的 条件下均有促进一迁移、黏附和成血管的作用,明显优于其他浓 度和作用时间点, 说明.%浓度含药血清诱导细胞为药物促血管新生的最佳条件。本实验的目的基 因和属于膜结合型受体和配体,处在信号通路的上游,从二者的改变 引发一系列信号通路到最终形成细胞相应的生理效应,需要一段较长的时间。因此,本 实验选择在最佳作用时间点之前分多个时段检测最佳药效浓度.%含药血清对 和基因表达的影响。 实时定量检测结果 表药物对基因表达情况的影响?.组别 值 .. .士. .士. , .%空白 内参值 血清组 蛀肚.士. .士. .士. 值 .士. .士. .士. .%含药 内参值 血清组 吐任 .. .士. .士. 值 .士. 。?? .士. ..?..? 图?药物对.细胞基因表达的影响 血府逐瘀胶囊调控/促血管新生的作用研究 如表和图?所示,与.%空白血清组比较,.%含药血清诱导细胞、 对基因表达量均没有影响,在诱导后,.基因的表达上调,, 随后在时,基因的表达量明显下调‘??‘.,差异显著。 表药物对基因表达情况的影响,: 组别 .士. .士. .圭. .士. .%空白 内参值 .士. .. .士. .士. 血清组 值 : .士. .士. . 士. .士. .%含药 内参值 血清组 .士. .士. .士. .士. 值 .士. .:. .士. ‘?? .士. 如表所示,与.%空白血清组比较,.%含药血清诱导细胞、、、 对基因表达量均没有影响,为了进一步确认药物对基因表达量是 否 有影响,本次实验还检测了、、、、、、、等时间点 基因表达量,结果均无影响数据未显示。检测结果 表药物对蛋白表达情况的影响. 组别 蛋白条带灰度值篆‘研/内刳 .:. .. .%空白血清组.士. .:.??.士. .%含药血清组..福建中医药大学硕士学位论文 图?药物对一细胞蛋白表达的影响 黼一???峨?燎内参 “““‘ ”~’一“???? 雠“嘲?麓嘲謦 . . . . 互 .照片一 检测蛋白表达的结果 注:.:.%空白血清组,.:.%含药血清组 根据 检测结果显示:与.%空白血清组比较,.%含药血清诱导细 胞和时,对蛋白表达均无影响,在作用时间点可使蛋 白表达显著上调.,差异有统计学意义。 血府逐瘀胶囊调控班促血管新生的作用研究 分析与讨论 虽然目前基于人脐静脉内皮细胞等大血管内皮细胞的血管新生研究已 取得重大进展,而且多数研究模型是建立在大血管内皮细胞基础上,但是人体的多种病 理生理过程却是发生在微血管内皮细胞水平。由于微血管内皮细胞与大血管内皮细胞在 形态、表型和功能上都存在一定的差异【,因此在微血管内皮细胞基础上研究血管新 生对阐明多种病理生理机制将更有意义。人类皮肤微血管内皮细胞株.是 .等人在年将编码猴病毒产物的一质粒转染正常人类微血管 内皮细胞,并传至代所获得的】,其具有原代微血管内皮细胞特有的分子表面标记、 良好的炎症反应性及较强的血管形成能力等内皮细胞所特有的重要特性【】。所以本课题 选用.建立细胞模型进行血府逐瘀胶囊促血管新生的研究是很有 必要的。同时, 本课题有别于以往实验采用中药煎剂制备含药血清,而是选用天津宏仁堂药业有限公司 生产的血府逐瘀胶囊作为实验用药,规格为每粒装.,口服一次粒,一日次,避 免不同批次中药质量差异和中药煎剂浓度的不稳定,既可以保证实验用药的质量,又便 于对实验药物进行质控。 一、 血府逐瘀汤的药理研究 血府逐瘀汤活血化瘀的药理研究 血府逐瘀汤出自清代名医王清任的《医林改错》方叙方,是其活血化瘀五大名方之 一,该方各药物之间配伍严谨,方中用桃红四物汤活血化瘀而养血,可防单纯化瘀而伤 正,合用四逆散可疏肝理气,达到气行则血行的目的,加用桔梗引药上行达于胸,再加 牛膝则引瘀血下行而通利血脉。诸药合用,不仅可行血分瘀滞,还能够解气分郁结,活 血而不耗血,祛瘀又能生新,主治“胸中血府血瘀之证”,现已被广泛运用于临床治疗 各种缺血性心脑血管疾病。 临床研究已经证实,血府逐瘀汤配合常规西药治疗能够更加有效 地治疗冠心病心绞 痛,减少,绞痛的发作频率和持续时间;还能够改善急性心肌梗死患者的各项指标,包 括、、、段改变等;提高患者术后生活质量,减轻术后再狭 窄程度以及降低再狭窄发生率;血府逐瘀汤对于脑梗塞后遗症:头晕、头痛、失眠等症 状,也有很好的疗效】。这些疗效可能与血府逐瘀汤具有良好的改善血液流变性和微 循环的作用,能够扩张血管增加缺血器官和组织血流量,还具有降血脂和抗动脉粥样硬 化等作用有关【】。 福建中医药大学硕士学位论文 血府逐瘀汤对血管新生的影响 .血府逐瘀汤具有促血管新生的作用 血管新生涉及到血管内皮细胞增殖、迁移、黏附以及形成血管管腔结构等一系列过 程。本课题前期研究已发现血府逐瘀汤能够促进鸡胚尿囊膜血管新生【,随后 多种在体、离体模型研究显示血府逐瘀汤在生理状态和缺血缺氧状态下均有显著的促血 管新生作用?,而且这种促进作用具有可调控性,可控制血管适度生长【】。其中, 内皮细胞模型反映,血府逐瘀汤能影响缸管新生过程的多个环节,显著增强内 皮细胞活性,增加期细胞数曰,诱导内皮细胞迁移、黏附和体外成血管,而且含药血清 的药效曲线和作用时间呈倒型,.%浓度含药血清促血管新生的作用明显优于.% 和%【】,作用时间点优于和。 原西苑医院著名老中医郭士魁先生常用倍量的血府逐瘀汤治疗重症或常规治疗不 能缓解的心绞痛患者,疗效显著,因此本实验选择用倍正常剂量的血府逐瘀胶囊制备 含药血清。实验综合分析了不同浓度.%、.%、%的血府逐瘀胶囊含药血清在 不同的作用时间点、、对一的细胞活性、增殖、迁移、黏附和体 外成血管等一系列血管新生环节的影响。本实验结果显示,虽然不同药物浓度对这各环 节的影响存在差异,如.%和%含药血清能够促进细胞迁移或黏附,但均没有促进 体外管腔形成的作用,只有.%浓度的含药血清对内皮细胞参与的这三个血管新生环 节均能产生促进作用。不仅如此,即使同一药物浓度在不同作用时间点对各环节的影响 也不一样,.%含药血清在干预的最初时,抑制细胞迁移,促进细胞黏附,但对细 胞体外成血管无影响;在时,仅能促细胞迁移,而对细胞黏附和管腔形成无影响; 只有在时,药物对细胞的迁移、黏附和体外成血管能力都有促进作用。这些结果表 明.%浓度含药血清诱导细胞为促血管新生的最佳作用条件,与本课题前期研究 结论一致【 】,再次验证血府逐瘀汤体外促血管新生的功效。 .血府逐瘀汤能有效调控血管生长 本研究体外成血管实验结果显示,只有.%浓度的含药血清在作用时间点具 有促进血管管腔形成的作用,随着作用时间进一步延长至,其促进作用消失,相同 条件下提高含药血清浓度至%并没有加强内皮细胞的体外成血管能力,反而出现相反 的抑制作用,表现出药物独特的低浓度促进,高浓度抑制的双向调控作用,且其低浓度 的促进作用呈现出短暂性。这与促血管新生的行为有异,本项目组的另一项研 究发现在细胞活性、增殖、迁移和成血管方面皆表现出持久的促进作用。 血府逐瘀汤不仅在体外实验中表现出短暂促血管生长的作用,在体实验同样表现出 类似的行为特点。课题前期通过大鼠下肢缺血模型实验研究发现引,血府逐瘀汤在缺血 血府逐瘀胶囊调控/促血管新生的作用研究 损伤早期能有效促进肉芽组织血管新生,但不促进缺血下肢肌肉组织血管生长,随着肉 芽组织纤维化,血管闭合退化,其促血管生长的功效消失。 一 上述离体和在体的实验结果提示血府逐瘀汤虽然具有促血管新生的作用,但其促血 管新生作用较短暂,提示血府逐瘀汤促血管新生存在一定的调控机制,相比较于 一味的促进作用,我们称此现象为血府逐瘀汤调控血管适度生长。 二、血府逐瘀胶囊对/表达的影响 血管新生与/的关系 是由等人于年首次在人类骨髓单核细胞和肝癌细胞 株中克隆出的一种跨膜酪氨酸激酶蛋白,其特异性配体于年被 发现【,不同于可溶性配体,也属于跨膜蛋白。除以外,还 可以和、等其他的类受体结合;但较其他配体而言,与的亲 和力最高。由于和均属于膜结合型蛋白,有别于其他酪氨酸激酶受体, 它们在自身活化和信号转导方面表现出独特的方式,主要包括两个方面。一方面,受体 的激活依赖于表达配、受体细胞间的相互接触;另一方面,和之间的 信号转导途径是双向的,在信号转导过程中二者均可被对方激活,产生“正向信号”和 “反向信号。作为配体激活,引起后者自身磷酸化,进而激活下游信 号转导级联反应【,,形成正向信号。相反的,作为配体结合后,将 酪氨酸残基磷酸化【】,然后激活下游信号通路【】,形成反向信号。 国外已有大量研究文献证实,/在动物胚胎血管形成过程中起着重 要的作用。和/或缺失会导致动物胚胎动静脉分化异常【】,抑制卵黄 囊血管重塑【埘】,同时影响新生血管的渗透性和完整性【】,甚至威胁胚胎的存活。另 外,由于/之间独特的双向信号转导功能,/的双向信号 显示出对血管新生过程的双向调节作用。等经过黏附、迁移、成血管等一系列系 统的检测研究发现,内皮细胞添加一后激活的正向信号可产生抗 内皮细胞黏 附、迁移和抗血管出芽等抑制血管新生的作用;而内皮细胞添加.后激活的反 向信号产生促内皮细胞黏附、迁移和促血管出芽等促进血管新生的作用【。 血府逐瘀胶囊调控血管生长与/密切相关 由于目的基因和属于膜结合型蛋白,处在信号通路的上游,从二 者的基因表达改变引发一系列信号通路到最终形成细胞相应的生理效应,需要一段较长 的时间。因此,本实验选择在成血管最佳作用时间点之前分多个时问点检测最佳药 福建中医药大学硕士学位论文 效浓度.%含药血清对和表达的影响。实时定量实验结果显示, :%血府逐瘀胶囊含药血清在诱导细胞后上调了基因的表达,当延长诱导 时间到,则下调基因的表达量,到时,药物对基因表达的影响已 经消失,提示药物作用初期通过上调基因的表达,促反向信号的生成进而推动 血管新生,随后下调基因表达,减少反向信号作用不再促血管生长。可见血府逐瘀胶囊 对基因表达的影响不是一般的持续上调或下调,而是在一定的时间点上调后, 再下调,最终影响作用消失使目的基因表达恢复正常水平。血府逐瘀胶囊这种适度调控 检 基因表达的作用恰好与其调控血管适度生长的功效相吻合。根据 测结果,药物诱导、后并不影响表达量,仅在作用时间点, 表达量显著增加。虽然,本次实时定量检测并未发现血府逐瘀胶囊能够调控 的基因表达,这也许是因为药物自身对这个基因的表达调控作用不明显,但 是在基因表达翻译成蛋白的过程中可能存在其他作用机制引起下游蛋白表达的变化。 综合血府逐瘀胶囊对和表达的影响结果提示:药物在诱导处理的早 期上调的表达,引发促血管新生的生理效应;随着诱导时间的延长 药物在下调表达同时上调其配体表达,产生负性作用控制血管适度生 长,随后二者的表达均恢复正常水平。这种药物调控和表达的时 间点与药物促血管生长最佳时间点不一致的现象,有可能是因为血府逐瘀汤可调控包括 、、和等在内的多个血管新生调控因子的表达,其促血管新生作 用呈现多途径、多靶点相互综合的复杂特点,,药物在早期短时间 内上调;勺 表达促发上游反向信号通路后,结合其他调控因子及信号通路的共同促进作用从而使药 物在出现最佳促血管新生效应,之后短暂下调减少反向信号的同时上调 促发正向信号,抵抗其他调控因子及信号通路的促进作用,控制血管适度生长。 本次实验可以从侧面进一步肯定和并不是唯一受药物影响的调控因子, 要完整认识血府逐瘀胶囊促血管适度生长的作用机制,除了需要进一步研究药物对 署蛋白磷酸化的影响,还需要更加全面地了解众多血管新生调控因子在 药物促血管新生功效中的调控模式。血府逐瘀胶囊调控/‘促血管新生的作用研究 结论 、血府逐瘀胶囊具有显著的促血管新生作用,其促血管新生作用存在最佳药物作 用时间点和最适宜浓度。药物作用机制与其促细胞迁移、黏附和体外成血管等环节相关。 、血府逐瘀胶囊低浓度促进、高浓度抑制的双向调控作用和短暂性的促血管新生 功效可以调控血管适度生长。 、血府逐瘀胶囊调控血管生长与其调控/的表达密切相关。 附录 ? 。。,。。’。”‘ :.‘。:霉。?:。.。。。,。。 卧。 , 『.:。‘。 。‘.:、’。.:;‘产,、.:, :?一羹,’ 。,。::、。 伊.々 ? ? 。。.,‖.,一’。。气一、。 气。一 】 叶 。。 、 。 。. ‘:.二::?:、。?、』:.:,气,鼍”‘:,。,、一. 。 ’ ?。’? ,. 々鼍 。 : 。. ,., 、,% ’ ?一。 。 ’? .?, 、 .. ? ’。。. : ? ? 。’ 々 ? ? ? ?”。 ? 。 ? 口 ? 一. 、. ,,? ??;罂些一 照片. .%空白血清组 照片 .%含药血清组 ‘??薯嚣。.’。? :。?。.。。 :?。 ’?: ?:????一受??,毒鼍 、、’。:?’?,。’、“:工二 照片? .%空白血清组 照片. .%含药血清组 照片. %空白血清组 照片 %含药血清组 照片.药物诱导细胞迁移数× ?虿。。。??一 。 ? ‘ ? ,? ?? 哺 , 。。,。 ’气。.。。。‘。 ‘’ ? ‘。 。:一。~ . % 。。~.二 。 ::‘; . 。‘::。:矿‘?。。。。’ 。,’。?二。,:: 』’:之??.。::: ,一; ‘’’。 。’,。。一 照片. .%空白血清组 照片 .%含药血清组 照片 .%空白血清组 照片 .%含药血清组 。??一,,写?一?????????。三 . . 。 ,。, ?彰。簿‖ ?舀 泌蹦“。。菇羹管.’?。鬻凄冀薯?慧矗 卜.。.妻?,。.爹雾“麓裁。一彰‘’毹 陵?譬。鬻?熬?? 。黪 。” 一 。。” ?霉一 零?‰。蠹彰;寥‖?“、 雾”。 ;。。‘ :《警 磐。熬。。毫 ? 一,蠢秘然秽辩”?鬻、馨崔。“‘’摩 隧鎏漫茎登蒸堂堂釜.:三羔.. 照片 %空白血清组 照片 %含药血清组 照片.药物诱导细胞迁移数× 福建中医药大学硕士学位论文 阿篡毒露??瑟?一夔,?二. 意 .》一譬 气 ~ :摹 。参 。。 。拳 囊‘ 国 一篓 ?徭:。强錾秘》警一。?搿酶? 。’毒蠹。雾.:?鬣‘ 第蓥。,,嘉?一,一 怒:箩羚 《’‖一。?诲‘‖ ,。 ’。篡 毫簿名%簪?.。‖。。 鲨』翌?:二...:翌鲎:: 主至垂虿 .一。.:.塑: 照片. .%空白血清组 照片. .%含药血清组 ~ 。‘。?。八 卜零文.霉了 曦,妻霉’ 弋噻 ”一 ..。,誊??奔。毫藏曩。一%,。 。..。:謦毒 ?蛩螽艇鼍一 卜?:?篡梦.:?.譬:, :., 艮耘 摩 。警’ 掌。妒警。。。 .》。?蛰 一。.塑二墼鳖::兰:篓:薹量 照片 .%空白血清组 照片 .%含药血清组 照片. %空白血清组 照片 %含药血清组 照片.药物诱导细胞迁移数× 血府逐瘀胶囊调控/促血管新生的作用研究 ‘鄯 一。?壤? 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