脂肪酶催化酯化拆分与水解拆分2-甲基丁酸及其酯

脂肪酶催化酯化拆分与水解拆分2-甲基丁酸及其酯 脂肪酶催化酯化拆分与水解拆分2-甲基丁 酸及其酯 第30卷第9期 ,,01.30N0.9 催化 ChineseJournalofCatalysis 2009年9月 September2009 文章编号:0253.9837(2009)09—0951-07 脂肪酶催化酯化拆分与水解拆分2.甲基丁酸及其酯 李小路,王栋,徐岩,耿亚维,陈聪,王楠 江南大学生物工程学院_T-业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122 研究论文:95l,957 摘要:2一甲基丁酸手性中心碳原子上的基团差异较小,是一种典型的酶法动力学拆分较为困难的风味化合物.本文分别在不同 体系中比较了几种商品化脂肪酶和华根霉脂肪酶(RCL)催化酯化和水解反应对2一甲基丁酸及其酯的拆分,结果表明,RCL不仅 在非水相中具有一定的选择性酯化能力,而且在水相中具有更强的选择性水解2.甲基丁酸乙酯的能力,在4O.c下优先水解(一 型底物,反应10h后()一2一甲基丁酸乙酯的ee值为92.4%.进一步考察了温度对RCL催化酯化拆分与水解拆分的影响,结果表明, 低温下反应的对映体选择性较高,在4.C下通过水解拆分获得的()一2.甲基丁'酸乙酯的ee值可提高至95.O%. 关键词:华根霉脂肪酶;选择性酯化;选择性水解;动力学拆分;2一甲基丁酸;2一甲基丁酸乙酯 中图分类号:o643/Q55文献标识码:A KineticResolutionof2-MethylbutyricAcidandItsEsterbyEsterification andHydrolysiswithLipases LIXiaolu,WANGDong,XUYan,GENGYawei,CHENCong,WANGNan KeyLaboratoryoflndustrialBiotechnologyoftheMinistryofEducation,Schoolofbiotechnology,JiangnanUniversity Wuxi214122,Jiangsu,China Abstract:Theresolutionof2-methylbutyricacid,oneofthetypicalflavorcompounds,isdifficultbytheenzymatickineticmethodbecause thestericdifferencesbetweenthemethylandethylgroupsattachedtoitschiralcarbonatomaretoosmalltoallowefficientstereochemical recognitionbyenzyme.ThecapacityofsomecommerciallipasesandalipasefromRhizopuschinensis(RCL)tocatalyzeenantioselective esterificationandenantioselectivehydrolysisof2-methylbutyricacidanditsesterindifferentsystemswasinvestigated.Theresultsshowed that,RCLnotonlyhadacertainesterificationenantioselectivityinnon— aqueousmediabutalsohadhigherhydrolysisenantioselectivityin aqueousphase.Theeevalueof92.4%of(R)一 ethyl2-methylbutyratewasobtainedafter10hhydrolysisreaction.Furthermore,theinfluence oftemperatureontheesterificationandhydrolysisresolutioncatalyzedbyRCLwasinvestigated.Ahigherenantioselectivitywasobtainedat 4.C,andtheeevalueof)一 ethyl2-methylbutyratefromhydrolysisresolutionwasincreasedto95.0%at4.C. Keywords:Rhizopuschinensis;enantioselectiveesterification;enantioselectivehydrolysis;kineticresolution;2-methylbu哆fieacid;ethyl 2-methylbubrrate 2.甲基丁酸及其短链酯是典型的具有苹果,草 莓和菠萝味的重要风味物质,它们由于存在手性中 心因而具有(.和)一构型两种对映体,分别对应 不同的风味及应用[1-3].此外,高光学纯度的2.甲基 烷酸还可以作为价值颇高的合成中间体用于生物信 息素等许多光学纯化合物的合成.因此它们的拆分 引起了人们广泛的兴趣【4】. 脂肪酶催化的动力学拆分相对于其他拆分方法 具有规模易放大,环境友好和产品满足"绿色",安全 等食品级要求的优点,因此常被用于许多手性风味 物质的拆分【2】.但是,由于2.甲基丁酸及其短链酯 中连接于手性中心碳原子上的甲基与乙基的空间差 异很小,以至于酶法拆分时脂肪酶不能有效地进行 立体化学的识别[51,从而导致反应的对映体选择性 收稿日期:200903—04. 联系人:徐岩.Tel/Fax:(0510)85864112;E—mail:yxu@jiangnan.edu.cn 基金来源:国家高科技发展计划(863计划,2007AA100401);江苏省自然科学基金 (BK2007020);生物反应器工程国家重点实验室开放 课 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 . 952催化第30卷 下降,无论是产物或底物,均无法得到较高的对映体 过量值(ee值)".因此,2.甲基丁酸及其酯的脂肪 酶动力学拆分成为酶法动力学拆分中较为困难的一 类反应. 脂肪酶既可以催化非水相中的酯化反应[, 也可以催化水相中的酯水解反应[刚.由于2一甲基丁 酸以及其他疏水性脂肪酸在有机相中进行酯化反应 具有天然优势,而且在有机相中脂肪酶的结构刚性 不容易改变,因此,关于2.甲基丁酸的拆分报道大多 采用此法_6稍].但是,许多脂肪酶在有机相中催化酯 化反应的能力不强,即使少数脂肪酶酯化活性较强, 但反应效果也不理想,拆分产物的ee值一般不到 50%.如南极假丝酵母(Candidaantarctica1脂肪酶 B酯化拆分反应得到的(63—2一甲基丁酸的ee值仅为 4%[,Kwon等[】筛选不同的脂肪酶在有机相中酯化 拆分2.甲基丁酸,其中效果最好的爪哇曲霉sper— gillus/avanicus)脂肪酶(FAP.15)催化反应产物的 ee值仅为49.8%,经过优化后ee值也不超过70%, 其光学纯度还很难达到工业生产的要求.反应的对 映体选择性最高也只有5【6~11].比较而言,有关利用 脂肪酶水解拆分的报道却很少.虽然不同来源的脂 肪酶活性差异较大,但决定拆分效果的主要因素是 酶的选择性,酶的活性只影响反应速率及转化率,因 此,筛选得到具有较高光学立体选择性的脂肪酶是 实现2一甲基丁酸及其酯的有效拆分首先需要解决的 问题.此外,在影响脂肪酶选择性的诸多因素 中[17~26],温度被认为是最关键的一个变量】.温度 改变了酶在反应体系中的结构刚性,进而影响酶的 特异选择性[17,18].通过调节温度可提高酶的选择性. 由于文献报道中适用的脂肪酶种类有限,且多 限于酯化拆分(.构型的2.甲基丁酸及其酯,因此 本文选择了多种不同来源的脂肪酶,分别考察了它 们在有机相中的酯化拆分和水相中的水解拆分2一甲 基丁酸及其酯的能力,并探讨了温度对脂肪酶拆分 特异性的影响,为提高脂肪酶催化2.甲基丁酸及其 酯的动力学拆分水平提供依据. 1实验部分 1.1脂肪酶及试剂 华根霉(Rhizopuschinensis)脂肪酶(RCL)和洋 葱布克氏菌(Burkholderiacepacia)脂肪酶(BCL)的 制备见文献[27,28].(R,一2.甲基丁酸,(.2.甲基 丁酸乙酯和(.2.甲基丁酸等标准品为色谱纯均购 于Sigma公司.其它试剂均为分析纯,购于中国医 药集团上海公司.使用的9种商品化脂肪酶如下: 固定化的米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)脂肪酶 (LipozymeIM)及南极假丝酵母(Candidaantarctica) 脂肪酶(CAL,即Novozym435)购自NovoNordisk 公司;皱褶假丝酵母(Candidarugosa)脂肪酶(CRL) 和猪胰(porcinepancreas)脂肪酶(PPL)购自Sigma 公司;荧光假单胞菌(风euclomonesfluorescens)脂 肪酶(AK),青霉(Penicilliumcamemberti)脂肪酶 (G),洋葱假单胞菌(Pseudomonascepacia)脂肪酶 (PS),固定于硅藻土的洋葱假单胞菌fPseudomonas cepacia)脂肪酶(PS.D)和爪哇曲霉spergillus /avanicus)脂肪酶(FAP.15)购自AmanoPharmaceu. tical公司. 1.2酯化拆分2.甲基丁酸和水解拆分2.甲基丁酸 乙酯的反应 对于酯化拆分反应,于磨口锥形瓶内中加入1.0 mmol(R,一2一甲基丁酸,等摩尔量的无水乙醇以及 10ml预脱水的有机溶剂,再分别加入适量脂肪酶以 控制反应速度.由于不同脂肪酶最适反应条件不同, 反应体系密闭后,于脂肪酶各自标明的最适反应条 件下,以200r/min转速振荡反应.其中,脂肪酶 RCL的反应条件为:加酶量20g/L,溶剂为正庚烷, 反应温度40.c:脂肪酶CRL的反应条件为:加酶 量40g/L,溶剂为正庚烷,反应温度45.C.2.甲基丁 酸酯化完全拆分理论反应式见图式1. 由于酯化反应是可逆反应,可通过吸除酯化反 应体系中产生的水,使反应倾向于不可逆反应,从而 提高产物及底物的ee值l2.根据理论计算反应体系 最大产水量,在指定反应体系中加入所需用量2倍的 无水硫酸镁(3.4g/L,0.034g),以保证反应倾向于不 可逆反应.定时从反应液中取0.2ml样品,10000 r/min离心10min,取上层有机相进行手性GC分析. 对于水解拆分反应,取2.0mmol(R,.2.甲基丁 酸乙酯置于含10ml0.05mol/L的KH2PO4/K2HPO4 缓冲液的磨口锥形瓶内,分别加入适量脂肪酶以控 制反应速度.同样由于不同脂肪酶最适反应条件不 同,反应体系密闭后,于各自标明的脂肪酶最适反应 条件下,以200r/min转速振荡反应.其中,脂肪酶 第9期李小路等:脂肪酶催化酯化拆分与水解拆分2一甲基丁酸及其酯953 OH+CHCHOH./\++1,—二—?/\\n/\+ Heptane:. (尺,一2一methylbutyricacid(—ethyl2-methylbutyrate)一2一methylbutyricacid 图式1脂肪酶催化酯化完全拆分2.甲基丁酸理论反应示意图 Scheme1.Theoreticalschematicdiagramofesterificationresolutionof2-methylbutyricaci dcatalyzedbylipase.Reactionconditions 2-methylbutyricacid100mmol/L,ethanol100mmol/L,"一heptanesolvent,200r/min. ./\+ (R,一ethyl2-methylbutyrate H:O!!OH+/V,' AqueousphaseO/\+CH 3 CH2OH 图式2脂肪酶催化选择性水解完全拆分2甲基丁酸乙酯理论反应示意图 Scheme2.Theoreticalschematicdiagramofhydrolysisresolutionofethyl2-methylbutyrate catalyzedbylipase 2-methylbutyrate200mmol/L,KH2POa/K2HPO4buffer,200r/min. RCL的反应条件为:加酶量10g/L,KH2PO4/ K2HPO4缓冲液(pH7.5),反应温度40.C;脂肪酶 CRL的反应条件为:加酶量20g/L,KH2PO4/ K2HPO4缓冲液(pH7.0),反应温度45.C.2一甲基丁 酸乙酯水解完全拆分理论反应式见图式2.定时从 反应液中取0.2ml样品,10000r/min离心10min, 上清液用等体积乙酸乙酯萃取,萃取液用于手性 GC分析. 2一甲基丁酸和2.甲基丁酸乙酯的光学纯度分析 采用Varian3900型气相色谱仪分析.手性毛细色 谱柱(SUPELCO.一DEX.120一Chiralcyclodextrin capillaryGCcolumn,30m×0.25mm×0.25rtm),分 流比为1:100;进样口温度250.C:检测器温度 300.C;载气H2;载气流量2.0ml/min;柱升温程序 为40.C保持22min,再以10.C/min的速率升温至 120.C,保持10min. 参照文献[29],计算反应的对映体选择性值: E=ln[1一(1+(c+ee(1-c))]/ln[1一(1+(c—ee(1一c))] = ln[1一(1+C(1+eep)]/ln[1一(1+c(1一eep)].其 中,ee.和ee分别为产物及底物的ee值,可从实验 检测得到,转化率c及反应平衡常数值的计算参 见文献『29].对于水解反应,由于是在水相体系中, 可认为是不可逆反应,反应平衡常数计为Of.. 2结果与讨论 2.1催化酯化拆分2.甲基丁酸的脂肪酶的比较 本文首先选择了11种分别来源于细菌,霉菌, 酵母以及动物的有一定酯化能力的脂肪酶,考察了 它们催化酯化拆分2.甲基丁酸的效果.由于决定酶 促拆分效果的主要因素是酶的选择性,酶的活性和 使用量只影响反应速率及转化率,通过添加适量的 脂肪酶控制反应速率,检测反应转化率c,比较相近 转化率(50%左右)时各个脂肪酶催化的ee.,ee及 对映体选择性E值,以确定适宜的脂肪酶,结果见表 1.由表可见,除BCL外,其他脂肪酶都有一定的酯 化2一甲基丁酸的能力,但对映体选择性普遍不高 <5).其中,RCL的对映体选择性最高,为4.9,在转 化率接近50%时,ee.和ee值均为50%左右.其次 是CRL,对映体选择性为4.7.关于PS,F.AP15, CRL以及LipozymeIM等脂肪酶在有机相中酯化 拆分2.甲基丁酸也见诸报道[6,101,效果均不太理想, ee.值均不到50%.由表还可发现,几乎所有脂肪酶 都无一例外地优先选择合成f一型的酯.该结果符 合Kazlauskas.法则:在0[.羧基取代的情况下,所有 的脂肪酶都优先选择(.构型的对映体反应[3们. 对于酯化拆分,为了提高ee值,应尽量降低体 系水含量,减少逆向的水解反应.鉴于脂肪酶RCL 和CRL反应对映体选择性E及ee值均相对较高, 因而进一步考察了它们在除水条件下的酯化拆分过 程,在体系中加入过量无水硫酸镁,吸除酯化反应所 产生的水,以尽可能降低体系中的水含量,使得反应 成为不可逆过程.结果见图1.由图可见,RCL的 拆分效果较好,其催化反应的最高ee值也略高于脂 肪酶CRL,最高ee值可达60%,与文献[6,11】较为 一 致,但反应效果仍不够理想.因此,通过脂肪酶催 化酯化反应实现(R,.2.甲基丁酸的有效拆分可能 第9期李小路等:脂肪酶催化酯化拆分与水解拆分2一甲基]'酸及其酯955 Reactionconditions:KHzPO4/K2HPO4buffer,ethyl2-methylbutyrate200mmol/L,200r/ min eep:ee((-2一methylbutyricacid);ee:ee(()一ethyl2-methylbutyrate). 脂肪酶CRL水解拆分(见图2(b)),反应12h后,ee 值也可达到85.5%.可见,与酯化反应相比,虽然2一 甲基丁酸的疏水性使其在有机相中的酯化反应有一 定的优势,但在一些选择性较高的脂肪酶催化水解 反应中,却可以得到较高的ee值,这为利用脂肪酶 的水解反应拆分).型酸和酯提供了一条有效途径. Time(h) 图2RCL(a)和CRL(b)水解拆分2.甲基丁酸乙酯的时 间过程曲线 Fig.2.Timecourseofhydrolysisresolutionofethyl2-methylbutyrate catalyzedbyRCL(a)andCRL(b).(1)Conversion;(2)ee.;(3)eeD. Reactionconditions:(a)Ethyl2-methylbutyrate200mmol/L,prepared RCL10g/L,KHzPO4]KzHPO4buffer【pH7.5),40.C,200r/min;(b) Ethyl一2-methylbutyrate200mol/L,CRL20gin,KH2POa/KzHPO4 buffer(pH7.O),45.C,200r/min. 因此,利用RCL在水解反应中较好的选择性, 通过单步的拆分反应,即可获得ee值为92.4%的 )一2.甲基丁酸乙酯,尽管此时).2.甲基丁酸乙酯 得率不高,为25.3%.再经过简单的水解反应,即可 得到相应ee值的)一2.甲基丁酸.此结果远高于目 前脂肪酶拆分2一甲基丁酸及其短链酯文献报道的结 果,通过这一方法可以得到ee值较高的).2.甲基 丁酸及其酯. 2.3温度对酯化拆分及水解拆分效果的影响 为获得更高光学纯度的2一甲基丁酸及其乙酯, 反应条件的优化是常用的方法.影响脂肪酶选择性 的因素有很多,如温度】,pH[们,水活度【1,有 机相【22,23]和助溶剂【等,且不同的酶及反应体系, 影响其选择性的因素又各不相同.但在生物催化的 立体化学反应中,温度常被认为是最关键的变量,对 反应的选择性影响很大【】钔.因此,本文进一步考察 了温度对酶选择特异性的影响,确定较适宜的温度, 以期提高酶催化反应的光学选择性及拆分产物或者 底物的光学纯度. 分别在不同温度下比较了RCL催化的酯化与 水解反应拆分2.甲基丁酸及其乙酯底物与产物ee 值随转化率变化的关系.无水条件下的酯化拆分反 应如图3所示.在较低的相同转化率下(转化率小 于70%),4.C时ee值均较高,随着温度的升高,ee. 值逐渐降低.而对于ee值,也存在同样的现象.4 .C下反应的ee.和ee.最高,分别可达到65.1%和 70.9%,且对映体选择性E从40.C的5左右上升至 ?鲫?加O踟??加0 ^一oJ0.j008>口.u一一Jo.|oII.Is矗I10u 第9期李小路等:脂肪酶催化酯化拆分与水解拆分2一甲基丁酸及其酯957 IshikawaM,KitahqraT.DevelopFoodSci,2006,43:97 4BerglundP,HolmquistM,HedenstromE,HultK,Hogberg HE.trahedron:Asymmetry.19934:1869 5HeinsmanNWJTOrreniusSC,MarcelisCLM, TeixeiraAD,FranssenMCR,vanderPadtA,JongejanJ A.deGrootA.BiocatalBiotransform,1998,16:l45 6KwonDY,HongYJ,YoonSH.JAgricFoodChem,2000, 48:524 7EngelKH.Tetrahedron:Asymmetry,1991,2:l65 8Uemasul_HinzeWL.Chiralitv,1994,6:649 9LariosA,GarclaHS,OliartRM,Valerio—AlfaroG.Appl Microbio,Biotechnol,2004,65:373 10HolmbergE,HolmquistM,HedenstromE,BerglundP, NorinT,HogbergHE,HultK.ApplMicrobiolBiotechnol, 1991.35:572 l1NguyenBV,HedenstromE.Tetrahedron:Asymmetry, 1999.10:182l 12SeinoH.UchiboriT,NishitaniT,InamasuS.JAm0il ChemSoc.1984.61:1761 l3SonnetPEBaillargeonMW.JChemEcol,1987,13: 1279 14vanderPadtA,SewaltJJW,AgostonSMI,van'tRietK. EnzymeMicrobTechnol,1992,14:805 15ValivetyRH,HallingPJ,MacraeAR.BiotechnolLett, 1993.15:l133 16MukherjeeKD.BiocatalBiotransform.1990.3:277 l7PhillipsRS.Enzymo,MicrobiolTechnol1992.14:417 l8HolmbergE,HultK.Biotechno,Lett,l991,13:323 19NoritomiH,AlmarssonO,BarlettaGL,KlibanovAM. BiotechnolBioeng,1996,51:95 20LongWS,KowPC,KamaruddinAH,BhatiaS.Process Biochem,2005,40:2417 21单天宇,王栋,徐岩,何军邀.催化(ShanTY, WangD,XuY,HeJY.ChinJCata1),2008,29:403 22FitzpatrickPA,KlibanovAM.JAmChemSoc,1991,113: 3166 23WescottCR,KlibanovAM.BiochimBiophysActa,1994, 1206:1 24HansenTV,WaagenV,PartaliV,AnthonsenHW, AnthonsenT.Tetrahedron:Asymmetry,1995,6:499 25LeeWH,KimKJ,KimMG,LeeSB.JFermentBioeng, 1995.80:6l3 26ChenY,XuJH,PanJ,XuY,ShiJB.JMo,Cata,B,2004, 30:203 27贺芹,徐岩,滕云,王栋.催化(HeQ,XuTengY' WangD.ChinJCata1),2008,29:41 28YuLJ,XuY,WangXQ,Yuxw.JMolCatalB,2007, 47:149 29ChenCS,WuSH,GirdauksG,SihCJ.JAmChemSoc, 1987.109:2812 30AhmedSN.KazlauskasRJ,MorinvilleAH,GrochulskiP, SchragJD,CyglerM.BiocatalBiotransform,1994,9:209 31V/inttinenE.KanervaLT.Tetrahedron:Asymmetry,1997, 8:923