载牛血红蛋白纳米微囊中高铁血红蛋白含量的控制
载牛血红蛋白纳米微囊中高铁血红蛋白含
量的控制
26卷5期
20H07年l0月
中国生物医学工程
ChineseJournalofBiomedicalEngineering Vo1.26No.5
October20H07
载牛血红蛋白纳米微囊中高铁血红蛋白含量的控制
章晓兰袁媛单晓茜盛燕刘昌胜
(教育部医用生物材料工程研究中心.华东理工大学生物材料研究所,上海200237) 摘要:高铁血红蛋白(metHb)含量是影响血液代用品携氧.释氧性能的主要因素之一.以市售的牛血红蛋白(Hb)
冻干粉(90%以上已氧化)为原料,采用强还原剂连二亚硫酸钠将metHb还原成亚铁状态,进一步采用溶剂扩散.挥
发复乳化法制备载牛Hb聚合物型纳米微囊血液代用品.研究制备过程中不同工艺条件对微囊中metHb含量的影
响,并对制备过程的工艺参数进行优化.结果表明,连二亚硫酸钠与牛Hb摩尔比为2:1时原料中metHb基本被还
原.制备过程中较低的乳化强度(如初乳采用超声波输出功率27w作用12s,复乳采用10000r/min匀浆乳化
1.5rain),油相中水溶性溶剂丙酮的加入及嵌段了PEG链段的聚合物能有效抑制Hb氧化,通过优化工艺最终使微
囊内metHb含量从原料的9o%以上降为8.6%,使其具备良好的携氧.释氧性能.该方法是控制微囊型血液代用品
中metHb含量,进而实现其高效携氧.释氧功能的理想途径.
关键词:高铁血红蛋白;氧化;复乳;携氧.释氧
ControlofMethemoglobinLevelofBovineHemoglobin-loadedNanoparticles ZHANGXiao—LanYUANYuanSHANXiao—QianSHENGYanLIUChang—Sheng
(EngineeringResearchCenterforBiomedicalMaterialsofMinistryofEducation,EastChinaUniversityofScienceandTechnology.Shanghai200237)
Abstract:ThemetHbcontentisoneofthemainfactorsaffectingtheoxygencarrying—
releasingpropertyofblood
substitubs.BovineHbinlyophilizedform(withover90%oxidized)purchasedfrommarketwasusedasraw
materials.Thepowerfulreductantsodiumdithionite(SD)wasemployedtoreducetheoxidizedmetHbtoferrous
state,whichwasfurtherencapsulatedinpolymericnanoparticlesbloodsubstituesbythesolventdiffusion—evaporation
doubleemulsionmethod.ThepreparativeconditionsinfluencingthemetHbcontentinnanoparticleswereinvestigated
andoptimized.TheresultsshowedthatthemetHbintherawbovineHbcouldbereducedtoferrousstatewhenthe
molarratioofSDtoHbwas2:1.Lowemulsificationstrengthinpreparationprocesswas27Wfor12sbyultrasonic
and10000r/minfor1.5minofhomogenizationduringtheprimaryandsecondaryemulsion,respectively.Theaddition
ofmisciblesolventssuchasacetoneandthebiodegradablepolymerswithPEGsegmentsinoilphasecouldsuppress
Hboxidation.TheresultantmetHbleveldecreasedfrominitialover90%intherawbovineHbto8.6%,which
showedbettercapacityofcarrying—
releasingoxygen.Themethodpresentedheremayprovideanidealwaytocontrol themetHblevelintheHb—
loadednanoparticlesbloodsubstitutesandrealizethefunctionofcarrying??releasingoxygen
effectively.
Keywords:methemoglobin;oxidation;
中图分类号R318.08文献标识码
引言
doubleemulsion;carrying—releasingoxygen A文章编号0258.8021(2007}05.0787.06 世界范围出现的血源严重短缺以及常规输血存
在的安全隐患使得血液代用品日益成为国际医药生 物技术领域研究开发的热点.其中,以可生物降
解聚合物为壳材,模拟人体天然红细胞的组成与结 构,包埋Hb形成的微囊型血液代用品,不仅克服了 收稿日期:2006—08.31.修回日期:2007.06.22. 基金项目:十五"863"纳米专项(2004AA.302050);上海市科委纳米专项
(0452nm022).
*通讯作者.E.mail:liucs@ecust.edu.ca
中国生物医学工程26卷
第一,二代交连,聚合,重组Hb基血液代用品无细
胞膜的屏障,对纯度要求极高等缺点,同时解决了脂 质体微囊型血液代用品力学性能和小分子物质通透 性差的问题,是最新一代血液代用品.'
携氧.释氧功能是血液代用品
设计
领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计
和制备最主
要的目标.对Hb为基质的微囊型血液代用品而
言,携氧.释氧功能由其中的Hb完成.Hb有三种状 态,即脱氧态(deoxyHb),氧合态(oxyHb)和高铁态
(metHb)deoxyHb在空气中易和氧气结合形成
oxyHb.deoxyHb和oxyHb分子中铁原子均处于亚铁 状态(Fe),具备携氧.释氧性能.而Hb氧化形成
的高价铁态(Fe")的metHb,则失去携氧.释氧性能. 因而血液代用品中高铁血红蛋白(metHb)的含量直
接影响着其携氧.释氧功能的发挥.研究表明,血液 代用品metHb含量低于10%才能保证其携氧一释氧 功能.
天然红细胞内强大的高铁还原系统如NADH一 高铁血红蛋白还原酶和NADPH.高铁血红蛋白还原 酶等使metHb含量低于1%,从而能够为生命组织 提供赖以生存的氧气.但脱离红细胞内还原系统 保护的血液代用品易发生氧化而使metHb增高.如 市售的脱基质牛Hb原料中metHb含量高达90%以 上,这为具有理想携氧.释氧性能的血液代用品的体 外构建带来极大的困难.为了控制血液代用品中 metHb含量,许多研究者通过提取红细胞中还原酶 系统,模拟其功能来抑制metHb的形成,但存在 还原酶组成复杂,提取工作繁琐,且脱离体内环境后 还原酶易失活等问题.
采用叮生物降解聚合物,通过改性复乳化方法 制备的载Hb纳米微囊(Hb.1oadednanoparticles,
HbP).解决了高包封率和小粒径的矛盾,得到85% 以上包封率,粒径可控,表面多孔的纳米微囊,是一 类极具应用潜力的血代品.但原料采用市售的牛 Hb冻干粉,由于原料在纯化和储存过程中的氧化, -taetHh含量超过90%,因此高铁含量的控制成为本 研究的极大挑战.先采用强还原剂连二亚硫酸钠 (sodiumdithionate,SD)对原料实行还原,探讨了还原 剂的合理用量,使原料中高价铁态ttb转化成亚铁 状态,之后以可生物降解聚合物为壳材料,采用溶剂 '
散.挥发复乳化【艺(W/O/w,)包埋还原后的Hb 制备IIbP.在制备过程中,对影响Hb氧化的工艺参
数如初乳,复乳过程中乳化强度,油相中溶剂组成及 壳材种类进行优化以控制metHb含量,最终实现微 囊内metHb含量的可控,获得具备理想携氧.释氧功 能的载牛Hb纳米微囊型血液代用品.
1材料和方法
1.1材料
牛Hb冻干粉购自上海源聚生物公司;聚合物 D,L—PLA(M48k),PLA—PEG(M43k,MwPl'^:MwPEG
=7:3),PCL(Mw45k)和PCL—PEG(Mw42k,Mw唧: M眦=l:6)购自四川中科院成都有机化学研究所; 其他试剂为国产
分析
定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析
纯;紫外.可见分光光度计 (Spectrumlab54,上海棱光技术有限公司). 1.2方法
1.2.1载牛Hb纳米微囊(HbP)的制备
采用改性溶剂扩散,挥发复乳化(W/O/W)制备 工艺,具体实施如下:0.5mL血红蛋白溶液倒入5mL 油相中(10mg壳材溶于一定量的二氯甲烷等溶剂), 超声波(JYD.900,ZhiXinInstrumentCo.,Ltd.,
Shanghai)乳化形成初乳,初乳加到外水相两步匀浆 乳化形成复乳,之后倾到200mL水溶液挥发溶剂, 最后离心收集微囊.整个制备过程用4?水浴控 温,考查制备条件对metHb含量的影响时,每次只改 变一个参数.
1.2.2牛Hb冻干粉原料还原
牛Hb冻干粉溶解于去离子水中,加不同比例 的还原剂SD(SD:Hb=l:1,2:1,4:1,6:1)对原料实 行还原.通过紫外.可见光分光光度计在500, 700nm范围扫描,观察541nm,577nm和630nm处的 吸收峰,采用1.2.3方法计算相应的metHb百分
含量.
1.2.3Hb及metHb含量测定方法
1)游离Hb浓度(Hb)测定:采用
标准
excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载
氰化高 铁血红蛋白(eyanomethemoglobin)法测定Hb 浓度.
2)游离metHb浓度(metHbh)测定:采用试剂 (15%KCN溶解于0.05Mphosphatebuffer,pH
7.4).待测样品在630nm处的吸光度记OD,则 OD是混合物(oxyHb+deoxyHb+metHb)的吸光度. 一
滴KCN试剂加到待测样品混合后,读取630nm处 吸光度,记为OD,.样品中metHb和试剂中的KCN 反应生成cyanome【hemfobil1,cyanome【hemogl0bin在 630nm几乎无吸收,则OD,是样品中oxyHb+ de0xyHb的吸光度,待测样品中的metHb含量可通过 式(1)得出,其中3.7是metHb在630nm处的毫摩尔 吸光系数
5期章晓兰等:载牛血红蛋白纳米微囊中高铁血红蛋白含量的控制
metHbh(mM)=(OD.一OD:)/3.7(1) Hb(withinHbP)=HblXEE%(2) metHb%=metHb/HbX100(3) 3)HbP内Hb含量(Hb(withinHbP))测定:根据 式2得出.其中HbandEE%分别为微囊制备过 程总投入的Hb量和包封率.包封率由离心后测定 上清液中游离Hb量得出.
4)HbP内metHb含量测定:基于HbP具备多孑L 结构,允许小分子的自由扩散.加入的KCN扩散进 HbP内,HbP内的metHb含量通过方程l计算.
MetHb含量最终以百分率表示,通过式(3)计算. 1.2.4HbP氧解离曲线及测定
氧解离线的测定采用经典的分光光度法..结 合临床医用脉冲血氧饱和度测定仪设计原理,利用 近红外光的强穿透性(能穿透人体组织如皮肤,肌 肉,血管等对红细胞内Hb的氧饱和度进行无损监 测),能穿透聚合物壳材对包封的血红蛋白的氧合度 进行测定.P为半氧饱和度,直接从氧解离曲线中 获得.
2结果与讨论
2.1牛Hb原料还原
制备血液代用品所用的Hb原料一般从红细胞 中提取,分离,再进一步冻干形成冻干粉剂.由于脱 离红细胞内天然的还原体系的保护,Hb在分离和储 存过程中氧化很难避免,因此多数购置的Hb冻干 粉剂中含有大量的metHb.本研究试图对已经高铁 化(90%以上氧化)的原料进行还原.常见的metHb 还原剂有抗坏血酸,谷胱苷肽,SD等.前二者还原 metHb较缓慢且不完全.SD是一种强还原剂,能迅 速还原metHb,但自身也容易被空气中的氧气氧化, 氧化的过程中会形成氧自由基等活性氧化剂,后者 进一步氧化Hb,因此SD不能过量.但是目前尚未 见有报道SD和metHb化学反应配比,因此很难定 量.基于以上认识,通过实验来确定SD的合理用 量显得尤为重要.
有报道SD在水中的分解反应为Na2SO+H:O +O=NaHSO3+NaHS04,式中Na2S04在氧化时提 供4个电子.metHb还原成亚铁态也需要4个电子 (每个Hb分子含4个铁原子),因此设想Na2S:O4和
metHb的化学配比应为l:l(Na2S:O+Hb(4Fe?) 一Hb(4Fe)+NaHSO+NaHSO4).扫描图谱(图 1)显示,SD:Hb=l:l时,630nm处(metHb的特征吸 收峰)的吸收峰略有降低,577nm和541nm处出现两 吸收峰(还原后的亚铁态Hb与氧气结合形成OxyrHb 的特征吸收峰),但OxyHb的特征峰不明显.当SD: Hb=2:l时,OxyHb的特征吸收峰非常明显,经测定 高铁含量约1.2l%,证明原料中的metHb已基本被 还原.当SD与Hb的比例超过2时,metHb含量再 次升高.如SD:Hb=4:l时,metHb含量约
(80.43%),SD:Hb=6:l时,metHb含量约(88.3%) (表1).原因分析是过量的SD自身氧化产生的氧 自由基充当氧化剂作用,氧化亚铁态Hb,使metHb 含量进一步升高.这意味着当SD与Hb的比例为2 时是最佳用量,能实现原料中metHb的还原. 2.2复乳化工艺影响HbP内metHb含量的主要因 素
复乳化工艺制备条件相对温和,包封率高,近年 来成为包载药物的常规使用方法.但该过程涉及到 机械剪切力,有机溶剂,疏水性壳材等,这些因素对 蛋白均有不同程度的影响….复乳化工艺对亚铁 态Hb的氧化规律目前未见文献报道.本研究采用 扩散.挥发复乳法制备HbP,考察了初乳和复乳过程 的乳化强度,油相中壳材及溶剂类型对Hb的氧化 规律,从而达到优化工艺参数的目的.
图1连二亚硫酸钠(SD)与lib厣尔比对lib原料的还原 效果
Fig.1EffectofmolarratiosofSDtoHbonthereduction
oftherawHb
2.2.1初乳过程乳化强度的影响
初乳(W1/O)阶段采用超声波乳化,实验过程发 现,输出功率小于27W时无法有效分散乳液,因此 本研究在W1/O阶段选择27W为最小输出功率.实 验考察了27W,50W和70W三档输出功率作用不同 时间对Hb氧化程度的影响.壳材采用PCL,溶剂为 二氯甲烷(dichloromethane,DCM),复乳阶段采用
中国生物医学工程26卷
10000r/min匀浆分散2min,收集的HbP中metHb含 量按1.2.3方法测定,结果以三次测定的平均数表 示,见图2.初乳采用27W作用12s,经测定metHb 含量为(23.50?1.62)%,50W和70W作用12s后高 铁含量分别为(26.56?2.42)%和(39.42?2.31)%, 随着输出功率的增大,Hb氧化加剧,metHb含量明 显增加,同时Hb氧化呈超声时间依赖性,超声时间 越长,metHb含量越高.70W作用18s时可见乳液 由鲜红色变暗,经测定metHb含量达(71.6? 1.9)%,说明Hb严重氧化.
表1连二亚硫酸钠(SD)与Hb摩尔比对Hb原料中高铁血 红蛋白含量的影响
Tab.1EffectofmolarratiosofSDtoHbonthemetHblevel
intherawHb
sD与lib摩尔比高铁血红蛋白含量/%
l:l
2:l
4:l
6:l
91.6O?1.05
1.2l?0.32
80.43?0.96
88.3?1.24
\
?
正
l罡【
担
图2初乳过程中超声波乳化强度对微囊内高铁血红蛋 白含量的影响
Fig.2Effectofemulsificationstrengthbyultrasonicinthe
primaryemulsiononthemetHblevelinHbP
W1/O过程是复乳化工艺制备微囊的第一步, 此时,Hb处于裸露及半包封状态,直接处于超声波 输出的机械应力及有机溶剂作用下,对Hb的氧化 还原状态影响明显.另外,超声波输出的能量引起 的局部温度升高和产生的气穴n,也促进Hb氧化. W1/O乳化强度越高,Hb氧化越严重,因此后续实验 采用较小的输出功率(如27W作用12s)比较理想. 2.2.2复乳过程乳化强度对HbP内metHb含量的 影响
HbP的制备中复乳阶段采用匀浆分散乳化.上 述结果表明,乳化强度越强,Hb氧化越明显,因此采 用10000r/min(本实验匀浆机最小输出功率),初乳 采用超声波27W输出功率作用12s,壳材用PCL,溶 剂为DCM,分别考察0.5mln,1rain,1.5min和2mln匀 浆时间对Hb的氧化程度.
图3结果显示,同样的匀浆功率下,HbP内 metHb含量呈匀浆时间依赖关系.如匀浆时间
0.5rain,1min,1.5rain和2rain的条件下metHb含量分 别为(13.64?0.73)%,(15.37-t-1.16)%,(18.20? 1.10)%和(23.50?1.62)%.匀浆时间长,乳化强 度大,Hb在高的机械剪切力作用下,氧化加剧,因此 较小的乳化强度有利于抑制Hb的氧化.但复乳化 工艺中,匀浆乳化强度和最终的微囊粒径及粒径分 布有较大关联性,即乳化强度大,粒径小且粒径分布 窄.
由于人体内最小的毛细血管直径约为4m, 7m,因此输入体内的粒子直径应小于4m以防栓 塞.Kllbanov等报道粒子直径超过200nm的粒子 很快从血循环中清除,在脾脏中累积.另外还观察 到小于70nm的粒子易被肝脏捕获.这就是说, 能在体内达到长循环的粒子合理粒径应在70nm, 200nm之间.本研究中制备的HbP动物体内分布实 验也表明大的粒子较易从血循环中清除(见后续报 道).因此为获得合理的粒子直径,第二步匀浆乳化 强度不能过低.综合Hb氧化的因素,把初乳和复 乳的乳化强度分别优化为超声波27W输出功率作 用12s,匀浆10000r/rain作用1.5rain. \
皿
嘲
鲁
担
图3复乳过程中匀浆乳化时间对微囊内高铁血红蛋白 含量的影响
Fig.3Effectofhomogenizationtimeinthesecondary
emulsionOI1themetHblevelinHbP
2.2.3油相中有机溶剂的影响
图3结果表明,在优化的乳化强度条件下,HbP 内metHb含量为(18.2?1.10)%.为进一步降低 metHb含量,实验考察了不同有机溶剂的影响.
5期章晓兰等:载牛血红蛋白纳米微囊中高铁血红蛋白含量的控制79l
DCM能溶解大量聚合物壳材而成为一种常规溶剂. 本实验考察在DCM中分别加入部分或完全水溶性 有机溶剂乙酸乙酯(ethylacetate,EA)或丙酮 (acetone,Ace)(DCM/EA,DCM/Ace,1:1,V/V),经测 定metHb含量从(18.2?1.10)%分别降为(15.7? 1.23)%和(11.60?1.51)%(图4).EA和Ace的加 入,相对单纯采用DCM为溶剂时Hb氧化得到抑制. 分析原因是复乳化工艺中溶剂的脱除导致壳材沉 降,壳材的沉降速率取决于溶剂的脱除速率.溶剂 的脱除过程包括从油相中溶解,扩散至外水相,然后 再挥发.在整个过程中,低沸点的有机溶剂挥发相 对快,因而溶剂溶解,扩散成为溶剂脱除的主要步 骤.DCM在水中的溶解度低(2%,W/V),使得溶解, 扩散速率相对较慢.而加入溶解度高的EA(8.7%, W/V),Ace(完全水溶)之后,当W1/O加到外水相 时,水溶性溶剂迅速扩散进入外水相,使高分子壳材 很快沉降形成微囊包裹Hb,大大缩短Hb和机械应 力,有机溶剂等外部环境的接触时间,有利于保护 Hb.且随着溶剂在水中溶解度的增加,壳材沉降速 率增加,Hb氧化抑制增强,说明水溶性溶剂有利于 抑制lib氧化.因此把溶剂优化为DCM/Ace(1:1, V/V)比例的混合溶剂.
2.2.4油相中聚合物壳材的影响
考察了常用的几种可生物降解聚合物(PCL, PCL—PEG,PLA,PLA—PEG)对Hb氧化程度的影响. 采用以上优化的乳化强度和溶剂组成.图5结果显 示,PCL,PCL—PEG,PLA,PLA—PEG制备的HbP内的 metHb含量分别为(1l,60?1.50)%,(9.20?
1.50)%,(13.50?1.80)%和(8.60?1.60)%.结 果显示无论是PLA还是PCL,嵌段了PEG链段的共 聚物形成的微囊内metHb相对低.研究表明,PEG 嵌段的共聚物在微囊形成过程中,由于其亲水性特 性,使包载的蛋白倾向于排列在微囊深部,这样弱化 了外部因素如机械应力,溶剂的影响",使Hb氧化 得到抑制.另外,PLA—PEG作为壳材制备的微囊由 于PEG的亲水性修饰,能显着延长微囊血循环时 间,达到长循环的目的".因此,把PLA—PEG优化 为最终壳材.
综合以上影响Hb氧化程度的因素,把制备HbP 的复乳化工艺参数优化为:初乳过程采用超声波,输 出功率为27W作用12s,复乳采用10000r/min匀浆 乳化1.5min,溶剂为DCM/Ace(1:1,V/V),壳材采用 PLA.PEG,最终HbP内metHb含量约8.6%.而牛 Hb未经原料还原步骤及制备过程优化,微囊内 \
嘲
鲁
姬
图4油相中有机溶剂组成对微囊内高铁血红蛋白含量 的影响
Fig.4Influenceoforganicsolventcompositionintheoil
phaseonthemetHbcontentinHbP \
?
随
鲁
键
图5油相中壳材种类对微囊内高铁血红蛋白含量的影 响
rig.5Effectofthepolymertypesintheoilphaseonthe
metHblevelwitlIinHbP metHb含量接近100%.
2.3氧离曲线及P蜘
评价血液代用品携氧.释氧能力通常考察其氧 解离曲线(oxygendissociationcurves,ODCs)及Ps0. ODCs表示氧分压(oxygenpartialpressure,PO2)与Hb 氧结合量或Hb氧饱和度(oxygensaturation,SO2)关系 的曲线.表示氧饱和度达到50%时的氧分压,体 现氧亲和力高低.
每个Hb分子由1个珠蛋白和4个血红素组成, 每个血红素和一个0,分子结合.Hb的4个血红素 无论在结合0,或释放0时,是一个高度协同的变 构过程,即1个血红素与0.结合后,由于变构效应 的结果,其它血红素更易与0:结合;反之,当结合氧 的Hb的1个血红素释出0后,其它血红素更易释 放0,,因此Hb的ODCs呈S形.S形的ODCs对人 体有重要的生理意义.曲线上段平坦,相当于PO 在60mmHg,100mmHg之间,此范围,P0的变化对
792中国生物医学工程26卷
Hh的sO影响不大,如即使肺泡中氧分压变化较 大,血液中的SO仍可以维持在较高水平,变化较小
(98,96)%,有利于维持组织供o,.ODes的中段较 陡,相当于PO,在40mmHg,60mmHg段,是oxyHb释 放0的部分.曲线下段斜率大,相当于pO,在 15mmHg,40mmHg之间,表明在此范围内,组织PO, 稍有下降,血液中的SO就迅速降低,从而释放出更 多的0,供组织需要.
正常天然牛Hh的ODCs及P与人的相似, 为27mmHg.由于在复乳制备过程中涉及到机械剪 切力,有机溶剂等,Hh有可能失活或氧化,而使 ODCs及P偏离正常值.本研究测试的天然牛Hh 及HbP的ODCs接近(见图6).意味着HbP中的Hb 在整个制备工艺过程中其活性得到保持,具备同天 然Hb的携氧,释氧能力.
\
犀
盈
麻
氧分压/mmHg
性能,解决了前期制备工艺,为进入后续的动物体内 实验奠定基础.
参考文献
2
3j
4
5:
6
[7j
[9
图6天然牛Hb和载Hb纳米微囊氧解离曲线和半氧
饱和度(P5o)
Fig.6OxygendissociationcllrvesandPsoofnativebovine
HbandHbloadednanoParticles[10] 3结论
1)连二亚硫酸钠是强还原剂,能快速有效还原
氧化严重的牛Hb冻干粉原料.经分析,用量与原
料摩尔比为2:1时能还原其中的metHb.
2)探讨溶剂扩散.挥发复乳化工艺对Hb氧化规
律.初乳和复乳过程中乳化强度促进Hb的氧化.
水溶性溶剂Ace的加入及嵌段PEG链段的共聚物
如PL~.PEG能有效抑制Hb的氧化.
3)经最佳条件下获得的载牛Hb微囊内metHb
含量从原料的90%以上降为8.6%.而牛Hb未经
原料还原步骤及优化的制备过程,微囊内metHb含
量接近100%.
所制备的载牛Hb纳米微囊型血液代用品携氧一
释氧曲线和天然牛Hh接近,具备良好的携氧一释氧
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