单核细胞的分离
在外周血中,要分离到足够数量的单核细胞,通常不用比重为1.077的细胞分层液,因为单核细胞的比重与淋巴细胞近似,且含量仅为3%-8%,故很难将两者分开。而如用黏附法,则黏附细胞的剥离较难控制,剥离过度易造成细胞损伤,剥离不全使细胞回收率下降。以下介绍的两种
方法
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可获得量多且纯度和活力都较好的单核细胞。
(一) Colotta方法
【实验原理】见Percoll 非连续密度梯度分离法。
【主要试剂与器材】
(1) 人外周血分离的PBMC悬液。
(2) HBSS(无Ca2+ 、Mg2+),含10% FCS和 25mmol/L HEPES的RPMI-1640 (pH7.2)。
(3) 46%浓度的Percoll。
【操作步骤】
(1) 将分离获得的PBMC用HBSS洗涤2次(1000rpm,5min),加5ml完全培养液重悬。
(2) 将细胞悬液缓慢叠加在5ml的46% Percoll上,室温离心(2200rpm,20min或400g,25min);得到3个带:第一带为富集的单核细胞(83%);第二带含少量的单核细胞;第三带则为淋巴细胞。
(3) 收集第一、第二带的细胞,经洗涤后,重悬于培养液中。
【注意事项】
将细胞悬液叠加在Percoll分离液上时,应缓缓加入,保证二者间的比重界间不被破坏,否则影响分离效果。
(二) 密度梯度离心法
【主要试剂与器材】
(1) 肝素抗凝血。
(2) 不同比重的聚蔗糖-泛影葡胺细胞分层液:
A液:90g/L聚蔗糖15ml,加500g/L泛影葡胺10ml (比重为1.14)。
B液:90g/L聚蔗糖17.5ml,加500g/L泛影葡胺10ml (比重为1.13)。
C液:90g/L聚蔗糖20ml,加500g/L泛影葡胺10ml (比重为1.12)。
D液:90g/L聚蔗糖24ml,加500g/L泛影葡胺10ml (比重为1.08)。
【操作步骤】
(1) 在15ml离心管内依次加入A液、B液、C液和D液各2ml,制成梯度。
(2) 在D液上叠加肝素抗凝血(用HBSS稀释)约2ml,室温下,离心(1000 rpm,40min);血浆与D液的交界面即为单核细胞层(纯度可达97%)。
(3) 用吸管小心吸取该细胞层,经洗涤后,重悬于培养液中备用。
【注意事项】同“外周血PBMC的分离”。
---摘自《免疫学技术》,科学出版社,葛海良,张冬青 主编