【doc】应用免疫吸附电镜技术研究三种真菌传线状病毒的血清学关系

【doc】应用免疫吸附电镜技术研究三种真菌传线状病毒的血清学关系 应用免疫吸附电镜技术研究三种真菌传线 状病毒的血清学关系 第6卷第3期 i990年9月 病毒 CHINESEJOURNALOFVIROLOGY Vo1.6No.3 Sept.1990 应用免疫吸附电镜技术研究三种真菌传线状病毒的 血清学关系 陈剑平阮义理洪健棘均炔 提要盅J=}j免疫吸附电镜技术研窭国大,小董上三种由禾谷多粘菌PoZyrnyxa graminis传线状病毒,即大麦费l花叶病毒(BayMV),小麦黄花叶病毒(WyMV)和小麦 棱条斑花叶病毒(WSSMV)分离物的血清学关系,结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 咀送三种病毒具有共同的抗原性尤 其是WyMV与WSSMV,它们的血靖学性质几乎完全相同.我国的BaYMV-萧山(xsa),嘉 善(JSa),上海(sail),扬州(yZh),盐城(YCa)和常熟(CaSh)6十分离物,均能 与日本13aYMV 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 分离物(BaYMV—J)的抗血清以及欧堋的So,WiltsMre(w).NM株 (XCh),安系抗血清起反应,表嚼属敢洲所划分的BaYMV血清型l.WSSMV~新昌吉 (AJ),宜(YX),扬州(yZa)和雅安(YA)5叶,分离物的血清学性质一致,均能与加 章大和美国的WSSMV抗血清以及日本WYMV抗血清发生反应.讨论了抗血蒲中甘油的存在对 免疫吸附电镜捡河6结果的影响. 关键调大麦黄花叶病毒(13aYMV)小麦黄花叶病毒(WYMV)小麦梭条斑花叶 病毒(WSSMV)血清学关系免疫吸附电镜技术 迄今为止,世界上已确定的由禾谷多粘菌Polymyxagraminis传播的线状病毒有大麦 黄花叶病毒(]3arIeyYellowMosalcVirus,BaYMV)[1~33,小麦梭条斑花叶病毒 (WheatSpladleStreakMosaicVirus,WSSMV)c~,53,小麦黄花叶病毒(wheat YellowMosaicVirus,wYMV)(1,6),燕麦花叶病毒(OatMosalcvjras,~MV)c7~和 水稻坏死花叶病毒(RiceNecrocicMosaleVirus,RNMV)(8]五种.这些病毒颗粒长度分 布于109~2000rim范围内,并在此范围内出现几个主要的分布峰[".除了寄主埴物外,它们 的生物学和生物化学性质有许多相似性或相同性,其中WSSMV和WYMV的性质几乎完全 相同,有学者推测WSSMV是wYMV的一个株系[6).我们用自制的和国外同行提供的抗血 清,应用免疫吸附电镜技术,研究了我国的BaYMV,WSSMV和WYMV几个分离物之间的 血清学关系和BaYMV分离物的血清型.初步结果报遭如下. 材料和 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 (一)病固t立方法参见文献(5). (二)供试I青誊分离物奉研究所用的病毒分离物,BaYIvlV~igi江省萧山(xia0shun,XSh) '农业部和浙江省自然科学基蛊会资助项 1.淅|工省农业科学院毒宴验室,杭州 2.浙江农业大学电子显微镜实验室,杭【 收稿日期I1989年e月l0日,同年7月24H信画. 240病毒6卷 嘉菩(JiashaI1,JSla),上海市(Slaai~ghM,SlaH).j工苏省扬州(Yatlgzhou,Yzh).盐城 (y~aileheilg,YCh)和常熟(Claailgslau,ChSh)共6十分离物;WSSM'q-有浙江省新昌(Xiiag— chang,XCh).安吉(Anjl,AJ),江苏省宜(Yixing,YX).扬州(Yailgzlaott,YZh)和四 川省雅安(Yaan,YA)共5十分离物,WYMV有陕西省长安(cgangan,ChA)1十分离物. (兰)抗血清来源BaYMV—XSll兔抗血清由本实验室制备c9],微量试管沉淀反应效价为2048. 日本BaYMV标准分离物(13aYMV—J)(1,.WYMV标准分离物(WYMV—J)(1]以厦WSSMV加拿 大分离l枸(WSSMV—C)(10j等的抗血清.均由日本九州农业试验场Usugi(宇杉)博士提供i13aYMV 的NM,MSoC3J等分离物的抗血清由联邦德国生物局Ht~th博士提供;BaYMV的Wiltshlre(W)和' Streatley(s)Cl13分离袖的抗血清和IgG由英国洛桑试验站Adams博士提供;WSSMV黄国密执安 州分离物(WSSMV—uSA)n2)抗血清由美国南加州大学Hau1fer博士提供.. (四)病毒测定样品的制备除WyMV-CllA惑病病株是采自当地病田外,其余所有供试标样均为 生巨于杭州病圃各地病土上的相应病转.取0.1克病叶加八lml磷酸缓冲液(0.03M,pH7.0,台0.1M EDTA,下同),在研钵中研肆,两层尼龙纱右过滤榨取汁液或经低速离心,除去寄主组织碎片,取含 病毒上清液作为抗原供测定之用. (五)免痘吸附电镜测定方法 1.捕获法将镐有Formver麓的铜I9,膊面朝下放在用o.05MpH9,6碳酸钠缓冲液稀释500,1000 倍的抗血清上,室温下孵育1小时,甩滤纸设干.摸面朝下浮于磷酸缓冲液上,至少洗5分钟用滤纸吸 干,再洗一次,吸干后,再膜面朝下,置于病叶汁液上,4.C孵育3小时.然后用20滴重 蒸承轻轻冲洗,吸 干,最后用5滴1师pH7.磷钨酸负染.待干澡后置予电镜下观察,3万倍下统计任意lo4"视野中的病毒颗 粒数. 2.修饰法按捕获法用拄血清包被铜刚,并与拭原反应后,甩20滴磷酿缓7申液轻轻冲洗铜网,吸干,膜 面朝下,置于用磷酸缓冲液稀释20倍的同种抗血清上,室温下孵育半小时,再甩20滴重蒸水冲洗,5滴1轴 pH7.0磷钨酸负染,电镜观察. 用正常鬼血蒲作为对照. 结果 一 ,BaYMV,W$S~IV和WyMV的血清学关系用BaYMV—XShWSSMV—AJ和 WYMV—chA3个分离物作为此种病毒的代表,与BaYMV-XShBaYMv.J,wYMV— JWSSMV—C的抗血清和BaYMV—W,BaYNV—s的IgG进行捕获和修饰的方阵测定试验, 并以缓冲液和正常兔血清作为阴性对照.4次重复.结果表明(表1):BaYMv—XSh抗血清 和欧洲血清型I株系BaYMV—JBaYMV—W的扎血清或IgG,都能有效地捕获BaYMV— XSh颗粒,而且修饰反应也很强烈}wYMV—J抗血清能有效地捕获B~YMV—XSh颗粒,但 不发生修饰反应}WSSMV-C的抗血清对BaYMV—XSh颓粒灼捕获能力较小,且不能修饰} 欧洲血清蝥I株系BaYMV—s的igG和正常免吐清样,既能捕获,也不能修饰BaY'~IV- XSh颗粒.wYMV—J和WSSMV—c的抗血清既能有效地捕获,又能强烈地修饰WSSMV— AJ颗粒,BaYMV—J抗血清能有效地捕获WSSMV—AJ粒,但修饰反应较 弱,BaYMV— XSh和BaYMV—W的抗血清或IgG也能捕获WSSMV—AJ撷粒,但不能修饰,BaYMV—S的 IgG和正常免血清以及缓冲液均不能捕获和修饰WSSMV—Aj颗粒.BaYMV—J,WYMV—J 私wSSMV—c抗血清能有散地捕获汁液中的wYMV—chA颗粒,也能强烈地修饰WYMV— 3期应用免疫设附电镜技术研究三种真菌传绒状病毒的血清学关系241chA颗粒,BaYMV—YSh~BaYMV—w抗血清或1gG也对其具有强大的捕获能力,但不能 修饰lBaYMV—S~IgG,正常兔血清以及缓冲液不能捕获和修饰此病毒颗粒. 衰1一些同蔼和异潦抗血清对三种真葛传钱状病毒的捕获和修饰作用 Tab.iParticletrappinganddecorationofthteefungustransmittedfilamenou$ ofcerea1sviruseswithhornologousandheterologousantlsera 注?1.30000倍下10个期野中所检到的病毒颗粒总数,4次重复平均数o 2.修饰强度t…强烈,++中等,+徽弱,一没有修饰怍用. NorelI.bieansoftotal~umberinfourrepeatsofpartlelestrappedon10EMfieldsat 30000x. 2.Decorationintensity,…strong}+middle}+weak!一ttodecoration. =,BaYMV各分离物的血清型用BaYMV—XSh,JSh,ShH,YZh,YCh和ChSh 6个分离物感病汁液,分别与BaYMV—XSh和欧洲划分的血清型I的J,W,So,NM和血清 型?的s,M株的抗血清或IgG进行捕获法和修饰法方阵测定,并以正常免血清和缓冲液作 为对照,4次重复.结果(表2)表明,这6个BaYMV分离物的血清型基本一致,能与BaYMV— XSh,J,W,So和NM等的抗血清或IgG发生强烈的捕获和修饰反应,而与BaYMV—s和M 的IgG或抗血清剐不发生反应, 说明 关于失联党员情况说明岗位说明总经理岗位说明书会计岗位说明书行政主管岗位说明书 都是属于欧洲划分的血清型I.表2中的病毒颗粒数量与 修饰反应强度受病汁液质量,发病期和抗血清质量及抗原抗体亲和力的影响.正常兔血清对 照中所检到的病毒颗粒数量极少,且没有修饰反应,缓冲液对照中找不到病毒颗粒. 裹2一些同源和异蔼抗血清对BaYMv~国分离物的捕获和修饰作甩 Tab2ParticletfappinganddecorationofsomeChineseBayMVisolaces withhomologousandheterologousantisei-a BaYbiV丹离物 BaYMVIsolates.XSh Xiaoshaa(XSh) Jiashah(JSh) Shanghai(ShH) Ya?gzhou(YZh) Yal,LchenYCh) Changshu(ChSh) BaYMV抗血清Antlserat0BaYMV ? J(I-WEG)(I-gS G)-S..NM 110…94…0173…33? 109…?074+83++ 150…12+0146…37+ 157…33…7?621…76+ 067…04+04817} 267…38+016…19++ 正常免血清 —— NDrmal ? MscrllD3 1? 0 o 3- 0 注?1和2同表1. 兰,WSSMV各分离物的血清学关系用wsSMV—XCh,AJ,YX,Yzh和YA个分 离物分别与BaYMV-J,WYMV—J,WSSMV—C和WSSMV-USA(贮于?甘油中)的抗 ?????? 蛆竹曲" 242病毒 血清进行方阵法捕获和修饰试验,并正常兔血清和缓冲液作为对照,4次重复.结果(表3) 表明,本研究所用的5个WSSMV分离物其血清学反应相同,均能-qWSSMV—c和WYMV—J 起强烈的捕获和修饰反应,也能与BaYMV—J发生捕获和修饰反应,但强度较前者为弱.它 们与WSSMV—USA的反应很弱,而对照中则找不到病毒颗粒. 表一些抗血清对几个WSSMwp国分离物的捕获和修饰作用 Tab.3ParticletrappiRganddecorationofseefa1ChineseWSSMVis0lates withsomeantisef WSSMV Is0iat~s 分离物抗血清Antiserato X[ngchang(XCh) Anii(An Y?xing(YX) Yangzhou(YZh) Ynan(YA) BaYMV?J 138++ 10g++ l2++ WYMV?JWSSMV.C 288… 36l… 501…371… 301…243… 228…143… 8…3l… 注l1和2同表1.NOteiland2a5tab1e1. WSSMV-USA 正常免血清 NOrmat 有关BaYMV,WYMV~IWSSMV之问的血清学关系,国外曾有过一些零星报道,l,e,l3), 表明这3种病毒具有共同的抗原决定簇,在血清学上有着亲缘关系.其中wYMV与WSSMV 的血清学关系比它们与BaYMV的关系更为相近.我们的实验也 证明 住所证明下载场所使用证明下载诊断证明下载住所证明下载爱问住所证明下载爱问 了这一点. 至于WSSMV和WYMV是否是同一种病毒,或者说WSSMV是否是WYMV的一个株 系.我们认为,尽管两者在症状,寄主范厨,病毒颗粒形态,浮力密度,汁液稳定性,内含 体以及血清学等方面有着共同的或相似的性质,但是,两者的外壳蛋白组分有着差异, WSSMV含有两种外壳蛋白亚基,分子量分别为30kd~H26.5kd[3),或0kd和 27kd(5),而 wYMV只含有一种亚基,分子量为3kd[3)或~okd(阵盘平等,未发表),所,要确定两者 到底是否是同一种病毒,尚需进行更深入的生物化学和分子生物学方面的研究.在此之前, 我们建议还是按两种病毒来考虑较为合适. 关于BaYMV,根据生物学和血清学性质,已确定了几十株系.在联邦德国,乃至欧洲, [?.它与从日本分离到的标准大麦黄花叶病毒(BaYMV—J)分布鹾广的是So株系 极为相烈或 一 致,并能和wYMV,WSSMV抗血清起反应.s.抹系病毒颗粒不稳定,摩擦按种很难或 几乎不发病.BaYMV-M株系剐较为稳定,摩擦接种发病率较高,并与BaYMV—So,J和 WYMV,WsSMV没有血清学关系.BaYMV—NM株系与so株系血清学相近,也不能摩擦 接种.Adarns等[113在英国所报道的Wiltshire(W)和Streatley(S)两个株系,前者其实就 是so株系,后者为M株系.在欧洲,根据这些株系的血清学特性,人们将它们划j}成血清型 I和I,并考虑分别给予新的字,即血清型埽为人麦黄花l干辅毒(BaYMV),血清型?称 为大麦轻温和型花时病毒(BaMMV)Ca~.我国发生的BaVMV,仅由禾谷多粘菌传于爵,脖擦 ,耐与血清型接种发病率较低,最适发病温度约为IB-C,诸性质与欧洲血清型I相似?完全 ????? 盯?{5;? 3期应用兑痤吸附电镜技术研究三种真菌传线状病毒的血清学关系 不同.血清学实验也表明,我国的BaYMV与血清型I相关,而与血清型I无关. 关于WSSMV,国外尚未划分血清型或株系.我国的WSSMV与本研究所用的WSSMV 两种抗血清均能发生反应. 本工怍各次实验条件虽相同(同一病例抗原,同样的抗血清,同样方法),但由于不同实 验所用毒源是来自发病期不同的植株,致使所捕获的病毒颗粒数量差异较大.发病初,盛期 (2月底至3月底)病麦花叶中病毒含量较高,发病后期(4月)病叶或盛期黄叶中病毒含量较 低. 最后值得提出的是,在本研究中,BaYMV-J抗血清既能有效捕获又能强烈修饰WYMV 和WSSMV颗粒,而和Efl'l同属血清型I的BaYMV—XSh和w抗血清,虽能捕获但不能修饰 WYMV和WSSMV,从而说明BaYMV—J与BaYMV—xSh和w存在着抗原性的差异,或者 说,BaYMV-J与wYMV和WSSMV的血清学关系,I~BaYMV-XSh和w与wYMV WSSMV的血清学关系更为密切.这可能与BaYMV和wYMV的起源和分化有关.BaYMV 和wYMV均首先发生于日本,在过去的几十年中一直认为只存在于日本C10,它们可能有 着共同的起源,从而其血清学性质几乎完全相同.而在欧洲和我国,由于气候耕作条件不 同,经过数年甚至数十年的适应,分化后,病毒结构或个别抗原决定簇可能发生了变化,从 而引起血清学性质的一些变异. 另外,我们在预备试验中,用贮存在50甘油中的BaYMV-W抗血清与BaYMV-xSh 病汁液进行免疫电镜测定时,发现在电镜视野中,病毒颗粒反差很弱,延长磷钨酸 染色时 间,反差并不增加J从病汁液中捕获到的病毒颗粒数量也不多,经修饰后,病毒颗粒 表面的 "外套"既薄又淡,甚至看不出有"外套.用贮存在50甘油中的WSSMV-USA抗血清 与WSSMV—YA进行同样的实验,结果也相似.随后.分别用不含甘油的 BaYMV-W和 WSSMV-USA的IgG代替抗血清,则病毒颗粒反差显着加强,所捕获到的病毒颗粒 数量也 显着增加,"外套也明显多了.由此可见,抗血清中甘油的存在,对抗血清捕获及修饰 病 毒颗粒的能力有着显着的干扰或抑制作用,并对负染效果也有一定的影响. [1] [2] [8] [4] 参考文献 UsagiTandSaitoY.A11.11PhytOpathSOCJapanl42l12,1976 阮义理,龟登迪_植物病理,13;49,1983 HtlthWlVirR$~Swi[bfungalvctorslp61—70,edbJ.I.COOperandM.JC.Asher,Ass— ociationofAPP1ledBio1Oglsts,Englandl1988 Kenda11TLandL0mille1SA,Virustswithfungalrectors,p37-60,tdbJ.I.COOperand M.J.CAsherlAsSOCiati0nOfAPplledBio1ogists,England,1988 陈剑平等I病毒学杂志,2l176,1980 UsagiTandSaltoYlAriftPhytOpathSOCJapan,{5t397,1979 UsugiTandSaitoYA1111Phyt0pathSocJapan,47t581,1981 FajiiSeta1tAtinphytopathSocJapan)33l105,1987 陈壹平等;浙江农业科学,5l239,1988 S1ykhuisJT,Phyt0path010gY,60l319,1970 AdamsMJeta1,PIantPathoIogyl36l610,1987 HaulFerKZFalbrlgJ)tDWIPlanEDisease,67t988,1983 HateWetalIPbyt0pathologls~heZeitshrft,111}37,1984 UsaglT.V~ruseswithfungalvectorslp2I3-226.edb,J.1.CooperandM.J.C.Asher?As— soclationofApplIedBiologists?Englaad,1988 ]]]]]]]]]]?????啪? {}l[ 病毒6卷 SER0L0GICALRELATj0NSHIPSAMONGTHREE FUNGUS—TRANSMITTEDFILAMENT0US VIRUSESOFCEREALSBYjMMUNO- SORBENTELECTR0N MICR0SC0PY ChenJianplngRaanYiliHongJian XuJianhuan Theserologicalrelationshipsamongthree_Potymyxagramihis..transmit'. tedfilamentousvirusesofcereals,eg. barleyyello?mosaicviras(BaY— MV),wheatyellowmosaicvirus(WYMV)andwheatspindlestreakmosaic virus(WSSMV)wereinvestigateduslngimmanosorbentelectronmicroscopy. Theresultsshowedthatallthesevirusesseemtoposs8SSsomeantigenic determinantsincommonandcrossreactionswitheachother.Al1ofthe sixisolatesofBaYMVfromxiaoshun(XSh),Jiashan(JSh),Shanghai (ShH),Yangzhou(YZk),Yanckeng(YCh)andChangshu(ChSh)show— edstrongreactionwithantisereagainsttypicalstrainfromJapan(BaYivlV一 】),Europe(BaYMV—So,orWiltshire(W)and—BaYMV—NM),indicating thattheChineseBaYMVisolateswerecloselyrelatedtooridentica1with representativesofserotYpe1whi'chineludedBaYMV—J,SoorWandNM. TheflveisolatesofWSSMVfromXingcheng(XCh),AnJi(A】),Yixing (YX),Yangzhou(YZh)andYaan(YA)wereidentiealiaserologiealpro— Dertiesandcoa1dreactwithbothAmerleanandCanadianantiseratoWS— SMV.Theinfluenceofglycerolasapreservativeinantisera0nimmuIlo— sorbentelectronmlcroscopYwasdiseassed. KeywordslBarleyyellowmosaicvirus(BaYMV)Wheatyellowmosaic virus(WYMV)Wheatspindlestreakmosaicvirus(WSSMg) Serologica1relationshipImmanosorbentelectronmlcroseopy 1.Viro|o,qYLaboratory,Zfieiian9AcademyofAgrlcufturalSciences'Hangzhou 2.EIectroMicro$copYLaboratory,ZhejiangdgriculturafUniversity,Hanazfiou