【doc】 PCR—RFLP检测皮肤分枝杆菌

【doc】 PCR—RFLP检测皮肤分枝杆菌 PCR—RFLP检测皮肤分枝杆菌 科杂志2005年9箜38—9—~—C—h.inJ——Derma—t—ol,September2005 PCR—RFLP检测皮肤分枝杆菌 李晓杰王洪生吴勤学崔盘根刘训荃 【摘要】目的建立检测8种常见皮肤分枝杆菌的PCR—RFLP方法.方法?用通用引物对分枝 杆菌的热休克蛋白hsp65基因序列进行PCR扩增;?用限制性内切酶BstE?和Haem对扩增产物进行消 化.根据所得片段确定各分枝杆菌特征性的酶切图谱,从而对分枝杆菌进行鉴别.结果8种常见皮肤分 枝杆菌感染 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 株(鸟,胞内,堪萨斯,结核,瘰疬,海,偶发,龟分枝杆菌)的酶切图谱与文献报道一致.结 论PCR—RFLP方法可用以检测鉴定皮肤分枝杆菌. 【关键词】分枝杆菌,结核;分枝杆菌,鸟;分枝杆菌,非典型性 DevelopmentofPCR—RFLPforIdentificationofEightMycobacterialSpec iesLIXiao-jie,,vG Hong-sheng,WUQin—xue.CUlPan—gen.LIUXun—quan.InstituteofDe rmatology,ChineseAcademyofMedi— calSciencesandPekingUnionMed&alCollege.Nanjing2l0o42.China 【Abstract】 0bjectiveTodevelopaPCR—RFLPmethodfortheidentificationofeightmycobacterial species.nethodsPCRwasperformedtargetingthegeneencoding65一 kDaheatshockproteinwhichwas eommontoallmycobacteria.Tworestrictionenzymes,BstE?andHae ?,wereusedtodigestthePCRprod— ucts.andspecificrestrictionpatternsofdifferentmycobacteriawereobtained.ResultsThespecificrestriction patterns0fdifferentmycobacteriawereidenticaltothedatapreviouslyreported.ConclusionWecoulddif- ferentiateM.avium,M.ntracellulare.M.kansasii,M.tuberculosis,M.scrqfulflceum,M.marinum,M.fortuitum and肘.chelonaeinoneexperimentbyPCR—RFLP. 【KeYwords】 Mycobacteriumtuberculosis;Mycobacteriumavium;Mycobacterium,atypical PCR和多重PCR,虽然快速,敏感,特异,但与 探针杂交方法一样.有些分枝杆菌目前尚无满意的 引物.在一定程度上限制了该方法在临床检测和鉴 定中的应用.因此有必要建立其他方法以补充单一 PCR或多重PCR的不足.聚合酶链反应一限制性片 段长度多态性分析(PCR—RFLP)是一种快速,准确 的分枝杆菌鉴定方法.该方法无需特殊的仪器设备, 可为临床实验室作为常规鉴定之用.鉴于以上原因. 我们采用以分枝杆菌hsp65基因为靶序列的PCR— RFLP方法.对已报道可引起皮肤感染的致病 菌——鸟,胞内,堪萨斯,结核,瘰疬,海,偶发,龟分 枝杆菌进行菌种鉴定.建立这些标准菌株的酶切图 谱.为以后对临床分离株的检测和鉴定打下基础. 材料与方法 一 ,菌株来源及培养 标准菌株鸟分枝杆菌(avium),胞内分枝杆 菌(intracellulare),瘰疬分枝杆菌(scrofulaceum), 偶发分枝杆菌(fortuitum),龟分枝杆菌( 作者单位:210042南京,中国医学科学院,中国协和医科大学皮 肤病研究所 通讯作者:吴勤学.E—mail:wuqx2003@hotmail.eom 533 ? 论着? chelonae)来自北京结核和胸部肿瘤研究所;标准菌 株堪萨斯分枝杆菌(kansasii),结核分枝杆菌( tuberculosis),海分枝杆菌(mo2”inum)为我所实验 室保存株.各标准菌株传代,接种于Lowenstein— Jensen(L—J)培养基斜面上,根据其最适生长温度分 别放于32?和37?培养. 二,RFLP所用主要试剂 限制性内切酶BstE11,Haem购自MBI公司. 三,PCR扩增分枝杆菌热休克蛋白基因(hsp65) (一)DNA模板的制备:收集丰富生长的细菌. 无菌操作.加适量无菌蒸馏水,用组织研磨器研磨, 制成细菌悬液.取少量细菌悬液涂片,抗酸染色后计 数,计算m浓度.采用冻融法提取细菌DNA,即液氮 冷冻1min.沸水煮沸1min,反复5次.其中最后1 次煮沸10min.离心后取上清,一20?保存备用. (二)PCR反应体系:主要含10×TaqDNA聚 合酶反应缓冲液5IxL,dNTPs(各10mmol/L)1ILL, TaqDNA聚合酶1U,上游引物1p~L(50pmo1).下 游引物1~L(50pmo1),模板DNA10IxL.引物为分 枝杆菌的通用引物:上游:5一ACCAACGATGGTGTG TCCAT一3.下游:5一CTTGTCGAACCGCATACCCT一 3.PCR循环条件:预变性94?5min.然后94? ll11it1.6(】I 献诞f【{I721 IJkl,RI?II浊橙删8种舒敞”准株 lIz1l体系】垃钿l:缓}llI澉1{/缓冲液 (I2.5l1.I:nH-lll5L』,IJ({物l0【,枷火 蒲双蒸水至25L反条件:37仉温3l1 2,PCl{111,I.物的幢洲:川l×TRF制馨 2lalIt…r琼l旨精凝腔,05g/mL;收l0 『IcI物.加凡6×I】,A【-Cf缓液.fF~.:?Jid- {=_:f.:『U泳:缓}l1l液1xr?10()V,1Iin;长波紫 外J上J下州察绡并扪照,”水j,j址(1()【I】f10 1?耵1t?m圳荆. .【.的酶片段形战』杆r1特的嘶阿谱( 1.2.是? lll jflI卜 30{ m 图I屹他JI:1T?.牲 抓舵棼删桁lIIHl_?l:I—s:l 转分鞋朴尚嗣_I;1j刈州:6,II 断,聃性计娃I{=f?扑rJ??:II ?辨屿{If生” 萄钟 舒技朴 地廿般剌 世舒礼ch .砖??挫朴 瘰}础剌 „杖fr 鸺发仆桂什 1琶讣性轩 仕}_P:jlJ(11一hFIIJ赆M: 】警kiJ0.?向萨 【1llIfIIj.A吗啦内崭 I4h,I65I:段.僻班由 Ilslf:l【一-?5 245;221) 5,l15,lIXI ,:l? 24125/?gr) 245,?22I} 245/221} j51_20/81) i_?_?il…:?5III l4l_l l55,l40~州I I4IlI)5180 l6ll,l40/7(I ljI35,q I},l】5f8cl 155,I35 4(1【卜 c】【卜 图21I惴,缸性}l南I?c|lf—lit【ll}鞋:罄 II蚶-]O0bl—J:l,5:IEI1嘶叫.1救匀卓{I海删发衄j艘”苗 Il1.时烈:6,10:It11耐.,镩,假蕾电仆枉? 跬?,14:而s”瑚f矬,他墩如聃.悔僻盐乜特性 我们参照I?l111i等.?法.啦川PCl{一l{FII方 法刮l-『fj1f,肤感染的,L-,I靖养堆E叶:}乇的8种 分枝杆陌柄l:株拔吗瞧内,堪萨斯,瘰 惭,海,电鸺发舒杖朴进{J_种蔡定,敏感可 达10个前细胞/m].多敞复试验所J:q:的融切片 段柑.计l【』史i酞报道以技lf?[elile[1.饷的酶 l』J瞒一敛.IJ】陵法稳定Il椎,可JII卜时分枝杆 萧临床分离株进行l?Pl惦定 为舒枝杆菌1I(.IIJIA,广的片段圩于量 一 艘较小.这此段分子量比较接近,IIIJ,[[L需要 高分辨半的蕊胶进{j电泳我”】采}}j2错Meiaphor 琼脂搪凝胶r乜脉,符片段晰分r棚盖5hi?的 “段亦能删Jf来山fr报道胁J物川lJsv 3:】琼1特凝胶j{r电泳,条惜舒辨半电较高我 也曾采川8%的非rj:聚lq烯I接凝胶电泳后进行 硝酸银染色n0力.洼..述两种1精凝胺帐比,后 行操作婴复杂得多,f?银染h法f?舒敏感.根据我 的实验结果.我?以川银染的法检测酶l刀产 物也会提高敏感. 与他多数桂定.中薹分枝柑菌复台群( luberrt小?M.fu?rtm,M.hrlr.M}Jl”LsBCG1 1?1~9h法I}CI{色{法和I6Srl{,A序列分一样, nR一}il-?lP山不能将结坎{:f=』鹱台群中的他细 蔺I别..,.这山『乏映r浚复台群巾的各菌仵摹】 序列的商瞍牛H似性方法的一缺点是通用l 物FI1It:11r…2还I可以增除j}枝杆菌外某些黛 他微生物的65000热休克i坫『mjf『已址实的 巴讲I~i;i,闩色链霉相I,0球蔺t种缃茁:但 于650oo赁『】高度俅勺.pII~?19特点.推测麒他肢线 茼也-可能扩增l性.为培养雠l胜(19~lfl菌埘者要 在PCI{l{l??L},鉴定之前尤被证实为扭脯.而阻迄 2005年9月第38卷第9— Chin— JDermatol,September2005,Vol38,No.9 今为止尚未发现酶切图谱与已经建立图谱的分枝杆 菌相混淆的非分枝杆菌,因此除分枝杆菌外的其 他微生物的hsp65基因扩增阳性不会影响PCR— RFLP方法用于分枝杆菌的鉴定. 参考文献 1TelentiA,MarchesiF,BalzM,etal.Rapididentificationofmy- cobacteriatothespecieslevelbypolymerasechainreactionandre- strictionenzymeanalysis.JClinMierobiol,1993,31:175—178. 2TaylorTB.PattersonC,HaleY,eta1.RoutineuseofPCR—restrie- 535 tionfragmentlen~hpolymorphismanalysisforidentificationofmy- eobaeteriagrowinginliquidmedia.JClinMicrobiol,1997,35:79— 85. 3KirschnerP,SpringerB,VogelU,eta1.Genotypicidentificationof myeobacteriabynucleicacidsequencedetermination:reportofa2一 yearexperienceinaclinicallaboratory.JClinMicrobiol.1993.31: 2882-2889. 4王洪生,李晓杰.吴勤学,等.四种分枝杆菌快速检测方法的研究. 中华皮肤科杂志.2005,38:285—287. 5WallaceRJJr,BrownBA,BlacklockZ,eta1.NewNoeardiataxon amongisolatesofNocardiabrasiliensisassociatedwithinvasivedis- 1533. ease.JClinMicrobiol,1995,33:1528— (收稿日期:2004—09—07) Sweet综合征23例的临床与病理分析 曹育春伍婕杨敏有朱学骏 Sweet综合征又称急性发热性嗜中 性皮肤病.诱因不同可出现不同的临床 表现.我们对北京大学第一医院皮肤科 诊治的23例Sweet综合征患者进行回 顾性分析.以探讨其临床与病理特征. 一 ,对象和方法 23例Sweet综合征患者均为1999 年1月至2003年12月期间在北京大学 第一医院皮肤科确诊病例,有完整的病 史记录及半年以上的随访记录,临床表 现和病理学检查符合Sweet综合征诊断 标准….复习其病理切片,并对患者的一 般情况,可能诱因,主要症状,皮损特点, 临床诊断,病理诊断及对治疗的反应等 资料进行统计分析. 二,结果 (一)一般资料:23例中男l0例,女 l3例.年龄l7,73岁,平均年龄(45.1? 13.9)岁,病程12,108d,平均(17.8? 24.6)d. (二)临床特征: 1.皮损表现:23例均有暗红,淡红 至鲜红色浸润性丘疹,斑块,结节,皮损 呈环形,半环形.皮损为单发者l6例,多 发者7例.3例面部单发皮损者在皮损边 缘可见假性水疱.1例可见少许脓疱伴结 作者单位:100034北京大学第一医院皮 肤科[曹育春(进修医师,现在武汉华中科技 大学同济医学院附属同济医院皮肤科, 430030),伍婕(进修医师),杨敏有(进修医 师),朱学骏] 痂.所有病例未见有溃疡,坏死现象.皮 损部位在头,面,颈部l2例,躯干上部3 例,仅在上肢者5例.仅在双下肢者l 例,双上肢及双下肢均有者l例,泛发全 身l例.皮损自觉灼痛或疼痛9例,痒痛 感4例,无症状l0例. 2.其他表现:发热仅有3例,体温 在38.2,39.5?之间.伴关节痛2例.伴 肾损害l例(蛋白尿),伴胸闷,咳嗽l 例,伴白血病l例.复发5例中4例有皮 肤外表现 3.实验室检查:外周血仅白细胞计 数升高(0.8×lOlL)5例,仅中性粒细胞 比例升高(>0.7)7例;而白细胞计数及 中性粒细胞比例均升高3例.均正常8 例.红细胞沉降率升高(>20mm/1h)23 例.C反应蛋白(+)l8例. (三)组织病理学特征:23例中除2 例表皮有轻度海绵样水肿外,其他表皮 大致正常.23例真皮乳头均呈现不同程 度水肿,有稀疏中性粒细胞浸润,伴少许 淋巴细胞和嗜酸粒细胞.其中有2例可 见表皮下水疱.在真皮网状层血管及附 属器周围,23例中均有致密中性粒细胞 浸润,其中呈结节状l4例.呈弥漫性9 例,部分可见核尘及淋巴细胞,嗜酸粒细 胞,而病史较长的皮损还可见少量组织 细胞.血管壁内皮细胞肿胀l3例,均未 发现血管壁有纤维素样物质沉积.皮下 组织浸润2例 三,讨论 ? 短篇论着? 目前,根据诱因不同,Sweet综合征 分可为三型,即经典型(与感染,尤其是 上呼吸道感染有关),恶性肿瘤相关型, 药物诱导型.虽然Sweet综合征的病因 和发病机制目前不清,但其临床表现,病 程及组织病理提示该病是一种对细菌, 病毒或肿瘤抗原的超敏反应.组织中大 量的中性粒细胞浸润与白细胞趋化因 子,化学趋化因子和某些细胞因子有 关..本组Sweet综合征患者的临床表现 存在较大差异.本组仅有皮肤表现者l8 例,有皮肤外表现者5例,象胸闷,咳嗽 这样的皮肤外表现应进一步明确是本病 的表现还是伴发病的表现.23例患者的 组织病理有高度的一致性,即在真皮网 状层血管或附属器周围均有致密的以中 性粒细胞为主的呈结节性或弥漫性浸 润.复发|l生Sweet综合征与恶l生肿瘤有关. 因此对伴有皮肤外表现者应注意随访. 参考文献 1yondenDrieschP.SweetSsyndrome(acute febrileneutrophilicdermatosis).JAmAcad Dermato1.1994.31:535—556. 2周淑华,林麟.Sweet综合征的临床研究进 展.中华皮肤科杂志.2001.34:314—315. 3Reuss—BorstMA,PawelecG,SaalJG,eta1. SweetSsyndromeassociatedwithmyelodys— plasia:possibleroleofcytokinesinthe pathogenesisofthedisease.BrJHaematol, 1993.84:356—358. (收稿日期:2004—09—04)