浅论反相高效液相色谱法同时检测人血浆利多卡因和罗哌卡因

浅论反相高效液相色谱法同时检测人血浆利多卡因和罗哌卡因 浅论反相高效液相色谱法同时检测人血浆利多卡因和罗哌卡因 作者: 陈丽梅，徐旭仲，刘乐，王权光，胡国新【摘要】 目的:建立人血浆利多卡因和罗哌卡因的高效液相色谱分析方法。方法 : 高效液相色谱仪为Agilent 1100系列;血浆碱化后经乙酸乙酯萃取浓缩，以 ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm，5μm，Agilent，USA)为色谱柱;以乙腈?0.02 mol?L-1 KH2PO4(16?84，V/V)为流动相，流速为 1.0 ml?min-1;检测波长为210 nm;内标为布比卡因。结果: 利多卡因和罗哌卡因浓度在0.05,10 mg?L-1范围内线性关系良好(r =0.999);最低检测限为0.05 mg?L-1;两种药物高、中、低3个浓度的平均相对回收率分别为(99.79?2.94)%和(100.32?2.95)%;平均绝对回收率分别为(68.36?4.63)%和(70.87?4.88)%;日内精密度变异系数分别为(0.86?0.43)%和( 1.36?0.77)%，日间精密度变异系数分别为(2.07? 1.45)%和( 1.43?0.23)%. 结论: 本方法快速、简便、灵敏、准确可靠，适用于血浆利多卡因和罗哌卡因的同时测定及其临床药代动力学研究。 利多卡因;罗哌卡因;反相高效液相色谱法;人血浆;药代动力 【关键词】 学 Abstract: Objective: To develop a high performance liquid chromatography method for the simulta-neous determination of Lidocaine and Ropivacaine in human plasma. Methods: High performance liquid chromatography was equipped with Agilent 1100 series. Lidocaine and Ropivacaine were extracted from plasma with acetic ether after alkalization. The analytical column was packed with ZORBAX EclipseXDB-C18(4.6 mm×150 mm，5μm，Agilent，USA). The mobile phase was consisted of acetonitrile-potassium phosphate buffer (0.02) (16:84， V/V) and the flow rate was 1ml?min- 1. The UV detection wavelength was 210 nm. The internal standard was Bupivacaine. Results: Excellent linear relationship was obtained from the range of 0.05 mg?L-1 to 10 mg?L-1(r =0.999). The limit determination of Lidocaine and Ropivacaine was 0.05 mg?L-1 and the average relative recovery were (99.79?2.94)% and (100.32?2.95)%，respectively. The average absolute recovery were (68.36?4.63)% and (70.87?4.88)%，respectively. The intra-day precision RSD were(0.86?0.42)% and( 1.36?0.77)%，respectively ;the inter-day precision RSD was (2.07? 1.45)% and ( 1.43?0.23)%，respectively. Conclusion:The method is simple，rapid，and accurate. It can be used to determine the Lidocaine and Ropivacaine concentration simultaneously in human plasma and for studying of their pharmacokinetics. Key words: lidocane;ropivacaine;high performance liquid chromatography;human plasma;pharmacokinetics 利多卡因和罗哌卡因分别为中效和长效酰胺类局麻药，临床上为了达到更短的起效时间和合理的持续时间，往往将这两种局麻药联合用于神经阻滞[1-3]。已有高效液相色谱法单独检测利多卡因和罗哌卡因的报道，但是腰丛-坐骨 神经阻滞中同时测定两药浓度尚未见报道。本实验建立了碱化萃取后进样同时测定人血浆利多卡因和罗哌卡因的高效液相色谱检测方法，具有操作简便、测定速度快等优点，便于推广使用。 1 材料和方法 1.1 仪器 高效液相色谱仪为Agilent 1100系列(Agilent，Germany)，包括:G1311A四元泵，G1322A 在线脱气机，G1316A柱温箱，G1315B二极管阵列检测器，G1313A自动进样器，Agilent化学工作站(Rev A.08.03.[847])。 电子分析天平(AB204-A，梅特勒-托利多上海仪器公司，灵敏度0.1 mg);漩涡混合器(XW-80，上海医科大学仪器厂);高速离心机(TGL-16G，上海安亭科学仪器厂) 1.2 试剂和药品 甲醇(色谱纯，天津市四友精细化学品有限公司产品，061115101)，乙腈(色谱纯，天津市四友精细化学品有限公司产品，070226101)，乙酸乙酯(色谱纯，天津市四友精细化学品有限公司产品，060822101)，氢氧化钠(分析纯，天津市化学试剂三厂，20171216)，磷酸二氢钾(分析纯，汕头市金砂化工有限公司，20170301)，磷酸(分析纯，宜兴市第二化学试剂厂，060301)，三乙胺(分析纯，上海三爱思试剂有限公司，060830)，实验用水均为超纯水。 利多卡因化学对照品(含量为93.5%，中国药品生物制品检定所提供)，罗哌卡因化学对照品(含量为99.8%，由阿斯利康制药有限公司提供)，布比卡因化学对 照品(含量为99.5%，山东华鲁制药有限公司提供)。 1.3 溶液的配制 1.3.1 利多卡因和罗哌卡因 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 品溶液的配制: 用灵敏度为0.1 mg的电子分析天平准确称取利多卡因标准品25 mg于50 ml容量瓶中，用超纯水溶解并定容，得浓度为0.5 g?L-1的利多卡因标准储备液。然后稀释成50，5，0.5 mg?L-1的标准应用液。以同样方法配制罗哌卡因标准储备液及标准应用液，贮存于4 ?备用。 1.3.2 布比卡因标准品溶液的配制: 布比卡因标准品于干燥器干燥至恒重。用灵敏度为0.1 mg的电子天平准确称取布比卡因标准品50 mg，用超纯水溶解，于50 ml容量瓶内定容，最终浓度为0.5 g?L-1布比卡因标准储备液。然后稀释成浓度为50 mg?L-1的标准(内标)应用液，贮存于4 ?备用。 1.3.3 0.02 mol?L-1 KH2PO4溶液: 准确称取KH2PO4?2H2O 2.7218 g，加入三乙胺1 ml，用磷酸调节pH=4.0，用超纯水溶解后于1 000 ml容量瓶内定容。 1.3.4 5 mol?L-1 NaOH溶液: 准确称取NaOH 10 g，用超纯水溶解后于50 ml容量瓶内定容。 1.4 色谱条件 色谱柱: ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm，5μm，Agilent，USA)，流动相: 乙腈:0.02 mol?L-1 KH2PO4=16:84(V/V)，pH=4.0，流速: 1 ml?min-1，检测波长为210 nm，参比波长380 nm，柱温: 35 ?。 1.5 血浆样品的处理 准确吸取待测血浆样品 1.0 ml于10 ml具塞试管中，加入50 mg?L-1布比卡因内标工作液30μl，混匀后加入5 mol?L-1 NaOH 溶液40μL。再加入乙酸乙酯4.0 ml，漩涡混匀1 min后2 500 r?min-1离心10 min。转移上层有机相于另一刻度离心管中，37 ?水浴条件下氮气流吹干。用150μl流动相复溶，取上清液100μl于自动进样器的样品瓶中，设定20.0μl进样检测。 2 实验结果 2.1 HPLC图谱 利多卡因和罗哌卡因纯标准品、空白血浆、利多卡因和罗哌卡因血浆标准以及病人血浆样品，经HPLC分析测定得到的色谱图见图1。由图可见在本实验条件下，利多卡因和罗哌卡因的色谱峰能完全分离，没有明显的内生杂质峰干扰。利多卡因的保留时间为4.5 min，罗哌卡因的保留时间为9.7 min，内标的保留时间为19.5 min。可见本方法具有较高的专属性。 2.2 标准曲线的制备及线性范围 取8只10 ml具塞试管，依次加入不同浓度不同体积的利多卡因和布比卡因标准工作溶液，再加入空白血浆 1.0 ml，配成浓度相当于0.05，0.1，0.2，0.5， 1.0，2.0，5.0，10.0 mg?L-1的血浆样品，再按“ 1.5项”血浆样品处理方法处理后，进行分析得色谱图。以测得的利多卡因峰面积与内标布比卡因峰面积之比(Y)对血浆药物浓度(C)进行线性回归，得利多卡因的标准曲线回归方程(n=8): C=0.731Y+0.015(r=0.9995)。同样的方法得罗哌卡因的标准曲线回归方程(n=8): C=0.928Y+0.052(r=0.9992)，表明在血药浓度0.05,10μg?ml-1范围内利多卡因与罗哌卡因均呈良好的线性关系。最低检测浓度为0.05μg?ml-1。 2.3 精密度实验 配制浓度0.1，0.5，5 mg?L-1的利多卡因和罗哌卡因血浆标准品溶液，平行5组。按“ 1.5项”处理后于同一日内测定，计算日内精密度;连续5 d内测定，计算日间精密度(结果见表‎‎1)。2.4 回收率实验 2.4.1 相对回收率试验: 配制浓度0.1，0.5，5 mg?L-1的利多卡因和罗哌卡因血浆标准品溶液，平行5组。按“ 1.5项”处理后进样测定;依据标准曲线计算各自的浓度，计算相对回收率(结果见表2)。 2.4.2 绝对回收率试验: 分别配制浓度为0.1，0.5，5 mg?L-1的利多卡因和罗哌卡因标准品溶液，取20μl进样检测、记录各自的峰面积，为纯标的峰面积;再配制浓度0.1，0.5，5 mg?L-1的利多卡因和罗哌卡因血浆标准品溶液，平行5组。按“ 1.5项”的血浆样品处理方法处理后测定，记录相应的峰面积为该浓度血浆标准的峰面积。以血浆标准的峰面积与纯标的峰面积的比值计算绝对回收率(结果见表2)。 2.5 药物干扰试验 取10 mg?L-1利多卡因和罗哌卡因100μl，分别加入10 mg?L-1安定、氯胺酮、芬太尼、咪达唑仑、阿托品、麻黄碱、曲马多、万可松、异丙酚和肝素钠100μl后，用上述色谱条件检测，利多卡因和罗哌卡因的保留时间无明显改变，且互不影响。 3 血药浓度的测定 选择肝肾功能正常，实施坐骨 陨窬 柚偷南ゼ跋ス亟谝韵率质醯牟??0例。在局麻下实施桡动脉置管，采集血样。采用神经刺激器定位行改良骶旁坐骨神经阻滞和后路腰丛阻滞。两枚神经刺激针定位准确后，坐骨神经定位点先注射2%利多卡因(浙江诚意药业有限公司，批号: 20170606)10 ml，随后立即追加0.75%罗哌卡因(瑞士阿斯利康制药有限公司，批号: X980550)10 ml;腰丛用药为0.5%罗哌卡因30 ml。在给药前、给药后5，10，15，20，30，45，60，120，180，360 min采集桡动脉血2 ml于含有EDTAK2的真空采血管中，立即充分振摇，离心(2500 r?min-1)15 min，分离血浆，于-20 ?冷冻保存至测定。取血浆1 ml，按“ 1.5”项下操作，进行HPLC分析，通过标准曲线计算利多卡因和罗哌卡因的血浆药 奔淝 呒 ?。 物浓度。两药药代动力学参数见表3，血药浓度 4 讨论 本研究建立了同时检测血浆利多卡因和罗哌卡因浓度的高效液相色谱分析的方法，专属性高，分离完全;相对回收率在100%附近，绝对回收率大于65%，日内、日间精密度RSD均小于15%，符合生物等效性指导原则关于生物样品分析方法的基本要求，可用于临床上利多卡因和罗哌卡因人体药代动力学血药浓度检测。 目前，检测生物样本中罗哌卡因和利多卡因的方法有多种，国外文献报道有高效液相色谱分析法[5-6]，也有少量气相色谱分析和液相质谱联用检测的报道。本研究采用HPLC紫外检测法，并对提取方法和色谱条件进行了改进。 Agilent ZORBAX Eclipse XDB色谱柱-C18采用专利的工艺进行超密键合和双封端，保护流动相pH对超纯硅胶的溶解，尽可能覆盖 [1] 李挺, 金勉, 徐旭仲, 等. 腰丛 巧窬 柚陀糜诶夏瓴?? 下肢手术[J].温州医学院学报,2017,35 (5):376-378. 郭献阳, 徐旭仲, 陈丽梅, 等. 罗哌卡因单用及复合不同浓度利多卡因对坐骨神经起效时间的影响[J]. 温州医学院学报,2017,37 (3):240-243. 郭献阳, 徐旭仲, 陈丽梅, 等. 序贯法测定坐骨神经阻滞起效时间限定的利多卡因半数有效量[J]. 中华医学杂志,2017,88 (9):594?96. 肖洁, 王祥瑞, 蔡美华, 等. 盐酸罗比卡因腰丛-坐骨神经阻滞的药代动力学研究[J].临床麻醉学杂志,2017,21 (11):731-733. 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