【doc】高效液相色谱法测定猪血浆及组织中喹赛多及其脱二氧代谢物

【doc】高效液相色谱法测定猪血浆及组织中喹赛多及其脱二氧代谢物 高效液相色谱法测定猪血浆及组织中喹赛 多及其脱二氧代谢物 中国兽医2003年7月第23卷第4期ChindVetSciJuly2003Vo1.23No.4363 高效液相色谱法测定猪血浆及组织中喹赛多及其脱二氧代谢物 邱银生,袁宗辉.,范盛先,刘登才,黄玲利,殷居易(华中农业大学兽药研究所,湖北武汉430070) 摘要:建立了测定猪血浆及肝脏,肾脏,肌肉等组织中的喹赛多及其代谢物脱二氧喹赛多的高效液相色谱(HPLC)法. 血浆样用甲醇沉淀蛋白后离心取上清液进样测定.组织样先用乙腈匀浆,用正己烷脱脂后作HPLC 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 .色谱柱为 ODSC】8柱;流动相血浆样测定为乙腈:水(20:80),组织样测定为甲醇:水(42:58),流速为1.0mL/min;紫外检测 波长305D.m.药物工作液质量浓度范围为0.005~0,500mg/L时,血浆样品及组织样品测定条件下药物质量浓度与 响应值均具良好线性关系,相关系数>O.999.血浆中药物质量浓度为0.02,0.10,0.50mg/L时,喹赛多及脱二氧喹 赛多的回收率均大于7O,组织中药物含量为0.05,0.20,1.00g/g时,肌肉样品的回收率均大于7O,肝脏,肾脏 样品则为5O,8O.本试验条件下,喹赛多及其脱二氧代谢物的最低检出质量浓度,血浆样品分别为0?01,0?02 mg/L,组织样品2种检测物均为0.025g/g.测定了工作液3种质量浓度o.Ol,o.05,o.25mg/L的仪器精密度,日内 相对偏差<8.0,日阃相对偏差<17.0. 关键词:喹赛多;脱二氧喹赛多;血浆;组织;猪;高效液相色谱 中圈分类号:S859文献标识码:A文章编号:1005—4545(2003)04-0363-03 喹赛多为喹喔啉类抗菌促生长饲料添加剂,用于猪,牛, 禽等动物[】].本类药物具有1,4一二氧化物的基本结构,在猪体 内的初级代谢为脱氧代谢,生成脱一氧和脱二氧代谢物.猪血 浆及组织中同类药物及脱二氧代谢物的测定方法已有报 道[2],尚未见喹赛多的有关报道.本试验旨在为开展本品在 猪体内的药物动力学及组织残留研究工作,建立测定猪血浆 及组织中喹赛多及其脱二氧代谢物的高效液相色谱方法. 1材料与方法 1.1药物与试剂喹赛多原料(批号20000620,含量 99.0),脱二氧喹赛多原料(批号20010320,含量98.0), 均由华中农业大学兽药研究所合成;乙腈,甲醇,正乙烷等,均 为分析纯. 1.2仪器HPLC系统为Waters公司515HPLC泵,2487 紫外检测器.其他仪器有旋涡振荡器,组织匀浆机,离心机,超 声波清洗机等. 1.3猪空白血浆及组织取未使用过喹赛多的猪血浆及肝 脏,肾脏,肌肉等组织,置于一20"C保存. 1.4贮存液及工作液的配制称取喹赛多和脱二氧喹赛多 各5.0mg,分别用50mL二甲基亚砜溶解于棕色容量瓶中, 得终质量浓度为100mg/L的贮存液.用甲醇:水(50:50) 混合液稀释贮存液,得所需浓度的工作液,置于棕色容量瓶避 光保存. 1.5嗣样方法 1.5.1血浆样品取0.4mL血浆置于1.5mL塑料离心管 中,加入0.8mL甲醇,旋涡振荡1min,l1000r/min离心1O min,取上清液20ttL作HPLC测定. 1.5.2组织样品称取组织样品5.0g,加入10mL乙腈, 匀浆(10000r/min离心5rain),3000r/min离心10rain得 乙腈提取液,置4'C冰箱过夜,取上清液1mL加入1mL蒸馏 收一日期:2002—07—03 基金项目;国家自然科学基金资助项目(39870596);教育部骨干 教师培养计划资助项目(2000年) 作者篱介:邱银生(1964一),男,副研究员,博士. *通讯作者 水,混合后用2mL正己烷脱脂2次,弃正己烷后取水相2O L作HPLC测定. 1.6HPLC测定条件分析柱为ODSCs反相色谱柱;流动 相测血浆样品时为乙腈:水(20:80),测组织样品时为甲醇 :水(42:58),流速1.0mL/min;柱温2O,25?;紫外检测 波长305nm;AUFS0.005. 1.7工作液线性范围及仪器精密度取贮存液配成含喹赛 多及脱二氧喹赛多0.005,0.010,0.020,0.050,0.100,0.250, 0.500mg/L的工作液,进样2OL作HPLC检测,用色谱工 作站积分得峰面积,将工作液浓度与对应的峰面积回归得线 性方程.取0.010,0.050,0.250mg/L3种质量浓度工作液,1 日内各测定5次,得药物峰面积的变异情况.同样配制工作 液,在第0,3,5天分别测定1次,观察各浓度不同日共测定3 次得药物峰面积的变异情况.计算日内及日间的相对偏差 (RSD). 1.8血浆样品及组织样品药物回收率测定取血浆0.4 mL,加入喹赛多及脱二氧喹赛多工作液,使得血浆药物质量 浓度为0.020,0.100,0.500mg/L;取肝脏,肾脏或肌肉样各 5.0g,加入喹赛多及脱二氧喹赛多,使得组织中药物含量为 0.050,0.200,1.000g/g.按1.5方法,各浓度样品3重复制 样,再按1.6方法作检测. 1.9血浆及组织药物测定 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 曲线及最低检出浓度按 1.8方法制得o.Olo,o.020,0.050,0.100,0.250,0.500, 1.000mg/L的血浆样品,制得0.025,0.050,0.100,0.200, 0.500,1.000,2.000ttg/g的组织样品,按1.5方法制样后作 HPLC检测. 2结果 2.1色谱条件的优化经对流动相组成,比例,以及柱温,检 测波长等进行优化,确定了测样的色谱条件.本项试验中,喹 赛多和脱二氧喹赛多的保留时间血浆样品条件下分别为3.7 min和14.7min,组织样品条件下则分别为3.1min和8.8 min.色谱峰峰形较好,主峰与杂质峰无重叠(图1). 2.2工作液标准曲线及精密度测定血样测定色谱条件下, 药物浓度与峰面积回归方程:喹赛多一7.5352×10A+ 364中国兽医2003年7月第23卷第4期ChinJVetSciJuly2003Vo1.23No.4 0.0016,r一0.9997;脱二氧喹赛多y一1.6351×10A+ 0.0153,r一0.9993.组织样测定色谱条件下,药物浓度与峰 面积回归方程:喹赛多Y一8.2307×10A一0.0032.r一 A; 2 娶 ! …一,—, 出峰时间,min E I , 0.9995;脱二氧喹赛多Y一1.7882×10A+0.0001,r一 0.9993.表明在工作液标准曲线范围内,2种检测物浓度与 峰面积有良好的相关性.2种条件下的仪器精密结果见表1. B 出峰时间,min 』,』… 出峰时间/rain 图1喹赛多及脱二氧喹赛多的高效液相色谱幽1.A为血浆测定条件的工作液(o.1O0mg/I)色谱幽;2.B为空白血浆色谱图;3.C为血浆 中加药(O.500mg/L)色谱图;4.D为组织测定条件的工作液(O.100mg/L)色谱图;5.E 为空白肾脏色谱图;6.F为肾脏中加药(O.500 mg/L)色谱图;7.1,6色谱图中,峰1为喹赛多,峰2为脱二氧喹赛多 表1El内,El闻的相对偏差(RSD)%2.3血浆及组织样品的药物回收率 2.3.1血浆样血浆中药物质量浓度为0.020,0.100, 0.500mg/L时,喹赛多的回收率分别为(104.77土4.83), (92.75土5.37)%,(71.20土1.21)%;脱二氧喹赛多的回收率 则分另?为(75.89土15.83),(86.63土1.94),(87.04土 2.81). 2.3.2组织样肝脏,肾脏,肌肉等3种组织药物回收率见 表2. 表2组织样的药物回收率,% 2.4血浆及组织中药物定量标准曲线及最低检出浓度血浆样品在0.010,1.000mg/L浓度范围内,组织 中国兽医2003年7月第23卷第4期ChinJVetSciJuly2003Vo1.23No.4365 0.025~2.000g/g浓度范围内,药物定量标准曲线的回归方 程及相关系数见表3.本试验条件下,血浆样中喹赛多及脱二 氧喹赛多的最低检出质量浓度分别为0.010mg/L和0.020 mg/L,组织样中2种检测物均为0.025t~g/g. 表3血浆及组织中药物定量标准曲线 3讨论 20世纪80年代末期,有报道称东欧将喹赛多用作猪, 鸡,牛的饲料添加剂,但未见其在靶动物猪体内的生物利用度 及组织残留研究报道.为保证用药的安全有效性,有必要建立 喹赛多在靶动物猪血浆及食用组织中药物测定方法,开展本 品的药物动力学及组织残留研究工作.根据喹喔啉类药物在 猪体内易于进行脱氧代谢的特性,合成出脱二氧喹赛多[s,43, 建立了猪血浆及食用组织中喹赛多及脱二氧喹赛多的HPLC 测定方法. 遇光不稳定是喹喔啉类药物的共同特性.据Macintosh 等[3]报道,本类药物脱二氧卡巴氧较卡巴氧对光更敏感,即使 在近暗条件下仍不稳定,因此在实验操作时应尽可能避光进 行.本试验建立的血浆样及组织样的制样方法简便迅速,有利 于减少被检测物的光分解.经方法学研究,血浆及组织样检出 浓度低,杂质对药物峰干扰小,测样重现性好,药物浓度与峰 面积具有良好的线性关系. 组织中卡巴氧的测定采用乙醇匀浆组织提取药物[3],喹 乙醇则用乙腈提取组织中药物[5].本试验对乙醇,甲醇及乙腈 的提取效果进行了比较,发现用乙腈提取时杂质干扰小,回收 率相对较高.本方法肌肉的回收率达到70以上,肝脏,肾脏 样品的回收率偏低,0.200,1.000g/g时为60,80, 0.050g/g时回收率仅5O,6O,回收率情况与喹乙醇和 卡巴氧相似[-3,53. 标示残留物的确定是确立靶动物用药休药期的基础.喹 喔啉类药物的脱氧初级代谢物继续进行次级代谢,猪体内的 标示残留物卡巴氧为喹喔啉一2一羧酸(QCA)Ia],喹乙醇为3一甲 基一喹喔啉一2一羧酸(MQCA)I6],分别为卡巴氧和喹乙醇脱二 氧代谢后再断开侧链.未见对喹赛多在猪体标示残留物的规 定,本项工作有待进一步研究. (试验用脱二氧喹赛多的合成与确证得到了湖北省医药工业研 究院颜锵高级工程师及周利娟副研究员的协助,特此致谢) 参考文献: [I]GramGJ,SpierenburyTJ.Liquidchromatographicdetermina— tionofcyadoxinmedicatedfeedsandinthecontentsofthe porcinegastr0intestinaltractwithfluorescencedetection[J].J Chromatogr,1988,447:244—248. [23GraafGJ,JagerLP,BaarsenAJ,eta1.Somepharmacokinetic observationofcarbadoxmedicationinpigs[J].VetQuart, 1988,10(1):34—41. [33MacintoshAI.GeorgeAN.Liquidchromatographicdetermina— tionofcarbadox,desoxycarbodox,andnitrofurazonesinpork tissues[J].JASSOCOFFANALCHEM,1984,67(5):958— 962. [4]MacintoshAI,LauciauitG,GeorgeAN.Liquidchro— matographicmonitoringofthedepletionofcarbadoxandits metabolitedesoxycarbadoxinswinetissues[J].JASSOCOFF ANALCHEM,1985,68(4):665—671. [5]TomokoNagata,MasanobuSaeki.Determinationofolaquindox residuesinswinetissuesbyliquidchromatography[J].JAS- socOFFANALCHEM,1987,70(4):706—707. [6]中华人民共和国农业部(1997年).动物性食品中兽药最高残留 限量(试行)Is]. HighPerformanceLiquidChromatographicDeterminationofCyadoxandIts MetaboliteDesOxycyadOxinSwinePlasmaandTissues QIUYin—sheng,YUANZong—hui,FANSheng—xian,LIUDeng—cai,HUANGLin— li,YINJu—yi (InstituteofVeterinaryDrug,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan430070,China) Abstract:Ahighperformanceliquidchromatographic(HPLC)methodwasdevelopedforthedeterminationofcyadoxand itsmetabolitedesoxycyadoxinswineplasma,liver,kidneyandmuscle.Plasmasamplewasmixedwithmethano1.andthencen— trifugedandinjectedontoHPLCcolumn.Tissuessamplewashomogenizedwithacetonitriletoextractcyadoxanddesoxycya.. dox,andcleanedupbyhexane.CyadoxanddesoxycyadoxwasseparatedonaOSDCl8colum n,andquantitatedbyusingUVde— tectorsetat305am.Theresponsesforcyadoxanddesoxycyadoxwerelinearintherangeof0.005—0.500mg/Lwithacorrela— tioncoefficientof>0.999.Theaveragerecoveriesofcyadoxanddesoxycyadoxwere>70whenaddedtoplasmasamplesat 0.020,0.100,0.500ng/L.Themeanrecoveriesofthetwocompoundsfromtissueswere>70formuscles,andonly50一 80forliversandkidneyswhenfortifiedwith0.050,0.200,1.000g/g.Thedetectionlimitsforcyadoxanddesoxycyadoxin plasmawere0?010,0.020mg/Lrespectively,andwas0.025g/gforthetwocompoundsinvarioustissues. Keywords:cyadox;desoxycyadox;plasma;tissue;swine;highperformanceliquidchromatography