转基因植物中选择标记基因的去除

2006年第2期 (甚|‘54期) 杜井江师范擘晓擘报(自然科擘版) Journal of Muda~iang Normal University NO．Z．2006 TotalNo 54 2．2 同一种秸杆不同比例对转潮时间的影响及分析 衰 2 同一种秸杆不同用比例对转潮时间的影响 在培养基中加人豆秸可以加速转潮进度．豆秸 用量以 2O％～3O 最合适，在这种比例的条件下， 菌盘生长速度快，转潮快．豆秸用量超过 3O ，生 长速度，转潮都快，但是出菇集中，产量和质量都 差，第 2潮采收后菌盘损坏，基本上不再出菇． 2．3 不同营养成分对产量的影响与分析 从表 3可以看出，栽培滑菇用麦麸作为精培 养料(补充氮源不足)，比细米糠产量高，混合使用 可以降低成本(如处理 3)；如果精培养料全部用 细米糠，产量也比较理想．掺一定量的稻壳粉，产 量降低，但栽培成本也相应降低．如果在细米糠中 加入 1 豆粉(处理 6)，产量可以大幅度增加． 出现这种结果的原因是麦：麸中含氮化合物比 米糠中高，故生物转换率高，产量也相应提高；细 米糠中含氮化合物少些，但维生素含量高，所以滑 茹产量也较高；稻壳粉营养成分低，产量也低，加 入豆粉可提高含氮化合物的总量，增加产量． 衰3 不同营养成分对产量的影响与分析 3 结论 3．1 在滑菇(木腐真菌)培养基中加人秸杆可以缩 短转潮时间，其中以加人豆秸和玉米芯最为理想． 3．2 秸杆加人的比例以20 ～30 较为理想． 3．3 栽培滑菇用麦麸调节培养基中碳氮比，精培 养料产量高，细米糠次之．在米糠和稻壳粉中加人 一 定量豆粉能增加产量． 编辑：琳莉 转基因植物中选择标记基因的去除 潘永明 (哈尔滨师范大学 黑龙江 哈尔滨 150001) 摘 要：转基 因植物中的抗生素抗性酶基 因和除草荆抗性酶基因等标记基 因的生物安全性引起全球关注， 科学家们正积极探索副除选择标记基因的转化体系，本文就着重介绍了几种转基 因植物 中标记基 因剔除的进展． 关键词：转基因植物；标记基因别除；安全性 选择性标记基因是指在遗传转化中能够使转 化细胞(或个体)从众多的非转化细胞中筛选出来 的标记基因．它们通常可以使转基因细胞产生对 某种选择剂具有抗性的产物，从而使转基因细胞 在添加这种选择的培养基上正常生长，而非转基 因细胞由于缺乏抗性则表现出对此选择剂的敏感 性，不能生长、发育和分化L1]．目前常用的筛选标 记基因主要有两大类：抗生素抗性酶基因和除草 剂抗性酶基因．前者可产生对某种抗生素的抗性， 收稿日期：2006·03·19 · 26 · 后者可产生对除草剂的抗性． 选择性基因与目的基因的整合对于在实验室 条件下鉴定转化细胞是很有帮助的，通常植物转 人外源基因的同时也转人选择标记基因．转基因 植物中作为标记基因的抗生素抗性基因一旦流动 到危害人类或动物健康的病原菌中，就会为其提 供抗药性，使抗生素失去效力．转基因植物通过传 粉将某些基因转移进野生近源杂草，会造成某些 杂草难以人为控制．所以，为了避免转基因植物所 维普资讯 http://www.cqvip.com 2006年第2期 (总第 54期) 牡丹江师范学院学报(自然科学版) Journal Of Mudanjiang Normal University NO．2，2006 TotalNo 54 带来的不安全因素，标记基因的安全问题已成为 转基因植物研究中的又一课题． 近年来在筛选标记的使用方面已有了一些新 的改进．解决抗性标记基因安全性问题的策略有 标记回避、标记剔除 (selectable marker—free， SMF)及标记失活三类． 转基因植物标记基因剔除方法的核心是标记 基因与关注基因的分离[2]．剔除标记基因的方法 可以分为两类：分离剔除和重组剔除，前者是通过 标记基因与关注基因分别插入到植物基因组的非 连锁位点上，再经减数分裂实现标记基因与关注 基因的分离，达到标记基因剔除的目的．后者是将 标记基因构建在 DNA重组单元中，由起重组作 用的酶(重组酶或转座酶)识别并切除重组单元， 从而将标记基因从植物基因组中剔除．具体操作 涉及以下三个方面： 1 质粒 DNA插入细菌染色体后去 除选择性标记 标记基因的两侧是特定的短 DNA序列时， 无论这个基因是插入在质粒还是染色体 DNA 上，这个基因都可以通过利用识别其两侧序列的 酶而将其除去(图 1)．一种有效的酶和 DNA序列 组合就是 cre一／oxP重组系统 ]，它含有 Cre酶 以及两个不对称的34 bp大小的 loxP重组位点． 两；；卷 Pj‘园 ∞^ i C tlfl~ 图 1 质粒 DNA插入细菌染色体后去除选择性标记 在染色体 DNA和质粒 DNA之间产生单交换 ，使整 个质粒插入染色体．选择标记两侧为loxP位点，由Cre酶 切除，在整合的质粒上只留下一个 loxP位点。Cre酶基 因位于另一个质粒上，由大肠杆菌 lac启动子调控． Cre／loxP重组系统 中，先将一种筛选标记 插入 loxP位点，再与目的基因相连，转入植物细 胞．第二轮转化时，将第二种筛选标记与Cre序列 连接，再转入已转化的细胞，在 Cre重组酶的作用 下，第一种筛选标记可被删除(欲去除的标记基因 的两侧是 loxP位点，质粒整合到染色体 DNA上 以后，利用 Cre酶切掉标记基因．编码 Cre酶的基 因位于自身质粒上．挑取已失去第一筛选标记的 植株，待结籽后，从后代分离群体中挑选没有第二 种筛选标记的植株，即为已完全剔除了筛选标记 的转基因植株．利用 FLP／FRT重组系统也可将 筛选标记基因去除 ． 2 从核 DNA中剔除标记基因 将标记基因和目的基因分别构建在不同的载 体上 ]，通过共转化，从后代的分离群体中挑选， 也可获得无筛选标记的转基因植株．需要用两种 不同的 DNA共转化植物，一个携带标记基因，另 一 个携带外源目的基因．这种情况下，大约 3O ～ 8O 的植物带有两种基因．然而，由于两种基因 在染色体 DNA的不同位点整合，可以用传统的 选育技术去除带有选择标记的转基因植物． 将选择标记基因克隆到植物转座的元件之间 (Ds元件)．这种组合与一个转座酶基因一起插入 T—DNA，转座酶切割 Ds元件之间的 DNA并使 之整合到另一个染色体位点(图2)．两个 Ds元件 之间的任何序列都可以转座到基因组的一个新的 位点OA原位点切除基因)，只要存在合适的转座 酶．T—DNA插入宿主植物 DNA的过程中，两个 Ds元件之间的选择标记大约有 9O 转移到染色 体 DNA的另一位点，大约有一半选择标记的新 位点远离原来的位点．因此，选择标记基因能够用 来鉴定转化的植物细胞，然后通过选育将其去除． LB Ds选择标记 Ds转座酶 目的基因 RB 图 2 T—DNA为基础的选择标记基因切除系统示意圈 T—DNA整合植物染色体 DNA之后．转座酶能够切 割选择标记基因，将其插入植物染色体的一个新的位置． 缩写：LB．T—DNA左侧边缘区lRB，T—DNA右侧边缘 区lDs。一种植物转座元件． 任何利用有性杂交从目的基因中分离选择标 记的方法都不适用于木本植物、营养繁殖的植物 和不育植物．如果导入许多相关基因，且这些基因 没有相互连接，那么，它们将独自分离后在子代中 丢失．解决这一问题的一个简单办法就是利用选 择标记的两侧 DNA序列，并且最后从基因组中 剔除(图3)．这样，选择标记及其两侧的 DNA序 列只在短时间内作为转基因植物的组成成分． RB 重组基因 选择标记 目的基因 LB 重组位点 图 3 无标记转基因植物的 DNA构件示意图 LB和 RB是 T—DNA的左、右侧边缘区．转化后，筛 选转化细胞．并在培养基中生长．重组酶将位于重组位点 的 DNA切除。这样选择标记就丢失了，不带有选择标记 基因的细胞形成转基因植物． · 27 · 维普资讯 http://www.cqvip.com 2006年第2期 (总第 54期) 牡丹江师范学阮学报(自然科学版) Journal of Muda~iang Normal University No，2，2006 TotalNo 54 3 从叶绿体 DNA 中剔除标记基因 叶绿体中外源基因的表达水平很高，并能在 同一个启动子下表达一些相关基因，这些优点使 人们将越来越多的外源基因导人叶绿体 DNA 中．从叶绿体 DNA中去除标记基因的方法之一， 是将外源基因作为基因构件的一部分导入，该构 件含有一个细菌的选择基因，具有对抗生素奇霉 索和链霉素的抗性作用．这一标记基因两侧含有 重复的 DNA序列(此例中是 174 bp)，细胞在无 选择压力的条件下生长后，选择标记就会通过 174 bp的序列的同源重组而被去除(图 4)．另一 种方法是开发一种不编码抗生素抗性或者其他任 何不需要特性的选择标记．这一类可能的选择标 记是菠菜的甜菜碱乙醛脱氢酶基因．这种酶只在 少数植物的叶绿体中出现，它能将有毒的甜菜碱 乙醛(betaine aldehyde)转化为无毒的甘氨酸甜 菜碱．甘氨酸甜菜碱作为渗透压保护物，提供一些 抗盐和抗旱的特性．利用甜菜碱乙醛来筛选转基 因植物时，转化效率比用奇霉素筛选高 25倍．应用 这种方法将促进许多重要作物的叶绿体进行遗传 转化，包括对奇霉素具有天然抗性的谷类等作物． CpDNA 选择标记 目的基因 CpDNA ＼ ／ 。 174bpDNA重复单元 图 4：叶绿体的选择性标记切除系统示意田 导人叶绿体后，质粒上特定的叶绿体 DNA序引导外 源基因通过同源重组整合到叶绿体基 因组上，转化子通 过奇霉素抗性筛选之后，转化子在没有抗生素条件下生 长．通过 174bp重复元件问的同源重组 ，选择标记丢失． 参考文献 [1]格利克(Gliek，13．R)。帕斯捷尔纳克(Pasternak，J．J．)．分子生物学技术——重组 DNA的原理与应用[M]．陈耐珊，任大明，译，北京z 化学工业出版社，2005．41z一414． [2]Sugita。K．E Matsunaga，H．Ebinuma．Effective selection system for generation marker—free transgenic plants independent of sex ual crossing[J]．Plant Cel Rep．1999，18 l 941—947． [3]，[5]Weisberg R．et a1．Site-specific recombination in phagelambda．New York．Cold spring Harbor Laboratory．1983． [43瞿札嘉，现代生物技术导论[M]．北京t高等教育出版社．2004．29—33． 编辑 ：琳莉 对数字式变压器差动保护 CT接线方式的探讨 史胜 军 (华电能源股份有限公司牡丹江第二发电厂 黑龙江 牡丹江 157015) 摘 要：通过对电磁式、晶体管式、集成电路式和数字式变压器差动保护 CT接线方式问题的讨论，分析了 各种类型的变压鑫兰动保护的原理及其对单相接地故障灵敏度的差异． 关键词：CT接线；变压嚣差动保护f讨论 近年来，计算机和数字处理技术在电力系统 继电保护领域普遍应用，基于微处理器的数字式 保护装置已经成为保护制造厂家的主导产品．微 机型装置所带来的绝不只是在元件品质和工艺水 平上的进步，而且还使得许多新颖和完善的保护 原理应用于实践． 数字式保护装置目前在电力系统中得到日益 广泛的应用，和传统类型的差动保护相比，数字式 差动保护装置集成了差动(包括零差)保护、过流 (过负荷)保护、故障录波和网络通讯等多项功能， 为实现变电站综合 自动化创造了条件．数字式差 动保护通过辅助变换器进行交流变换得到适当的 收稿日期：2005-10 11 · 28 · 电压量信号，再经滤波、采样和模数转换成为可以 由微处理器直接运算的数字信号，所有数据处理、 变量运算和保护逻辑功能都可以由软件来实现． 1 相位补偿的运算 数字式变压器差动保护的 口、回路，对任意接 线组别的变压器都可以采用全星形连接，其相位补 偿可以由保护内部的软件来实现，而无须象传统的 差动保护那样依靠 CT接线方式的选择进行外部的 “相位补偿”．这种软件的补偿是利用对称分量法进 行“矩阵变换”计算得到的，各种补偿矩阵见表 1． 维普资讯 http://www.cqvip.com