转基因植物口服疫苗研究进展

江苏农、№科学2009年第4期 ～9一 转基因植物口服疫苗研究进展 朱宏∽，赵凯1’2，段可2，r，唐雪明∽j (1．上海市农业科学院生物技术研究所．上海20l106；2．农业部转基因植物环境安全监督检验测试中心(上海)，上海20l106； 3．上海市农业遗传育种重点实验室，上海20儿oj) 摘要：转基因植物口服疫苗是一种重组蛋白亚单位疫苗。目前，已经有多家科研单位在开展人和动物方面的转 基因植物口服疫苗研究。其中，一些重要的人用转基因植物口服疫苗已经成功地完成了I期临床研究试验，针对一些 动物疾病的转基因植物口服疫苗也已经进人了早期靶动物试验阶段。本文对转基因植物口服疫苗的研究进展进行了 综述，并侧重对动物转基因植物u服疫苗的发展前景进行了展望，同时对～些重要的人用转基因植物口服疫苗也进行 了讨论。 关键词：植物疫苗；口服疫苗；亚单位疫苗；口服免疫 中图分类号：Q789文献标志码：A 文章编号：1002—1302(2009)04一0009—05 疫苗接种免疫是目前最有效的控制疾病传播的_种方 式。传统疫苗因其接种方式复杂、生产成本较高、生产效率较 低及潜在的不安全性等问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 ，一直限制着它的广泛使用。利 用植物表达系统生产疫苗可以弥补传统疫苗的不足。植物疫 苗也被称为转基因植物疫苗。与传统疫苗相比，植物疫苗有 着突出的优点：(1)生产成本低，可以快速规模化生产；(2)常 温储存和运输，无需冷藏；(3)可以直接口服免疫，无需专门 的接种工具和专业接种人员；(4)可以使人和畜禽免受注射 之苦；(5)可以避免通过注射接种造成疾病传播等。由于转 基因植物口服疫苗具备诸多优点，目前许多国家纷纷开展植 物疫苗的研发和生产工作。本文对转基因植物口服疫苗的研 究进展进行了综述，并侧重对动物转基因植物口服疫苗的发 展前景进行了展望。 1转基因植物口服疫苗的获取 1．1 目标抗原的选择 在表达抗原以前，首先要选择合适的目标抗原。当一些 亚单位疫苗的结构比较清楚时，可以直接用植物表达系统来 表达这些疫苗；但是当要表达疫苗的抗原尚不清楚时，就要对 病原微生物的毒素砭单位结构或表面抗原进行筛选。对于一 些尚不明确的病原微生物，可以先通过基因组学或蛋白质组 学的 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 来进行抗原的筛选。 1．2受体植物的选择 选择合适的受体植物是生产转基因植物口服疫苗的关 键，合适的受体植物可以使转基因植物口服疫苗兼具表达量 高、耐储藏和适宜于口服等优点。植物的新鲜组织(植物的 叶片⋯、幼苗"]、水生植物的叶片¨3)和干燥组织(谷物的种 收稿日期：2009一02—09 基金项目：国家“863”计划(编号：2008AAl00804)；上海市农业科学 院海外人才引进专项基金[编号：2007(25)]；上海市农业科学院 青年基金[编号：2007(03)]。 作者简介：朱宏(1976一)，女，助理研究员．主要从事植物基因工程 研究。 通讯作者：唐雪明。Tel：(021)62208750；E—mail：xuemjn970@ g，Ilail．como 子)都叮以用来表达口服疫苗。但植物新鲜组织中的蛋白在 新鲜组织被采收后很容易被降解，需要立即加工处理，而植物 干燥组织中的蛋白在脱水状态下无需进行加工处理能够长期 储存，因此利用植物的干燥组织表达口服疫苗在实际生产中 的应用更广泛。由于玉米的种子在常温下能够长期储存，是 多种畜禽饲料的主料，可以对重组蛋白和抗原进行高水平表 达，重组蛋白在玉米中的表达量可以高达30kg／hm引“，因此 玉米是一种比较理想的畜禽口服疫苗表达受体”1。目前， LT—B(大肠杆菌热不稳定性毒素B亚单位蛋白)和TGEV (猪传染性肠胃炎病毒疫苗)在玉米中得到了成功的高水平 表达M一“。此外，疫苗还可以在植物的体外进行表达，包括利 用水培植物和组培植物将外源蛋白分泌到水中和培养基中进 行表达。将外源蛋白分泌到水中进行表达已经在温室栽培的 烟草中得到了运用旧1。烟草。9。和水稻”1两种植物已经建立 了将外源蛋白分泌到培养基中表达的体系。 1．3转基因植物材料的获取 核转化技术、叶绿体转化技术和病毒侵染技术可以实现 抗原在植物组织中的表达¨“。核转化技术是目前转基因植 物常用的一种技术。该技术是通过将编码抗原的外源基因整 合到植物基因组中进行表达，可以通过有性繁殖或无性繁殖 稳定地将外源基因遗传给下～代。植物的叶绿体具备独立的 遗传体系，也可以将抗原基因整合到植物的叶绿体中进行表 达。利用叶绿体可以实现外源基因的高水平表达，而且植物 的叶绿体属于母系遗传，花粉的形成本质上与叶绿体等质体 无关，不会造成基凶漂移等环境问题。目前，已经在烟草、水 稻、拟南芥、马铃薯、油菜、胡萝卜、大豆、莴苣、甘蓝、矮牵牛和 白杨等lo多种植物中实现了叶绿体的转化¨“。利用植物病 毒作为载体，将目的基凶插入病毒基因组，通过植物病毒侵染 植物组织来表达抗原基因。最常用的植物病毒载体有豇豆花 叶病毒、烟草花叶病毒和马铃薯x病毒。竹子花叶病毒载体 可以用来表达一些较大片段基因””。不同植物或植物器官 表达植物疫苗的方法见图l。 在这3种表达体系中，前2种表达体系比较稳定，可以通 过有性繁殖或无性繁殖稳定遗传给下一代。核转化技术虽然 是一种常用的转化技术，但该种方法获取的转基因植物存在 万方数据 一lO一 江苏农业科学2009年第4期 种子 核转化技术 水生植物叶片 叶绿体转化技 新鲜的叶片 病毒侵染技术 组织培养植物f J 幼菡 f 永培植物 图l不同转基因植物疫苗的获取方法 外源基因表达效率低、表达不稳定、基因易失活和基因插人造 成的位置效应等不足之处。利用核转化技术产生的转基因植 物田间释放后，外源基因易随花粉漂移到外晃环境中，打破原 有的生态平衡。叶绿体转化技术可以弥补核转化技术的不 足，但叶绿体仅适合细菌抗原的表达而不适合生产糖蛋白。 第三种转化体系是一种瞬时转化体系，该种体系外源基因表 达量较高。但该种体系由于外源基因并不整合到植物细胞染 色体中，不能随植物传代，每株植物都要接种，工作量大且外 源基因易丢失，因此，在选择植物疫苗转化体系时，要根据表 达疫苗的实际情况进行选择。 2抗原在植物中的高水平表达研究 抗原基因能否在植物中高水平表达是影响植物疫苗发展 的蘑要因素。为了提高植物疫苗的表达量，众多学者开展了 提高转基因植物口服疫苗的高水平表达研究，并取得一定进 展。常用的提高转基因植物口服疫苗表达苣的方法见表1。 表1 增强转基因植物外源基因表达水平常用方法 方 法 参考文献 使用强启动子来促进外源基因表达 与转录园子共同表达 添加核骨架结合区序列 添加5端和3端非翻译区序列 优化密码子 对表达的外源蛋白迸行王E确的匝细胞定位 增加外源基因拷吡数，使用能够高水平表达外源基因的植物受体 使外源蛋白在特定的组织器官和发育期表达 使用强启动子是提高植物疫苗表达量的重要方法。在双 子叶植物中常使用花椰菜花叶病毒35s启动子、胭脂碱合成 酶基因(加s)启动子"刈和根癌农杆菌甘露碱合成酶基因 (，删)启动子来驱动外源基因的表达。其中胭脂碱合成酶基 因(麟)启动子的活性要比花椰菜花叶病毒35S启动子 弱口“，而甘露碱合成酶基因(咖)启动子的活性与花椰菜花 叶病毒35s启动子相当甚至更强”“。其他植物病毒的启动 子也得到了一定的应用，包括木薯叶脉花叶病毒宿动子¨“、 木尔坦棉花曲叶病毒启动子m1和紫云英矮缩病毒启动子 等口“。单子叶植物相对较难转化，在单子叶植物中使用的启 动子研究较少。目前在单子叶植物中常使用一些高表达的植 物启动子来驱动外源基因的表达，如玉米肋i一7启动子，利 用该启动子可以使外源基因在单子叶植物中进行高水平表 达。。。上述启动子都是组成型表达启动子，外源基因在受体 植物内持续、高效的表达往往会影晌植物的正常生长发育。 为了减少对植物生长发育的不利影响，同时又能使外源基因 在植物体内有效地发挥作用，这就需要使用特异表达启动子。 双子叶植物中的豆类植物的一胱2流一5启动子”“、单子叶植 物中的玉米胚特异性∥6一』启动子∞“、玉米胚乳特异性 肼比7启动子”⋯、大麦胚乳特异性舶d一』启动子⋯1都能使 外源基因在种子中高水平表达。叶绿体转基因植物需要选用 在质体中具有活性的启动子，如P”n启动子一“。利用植物 病毒瞬时表达外源基因，可以利用植物病毒自身的启动子。 为了进一步增强外源基因的转录还常常使用双倍启动子或多 倍启动子。基因转录除了受启动子等顺式作用元件调控外， 作用于顺式作用元件的反式作用元件在转录调控中同样起着 重要作用，转录因子作为一种重要的反式作用元件与外源基 因在受体植物中共同表达，可以使外源基因表达水平提高2 —4倍。 真核生物翻译水平的调控同样影响外源基因的表达。真 核生物mRNA5’端非翻译区中的多种RNA结构元件，如 小结 学校三防设施建设情况幼儿园教研工作小结高血压知识讲座小结防范电信网络诈骗宣传幼儿园师德小结 构元件、核糖开关、内部核糖体进入位点等，在酬译起始过程 中发挥着重要作用。4“，通过适当添加57端非翻译区序列百T以 显著提高外源基因在植物中的表达水平H“。植物中遗传密 码子的使用频率与动物、微生物不同，将外源基因的密码子替 换成植物偏爱密码子也可以提高外源基因在植物中的表达水 平Ⅲj。不同的亚细胞环境也是影响外源蛋白积累的重要因 素，利用信号肽可以将重组蛋白定位到质体、线粒体、液泡等 细胞器中。不同的亚细胞环境对蛋白的积累水平影响较大， 将大肠杆菌热不稳定性毒素B亚单位分别在玉米的不同亚 细胞中进行定位研究，结果发现大肠杆菌热不稳定性毒索B 亚单位在液泡中的表达量约是在细胞质中表达量的20000 倍㈨。 3转基因植物疫苗的加工处理与接种免疫 植物疫苗通常以3种方式进行接种免疫，一种方式是纯 化处理后用于注射免疫或口服免疫；另一种方式是将植物疫 苗加工成可食用状态的植物材料用于口服免疫；第三种方式 是利用可食用的植物材料表达疫苗，然后对该种植物疫苗进 行简单加工处理或不进行任何加工处理用于口服免疫。其中 第三种情况比较适用于对畜禽动物免疫。 通过纯化处理对植物疫苗可以起到浓缩和提纯的作用， 由于某些植物组织结构复杂并且含有大量的酚类物质(如植 物的叶片组织)，从而使植物组织中的蛋白很难被纯化∽3，另 外纯化过程会大大增加植物疫苗的成本。该种方式生产的疫 苗很难在疾病防治中进行广泛运用。 转基因植物疫苗也可以通过食品加工技术将植物疫苗加 工成适宜食用的状态进行口服免疫。在种子中进行表达的疫 苗，可以将种子加工成粉末后进行脱脂处理来延长疫苗的储 存时间。经过这种处理的植物疫苗可以直接用于口服。植物 的一些新鲜组织在未经加工的状态下难以进行保存，要进行 脱水处理来保证蛋白不被降解，如利用西红柿表达大肠杆菌 热不稳定性毒素结合亚基时，把西红柿进行冷冻干燥处理后 加工成粉末m。，然后将脱水处理后的粉末放在胶囊中进行口 服免疫。在进行这些加工处理的过程中要保证温度和压力条 件适中，保证疫苗在加工处理的过程中不会被降解。 用于畜禽动物口服免疫的疫苗通常不需要进行加工处理 或仅需要进行简单的加工处理即可。在选择动物疫苗的植物 碍舢，M，"凹， 一 一控 一．5．0一∞H坶●嚣●№勰0 万方数据 朱宏等：转基因植物口服疫苗研究进展 表达载体时，通常要选择具有耐储藏和直接口服特点的植物 载体(如玉米)。用玉米表达的防治猪疾病的疫苗可以直接 添加到猪饲料中进行口服免疫¨o。但是，由于植物粗产品中 的疫苗可能会存在表达水平不均匀或者不稳定等情况，因此 常常需要进行简单的加工处理。 植物疫苗加工与否各有优缺点，加工可以对疫苗进行浓 缩使疫苗含量比较均匀。改变疫苗的口感，但加工过程会大大 增加疫苗的成本，使疫苗无法得到普及使用。因此要根据实 际情况来决定植物疫苗是否进行加工。一般来讲，利用植物 的新鲜组织表达的疫苗，为了保重疫苗的稳定性，在植物的新 鲜组织被采收后要立即进行加工处理。常采用的加工处理方 法是先对植物的新鲜组织进行脱水处理，然后再加工成粉末。 经过这种处理的植物疫苗不仅含量比较均匀，而且可以长期 保存。利用谷物种子表达的疫苗在用于人类口服免疫时要进 行加工处理。谷物的加工形式多样，既可以加工成颗粒，也可 以加工成粉末。在进行这些加工的过程中要避免高温和高压 处理．以免使蛋白质变性一“。用于畜禽动物口服免疫时可以 不进行加工处理直接用于口服免疫。不同植物疫苗的加工处 理情况见图2。 干燥的种子 水生植物的叶片 不加工处理l 加工处理 新鲜的叶片 发芽的幼苗 圈2利用不同植物表达抗原的加工处理情况 4增强转基因植物口服疫苗的免疫原性研究 转基因植物疫苗具有分子量小、特异性强和安全性高等 优点，但存在免疫原性弱的缺点。通过将免疫原性较强抗原 的不具有毒性的变异体作为目标抗原的佐剂，共同免疫人或 动物可以增强目标抗原的免疫原性。霍乱毒素(CT)和大肠 杆菌热不稳定性毒素(LT)具有较强的免疫原性，是最有潜在 功能的黏膜佐剂Ⅲ1。通过将尿源性大肠杆菌的天然剪切形 式菌毛黏附蛋白(FimHt)与LT—B作为佐剂共同免疫小鼠 时，可以使FimHt免疫源性提高500倍旧J。由于LT与cT同 源性高且LT较CT毒力小，作为黏膜佐剂，近年来国内外的 研究热点已由cT转为LT闭1。为了保证佐剂与目标抗原在 使用过程中的配比是一定的，佐剂通常要与目标抗原分别在 不同的植株中进行表达，然后再将表达产物与抗原的表达产 物混合使用¨“。 在一些情况下，将口服疫苗与注射疫苗联合使用也能够 明显提高免疫效率并降低成本。比如，在饲养感染肠胃炎病 毒的猪时，可以先对母猪进行注射免疫，然后再利用植物疫苗 进行口服免疫。这不仅可以显著增加猪血清中的中和抗体水 平，而且可以增加母猪早期乳汁中的中和抗体水平¨]。 5转基因植物口服疫苗的研究现状 目前已经有多种抗原在植物中得到了成功的表达mj，以 往的转基因植物疫苗研究主要集中在人用疫苗上。近年来， 为了提高动物制品的质量，使人类免受人畜共患疾病的威胁， 人们越来越注重畜禽动物疫苗的研究。 ’大多数的转基因植物疫苗研究，目前多停留在研究的初 期阶段。其中一些人用转基因植物疫苗已经进人I期临床研 究阶段(表2)。利用马铃薯表达的大肠杆菌热不稳定性毒素 疫苗是第一个用于临床研究的植物疫苗，在这一项研究中，志 愿者食用50一100g的生LT—B马铃薯(含有375—750斗g LT—B)或非转基因马铃薯，食用LT—B马铃薯群体的11组 中有10组在抗LT—B的IgG血清中和毒素LT的水平上至少 高出了4倍。这一里程碑式的研究证明．I食用转基因植物疫 苗可有效地激起人体的抗体反应。通过对人用植物疫苗的I 期临床研究表明，除了部分植物疫苗由于口味不佳会引起反 胃外，没有发现植物疫苗存在安全性问题”卜⋯。但是目前没 有植物疫苗Ⅱ期临床研究的报道。 表2 口服植物疫苗临床研究 一些畜禽动物转基因植物口服疫苗也已经进入了靶动物 试验阶段H’o圳。PmdiGene公司将猪传染性肠胃炎病毒刺突 蛋白用玉米进行表达，将未加工的转基因玉米口服免疫仔猪， 然后用强毒攻击仔猪，免疫后的仔猪明显产生了免疫保护功 能¨创1。由于仔猪在哺乳期很容易被传染性肠胃炎病毒感 染，为了研究通过食用转猪传染性刺突蛋白基因的玉米能否 增加母猪乳汁中的抗体水平，从而使仔猪在哺乳期免受传染 性肠胃炎病毒感染，又将转猪传染性刺突蛋白基因的玉米对 母猪进行口服免疫研究，结果表明利用转猪传染性刺突蛋白 基因的玉米加强免疫母猪可以增加母猪血液中的抗体，从而 增加了母猪的初乳和早期的乳汁中的抗体水平"J。另外，相 似的研究还有利用含有轮状病毒疫苗的马铃薯块茎对母鼠进 行免疫，研究表明幼鼠通过取食母鼠的乳汁获得了免疫性，利 用强毒攻击幼鼠，幼鼠明显提高了对轮状病毒的抵抗能 力御1；利用表达牛轮状病毒的烟草口服免疫母鼠，然后利用 强毒攻击哺乳期的幼鼠，幼鼠具有了较强的免疫保护能 力旧“。与人用疫苗相比，动物疫苗评价程序就要简单得多． 在后期的试验研究中要节省大量的研究费用。因此，首先进 入商品化生产的将会是动物用转基因植物疫苗。2006年2 月，美国农业部(UsDA)签发批准了转基因鸡新城疫植物疫 万方数据 一12一 江苏农业科学2009年第4期 苗商品化，这是第一个被许可上市的兽用转基因植物疫苗。 该疫苗是采用烟草细胞作为表达体系，生产出具有抗鸡新城 疫病毒的安全有效的疫苗“1，这是畜禽转基因植物疫苗研究 的巨大突破。除此以外，在国外，口蹄疫植物疫苗、牛瘟病毒 疫苗、猪流行性腹泻病毒疫苗、禽传染性支气管炎病毒疫苗及 犬细小病毒疫苗等多种动物病毒疫苗也已经在植物中得到了 成功的表达。目前，在公开文献中，我国只有中科院兰州兽医 研究所正在开展转基因口蹄疫病毒植物疫苗研究怕”⋯，其他 畜禽转基因植物疫苗的研究还比较薄弱，很少见到报道。 猪繁殖与呼吸综合征是近年来危害我国养猪业最严重的 疾病之一。它是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PorcinerePro． ductiveandfe8pjratorysyndmmevirus，PRRsV)引起的一种传 染病。临床上以妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖 障碍以及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征，因患猪耳部 等处发绀变蓝，又名“猪蓝耳病”。它直接导致猪存栏量大幅 下降，给我国养猪业造成了巨大的经济损失。目前还没有成 功的疫苗使猪得到完全保护。 我们根据合作单位中国农科院上海兽医研究所构建的 PRRs北美株全长克隆序列(GenBank登陆号：AFl84212)重 新设计了PRRsV主要抗原表位GP：5和M蛋白编码基因的 序列，将GP5蛋白N端信号序列、前段疏水性跨膜区、A表位 基因和中部主要疏水跨膜区删除；并将上述改造后的GP{5蛋 白和M蛋白的编码序列采用我们实验室设计建立的全基因 两步法PcR—b船edtwo—stepDNAsynthesis(PrrDs)合成。该 方法在国际著名期刊NucleicAcidsRe卵arch发表ⅢJ。我们 通过该方法已将PRRsV主要抗原表位CP5和M蛋白编码基 因进行人工合成并在转基因玉米中进行表达。相关研究正在 进行之中。 6植物疫苗的应用前景及现存问题 近年来，无论是疯牛病的疯狂暴发，还是禽流感的广泛流 行，都使国内外的养殖业蒙受了巨大的损失ⅢJ。对于很多畜 禽疾病来讲，利用口服植物来表达一些畜禽疫苗是一种较好 的选择。另外，还有一些动物无法通过注射进行接种免疫 (如水生动物)，使用转基因植物口服疫苗对这些动物进行口 服免疫将是一种有效的疾病防治方式。 目前，仍然有很多因素在限制着植物疫苗的发展和应用。 首先，受体植物的选择，虽然有多种植物已经建立了高效的遗 传转化体系，但这些植物大部分不适合表达植物口服疫苗。 谷物类植物(如玉米)是一种较理想的疫苗表达受体，但谷物 类植物由于不是农杆菌的天然宿主，这类植物难以进行遗传 转化或遗传转化效率较低，极大地限制了谷物植物疫苗的发 展。其次，植物疫苗的表达效率较低，大大提高了植物疫苗的 生产成本，使植物疫苗无法普及使用。再次，转基因植物疫苗 的接受度低。由于转基因植物在很多国家还很难被接受，尤 其是一些欧洲国家对转基因植物一直持抵制态度，这就为转 基因植物疫苗的发展设置了很大的障碍。因此，为了推动转 基因植物疫苗的快速发展，我们不仅要在转基因植物疫苗的 技术创新方面加大力度，同时也要注重对全社会普及转基因 植物方面的知识，消除人们对转基因植物疫苗的恐惧心理。 2006年2月。美国农业部(usDA)签发批准了新城疫转基因 植物疫苗的商品化，虽然该转基因植物疫苗还未真正投入市 场，但这无疑是转基因植物疫苗具有里程碑意义的成功范例， 将会对其他转基因植物疫苗的发展起到巨大的推动作用。 参考文献 [1]MasonHs，BaJlJM，shiJJ，eta1．E1pression0fNorwalk“mscap． sidproteinintransgenictobaccoandpotato如d沁omlimmunogenici． tyinlTIice[J]．PmcNallAcadSciusA，1996，93(11)：5335— 5340． [2]R0drigu既RL．Processf0‘pfolei“pmductioninplants：us，5888789 [P]．1999—3—30． [3]Sl砌pAM，R曲haIld撕N。Gene她11ye姆nee涮duckweed：us6， 040，498[P]．2000—3—21． [4]H00dEE，KusnadiA，Nikolovz，eta1．Molecular知朋ingofindus踊． alPro【ei船f汹n彻59enicmaize[J]．AdvExpMedBiol，1999，山S4： 127一147． [5]stI’eat6eldsJ，JilkaJM，HoodEE．eta1．Plant—basedvaccine8：u． 耐queady卸姆s[J]．V∞cine，200l，】9(17／18／19)：2742—2748． [6]stre娟eldsJ，LaneJR，Br00kscA．com鹳productionsystemfor human∞d∞imal[J]．Vaccine，2003，2l(7／8)：812—815． [7]hmphearBJ，JilkaJM，KeglL．Acom—baseddelivery8ystemfor 肌imalVaccin鹅：蛐oraltr卸smissibleg髂m)ente—ti8virusv扯cine b00s扭ktogenicimmuni哆inswine[J]．V8ecine，20(H，22(19)： 2420—2424． [8]BorisjukNV，Bo—sjukLc，Imgendms，eta1．Productionofrecombi一 咖tpT0teillsinpl帅troote】【lldates[J]．NatBiotechnol，1999，17 (5)：466—469． [9]FischerR，ua0Yc，Dl璐sardJ．A伍njtypu一6cationofaTMV—spe— ci&r佻ombin蚰tfuU—size卸tibody舶mat姗lsgenictobaccosu8一 pensioncuhuI℃[J]．JlmmunolMeth，1999，226(1／2)：l—lO． [10]Ton鹊E，Vaquer0c，NicholsonL，eta1．RicecellcultuI．e拍肌a1． tematiVeproductionsyBtemforfunctionaldi哪皿oBticandtheraI)eutic ∞tibodies[J]．Tran59enicRes，1999，8(6)：44J一449． [1j]StrieatfieIdsJ．Plant—basedvaccinesfor‘anim8IsheaJth[J]．Rev Sci7rech，2005，24(1)：189一J99． [12]VenTmD，DarIjeuH．chloropI船tvectorsyste吣forbiotechnolo野 印pJications[J]．Pla|ltPhysjol，2007，145(4)：“29一1143． [13]Y蚰gcD，“∞JT，L酊cY，eta1．Inductionofpmtectiveimmun时 ins“nebyrecombin柚lbamboom础cvirus取pre鸥ingf曲t一硼d —mouthdisea8evims8pitopes[J]。BMcBiotechnol，2007。7：62— 72． [14]Ficdleru，PhillipsJ，Ans∽nk0O，eta1．0曲mi∞tion0fscFvaIlti． bodyProductio|lintransgenicplants⋯．Immunolechnology，1997， 3(3)：205—216． [15】ste厶movI．nubaevs，Feh吾rA，eta1．Promoter锄dgenotypedepend． ent嘶sientexp。e够i叩0fareponergenei“pl鲫lpmtopl拈tB[J]． ActaBiolHu|lg，199J，42(4)：323—330． [16]Daiz，H00kerBs．Ander舯nDB，eta1．bpre88i叩ofacidotlle砷u8 ceⅡulolytic岫endo—uc日naseElin呦sgenictnb们co：biochemicaI chamtericB∞dph姆ol硒cal毋&ts[J]。1hn$ge面cR∞。2000，9 (1)：43一s4． [17]D蚰iellH，LeesB．P鲫chaiT，eIa1．Expre辐ion0f【henativechoI． emtoxinBsubunit且eneand船sembly0ffunc60n丑l0ligome娼in t舢sgenictohaccochloropl鼬ts[J]．JMolB“，200l，3ll(5)：lool 万方数据 朱宏等：转基因植物口服疫苗研究进展 一13一 一1009． [18]chapm鲫s，KavanaghT，BaulcnmbeD．PotatoVim8x私avector forgeneexpT℃s8ioninPlant8[J]．PIantJ．1992．2(4)：549—557． [19]Y刖】gD，wuL，HwallgYs，eta1．Expressio盯oftheREBtransc而p- tionalactivatorin而ce肿insi巾provestheyieId0frecombinantp眇 teindwhosegenea陀contmlledbyaReb—reBponsivepromoter[J]． ProcNatlAcadScjUSA，200l，98(20)：11438一11443． [20]McB—deKE，schaafDJ，DaleyM，eta1．contmlled唧re8sionof plastidtT丑nsgenesinplantsba8edonanuclearDNA—encodedand plastid—t出伊ted17RNApolymerase[J]．ProcNallAcadsci USA．1994，9l(15)：7301—7305． [21]HuuAK，YusibovV，MettV．1nducibkexpressioninplantsbyvi· nls—mediatedtransgene眦tivation[J]．TransgenicRes，2005，14 (4)：加7—416． [22]AllenGC，HaⅡGEJr，childsLc，eta1．sca五foJdattachmentre- gio惦increa∞reponergeneexpressioninstablytmnsfomedpl柚t ceⅡ8[J]．Pl¨tcell，1993，5(6)：603—613． [23]H00dEE，witcherDR，Maddocks，eta1．commerciaJproduction ofavidinfI_0mt瑚89enjcmaize：ch蛐ctedzation0ftmnsf0珊nt，P渺 duction，pr叫esBing，e妣r们tion丑ndpurification[J]．MolBfeed， 1997，3(4)：29l一306． [24]RichterLJ，ThanavalaY，ArntzencJ，eta1．Productionofhepatitis B鲫rfkeantigenintransgenicplant8foromlimmuni船tion[J]．Nat BiotechnoJ，2000，18：lJ67一1171． [25]s伽bJM，GarciaB，Grave8J，eta1．H曲一yieldpmductionofB humanther8peutjoproteinintobaccochloroplasts[J]．NatBiotechn． 01．2000，18：333—338． [26]shj叩rasads，PogueGP，kwandowskiDJ，etaI．Heterol090usBe— quenc姻greatlyaffectforeigngeneexpressionintobaccomo鼹icVi卜 uBbasedvectorB[J]．V；mlogy，1999，255：312—323． [27]KumagaiMH，DonsonJ，DeIla—cioppaG，eta1．R印id，hi曲一lev- e1expre鲳jon0fdyc∞ylatedricea—amylaseintransf毛ctedplantsby 粕RNAviraIvector[J]．Gene，2000，245(1)：169一174． [28]zhongGY，Peter∞nD，DelaneyDE，eta1．commercialproduction ofapmtininintr∞89enicmaizeseeds[J]．MolBreed，1999，5：345 —356． [29]HI，0dEE，BaileyMR，BeifuBsK，et81．criteriaforhigh—levelex· pressi帅0fafu“铲IIaccasegeneintransgenic咐i优[J]．PlantBio． technolJ，2003．I(2)：129—140． [30]canizaresMc，NjcholsonL，Lomonosso伍GP．u8e0fviralvectorB forvaccineproductioninplants[J]．ImmunolcellBiol，2005，83 (5)：263—270． [31]Guti芒n_ez一0『tegaA，sandovaI—Montesc，0livem一玎oresTJ．et a1．Expressionoffunctionalinterleukin一12frommouseintmnsgen— ictomatoplants[J]．TransgenicRes，2005，14(6)：877—885． [32]sandersPR，wimerJA，Banl鹊onAR，eta1．comp8一sonofc蛐Ii- n(．wermosaicvinls35Sand“叩alinesynth聃epmmote倡intransgen． icplanls[J]．NucleicAcidsRe8，1987．15(4)．1543一1558． [33]VerdagIlerB，deK钾hkoA，BeachyRN，eta1．Isolationandexpres- sionintmsgenictobaccoandricep】antsofthec鼬昭vaveinmosaic Viru8(cVMV)Pmmoter[J]．PlantMolBi01．1996．3l(6)：1129— 1139． [34]xieYQ，LiuYL，Men只M，eta1．1801ationandidenti6cation0fasu- perstmngpl明‘promoterf而mcottonle日fcurlMultanvims[J]． PlantMolBiol，2003，53(1／2)：1—14． [35]Shirasawa—SeoN，SanoY．NakamumS，eta1．711IepmmoterofMilk vetchdwarfvinl8component8 confe瑁e群＆“vegeneexpre8sionin bothdicotandmonocotpbts[J]．PlantceURep，2005，24(3)： 155一163． [36]st他拍eldsJ，Magallanes—1．undbackME，BeifussKK，eta1． Analysigofthemaiz。polyubiquilin—lpromoterheat8hockele‘ Ⅱlent5andgenerationofpm啪tervariantswithmodi6edexp懈sion chamte而sljcs[J]．Tran89enicRe8，2004，13(4)：299—312． [37]DeJaegerG，sche％rs，JacobsA，eta1．Boostjngheteml‘删sp廿 teinproductionint瑚sgenjcdicotyledonousseed8uBingP，心∞Z吣 仉—弘r函regulatorysequences[J]．NatBiotechn01，2002．20(12)： 1265一1268． [38]BelangerFc，KrizAL．Molecularbasisforallelicpolymo叩hi8m0f themizeg】obulin一1gene[J]．Genetic8，199l，129(3)：863— 872． [39]RussellDA，FlDmmME．Tissue—specifice。Pre68ionin咖89enic 咐i匏0ffourendospennpromotersfmmmaizeandrice[J]．Tram— genicRe8，1997，6(2)：157一168． [40]HorvaIhH，HuangJ，wong0，eta1．11heproductionof舢mbinant proteinsintransgenicbadeygrains[J]．ProcNa¨AcadSciUSA， 2000，97(4)：1914一1919． [41]TregoningJs，NixonP，KumdaH，eta1．Expressionoftetanusto“n f唧entcintobaccochlomplasts[J]．NucleicAcidsRes，2003， 31(4)：1174—1179． [42]余光创．秦宜德，伯晓晨，等．依赖于5’端非编码区高级结构的 真核生物mRNA翻译调控[J]．中国生物化学与分子生物学报。 2007，23(11)：88l一887． [43]GallieDR，SleatDE，wattsJw，eta】．The5’一leadersequence0f tobaccornosajcvirusRNAenhanceBtheexpression0ff0陀igngene transcripts协讲￡r0andm∥矗册[J]．NucleicAcid8R鹤，1987，15 (8)：3257—3273． [44]P嘴inMM，skryabinKG．rrhe5’一untmnslatedleadersequence ofpotatovinlsXRNAenh锄cestheexpre鹪ion0fahetemlogolJs gene伽∥洳[J]MolcenGenet，1992，234(2)：329—331． [45]MenkhausTJ，BaiY，zhangc，eta1．considerationsf新therecoVery 0frecombinantproteinsfmmp】ant8[J]．BiotechnolPmg，2004，20 (4)：100l—lOl4． [46]walm8leyAM，A1varezML，JinY．Expression0ftheBsubunit0f Ejc，砒^面∞尻he砒一labileentefotoxin幽afusjonproteinintmns． genictomto[J]．PlaTltCellRep．2003，2l(10)：1020—1026． [47]streat6eldsJ，MayorJM，Bad【erDK，eta1．Developmentof锄edi— ble8ubunitvaccineincomagain8tenterotoxigenicstmi璐0f西ck- 廊^如∞如[J]．Invicmce儿DevBiolP1ant，2002，38(1)：1l一17． [48]PizzaM，GjulianiMM，FontanaMR．Muc08alvaccineB：nontoxic derivatives0fLT且ndcT舶muco“adjuv蛐ts[J]．V眦cine，200l， 19(17／18／19)：2534—2541． [49]MoravecT，SchmjdlMA，He肌anEM。eta1．Producti彻ofEsche— richiacoliheatl幽letoxin(LT)BsubunjtinB0ybeanseed∞d8叫- ysi8of池immunogenicity拍anoralvaccine[J]．Vaccine．2007，25 (9)：1“7一1657． [50]赵艳敏，刘惠莉．大肠埃希菌不耐热肠毒素作为黏膜免疫佐剂 的研究进展[J]．动物医学进展，2007．38(3)：46—50． [51]streat6eldsJ． Mucosalimmuni强tionusi“grecombinantpl卸t— basedoralvaccine8[J]．Melhod8，2006，8(2)：150—157． (下转第14页) 万方数据 一14一 江苏农业科学2009年第4期 基因本体论研究进展及在生物信息数据库中的应用 栾德琴1’2，白云峰1，包文斌2，陈国宏2 (1．江苏省农业科学院农业资源与环境研究所，江苏南京210014；2。扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州225009) 摘要：随着cDNA微阵列等生物技术发展的日新月异，产生了大量丰富的生物信息资源，海量生物信息与知识的 共享是当前生物学研究面临的瓶颈问题，相对于其他查询与搜索工具，由本体论发展而来的基因本体工具在解决海量 生物web信息共享时具有独特优势，从而有望实现世界范围内的知识共享和智能信息集成。本文概述本体论和基因 本体论的概念、研究进展以及基因本体论在生物信息数据库中的应用等情况，并对基因本体论在海量生物信息处理中 的应用与研究前景进行了展望。 关键词：基因本体论；分子功能；生物信息数据库 中图分类号：Q789文献标志码：A 文章编号：1002—1302【2009)04一0014—03 随着生物信息快速增长，如何解决生物信息共享也被生 物界提上了日程，相较于其他数据库工具，起源于本体论 (0ntology)的基因本体论近年来受到生物信息科学领域的广 泛关注¨。1，其重要性也已在许多方面表现出来并得到广泛 认同旧。1。在w3C的主导下有望解决Web信息共享时的语 义问题，而实现世界范围内的知识共享和智能信息集成。本 体论属哲学范畴，在西方哲学史中，本体论是指阚述关于存在 及其本质和规律的学说”J。由于在一个本体里的术语和术 语之间的关系都是被仔细界定的，本体概念的利用，有利于制 定一个 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 的语义说明，并提高了计算的查询速度。本文就 基因本体论的提出与研究进展包括其概念、优势、基因本体组 织、工具、语言、结构以及基因本体论在生物信息数据库中的 应用等情况作一概述，并对基因本体论在海量生物信息处理 中的应用与研究前景进行展望。 收稿日期：2009一02一lo l基因本体论概述 基金要巳要塞2竺：芏型鬟i2警竺o；!曼=．j、，2006AA1022431．1’基因本体论的优势 作二翟安柔墓套：；|{}竺差妥琴萋苎鬈裳6翟罢：?2巾枷售白肖七差薹笏摹。；：虿莩暑领域内的术语存在着语义上的巨大作者简介：栾德琴(1984一)，女，硕士研究生．主要从事生物信息学方 “1⋯1“⋯。。“””⋯1”“““1”“。⋯。“ 向研究。Tel：(025)84390204。 差别，再加上语义关系及表达如不加以统一或标准化，就很难 通讯作者：白云峰，博士，副研究员，主要从事畜牧信息化管理研究。 达到各领域之间的知识共享水平，生物学家们浪费了大量时 E一眦il：blinke”@126．com。 间和精力在搜寻信息上，但是由于不同的生物数据库使用不 (上接第13页) [52]Slrea画ejdsJ，HowardJA．Pl蛐t—basedvaccines[J]．ImJ陆a． Bitol，2003，33(5／6)：479—493． [53]T∞ketcO，Mas蛐Hs，I删nskyG，eta1．1mmunogenici‘yinhu- m哪0farecombin明tbacteri8Iantigendeliyeredinatransgen；cpo． 龇[J]．N址umMed，1998，4(5)，607—609． [54]T们ketcO，Ma啪Hs，LosonskyG，eta1．Humanimmunerespon— B岛toanovelNorw且lk“msv8ecinedeIiveredintransgenicpotatoe8 [J]．JInf&tDi8，2000，182(1)：302—305． [55]T配ketcO，P且鼬魁iMF，EdelmanR，eIa1．1mmunogenicityofre． colIIbinantLT—BdeliveTedomnytoh哪明sinlmsgenicc唧[J]． V∞ci∞，2004，22(3l／32)：4385—4389． [56]K且pust8J，ModeIskaA，Figle删ic2M，el且1．AplBnt—derivt列edi- bIeVBccineagajn马IhePatitiBB“ms[J]．FAsEBJ，1999，13(13)： 1796一1799． [57]111肌aval且Y．MaIl帅eyM，Pals，etaI．Immunogenjcjtyinhum帅s of邮ediblev∽cinef0“epatitisB[J]．ProcNaⅡAcadsciusA， 2005．102(9)：3378—3382． [58】YuBibovV．H00perDc，spit8insV，et且I．ExpressioninPt卸ts锄d immunogenicityofpl蛳t“nls—b酗edexp^mentBlrabi器v∽cine [J]．V卵cine，2002，20(25／26)：3155—3l“． [59]IJamphe舡BJ，streameldsJ，JilkaJM，eta1．DeliveryDfsubunit vaccjnesinmai∞§eed[J]．JcontmIRele8∞，2002，85(1／2／3)： 169—180． [60]YuJ，L丑n咖dgewH．Apl柚卜b锄edmulticomponentvaccinep睁 tecl8micefmmenlericdj8ea∞s[J]．NatBiotechn01．200l，19(6)： 548—552． [61]wi耐帅血A，Mo驴vojM．s锄t∞MJ，da1．ProIectivelactogeniciII卜 munityco山蒯by帅础blepeptidevacciIletobdvimm州msp肛 duoedin咖ns即nicpl∞ts[J]．JG∞vimI，加04，85：1825一1832． [62]KalsnelsonA，RansomJ，Ve呻巧P，eta1．UsDA印pmvesthefirsI plam—basedv8ccine[J]．NatBiotechnol，2006，24：233—234． [63]王炜，张永光，王永录，等．口蹄疫病毒哑洲I型丫NBs／58株 P12A一3C转基因植物双元表达载体的构建[J]．中国人畜共患 病学报，2006，22(11)：1059一1064． [“]王炜，张永光，潘 丽，等．口蹄疫病毒P12A一3c免疫原基 因在百脉根中的遗传转化与表达[J]．中国人畜共患病学报． 2007，23(3)：236—239． [65]xiongAs，YaoQH，PengRH，etd．Asimple，髓p讨，hi曲一fidelj． ty卸dcosl_e艉ctiVePcR“asedtwo—st。PDNA8ynth∞is呲tllod 五"longgenesequenc幅[J]．NucleicAcidsResearch，2∞4．32 (12)：e98． [66]范锋，赵中兴，倪谷音，等．无锡地区鸡群禽流感疫苗免疫效 果[J]．江苏农业学报，2008，24(6)：867—870． 万方数据 转基因植物口服疫苗研究进展 作者： 朱宏， 赵凯， 段可， 唐雪明 作者单位： 朱宏,赵凯(上海市农业科学院生物技术研究所,上海,201106;农业部转基因植物环境安全监 督检验测试中心,上海,上海,201106)， 段可(农业部转基因植物环境安全监督检验测试中心 (上海)上海,201106;上海市农业遗传育种重点实验室,上海,201106)， 唐雪明(上海市农业 科学院生物技术研究所,上海,201106;农业部转基因植物环境安全监督检验测试中心(上海 )上海,201106;上海市农业遗传育种重点实验室,上海,201106) 刊名： 江苏农业科学 英文刊名： JIANGSU AGRICULTURAL SCIENCES 年，卷(期)： 2009，""(4) 被引用次数： 0次 参考文献(66条) 1.Mason H S.Ball J M.Shi J J Expression of Norwalk virus capsid protein in transgenic tobacco and potato and its oral immunogenicity in mice 1996(11) 2.Rodriguez R L Process for protein production in plants 1999 3.Stomp A M.Rajbhandari N Genetically engineered duckweed 2000 4.Hood E E.Kusnadi A.Nikolov Z Molecular farming of industrial proteins from transgenic maize 1999 5.Streatfield S J.Jilka J M.Hood E E Plant-based vaccines:unique advantages 2001(17/18/19) 6.Streatfield S J.Lane J R.Brooks C A Corn as production system for human and animal 2003(7/8) 7.Lamphear B J.Jilka J M.Kesl L A corn-based delivery system for animal vaccines:an oral transmissible gastroenteritis virus vaccine boosts lactogenic immu