酿酒酵母菌耐热性快速鉴别的方法研究

第 16卷第 4期 ：33 2OO6年 8月 生 物 技 术 B]_011 HN010GY V01．16，No．4：33 Aug．2OO6 目ell【J]．J．Baemr~．，2OO5，187(9)：3206—3213． 【11]Lee S J，Park S Y，Lee J J，et a1．Genes a 妣 the N—acyl homo- 8ednelactone—dt：g ngenzyme arewidespreadinmany subspecies 0fBac／／hts thur／agitm／s【J]．AppI．D ．Miert~i~i．，20O2，68(8)：3919—3924． [12]Uro~S，D’Angelo-PicardC，c日Jli口A，et a1．Novel bacteriad Ilg N—acyl hm~eserinelact~mes andtheir use as quenchers 0fquc~un—sensing— regulatedfunctions 0f plant—p日tIl c bacteria[J]．Microbiology，20O3， 149：1981—1989． 【13]Park SY， H0，JangH S，d a1．Identification 0f extracellularN— acyl homoserinelactone acyla~ 0rn a~ yces sp．and its applicati~ to quonan quenching【J]．AppI．Environ．Mla呐 ．，2O05，71(5)：2632— 2641． 酿酒酵母菌耐热性快速鉴别的 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 研究 柯涛 ，朱昌雄 ，余华顺。，马向东 ，何光源H (1．华中科技大学中英I-lUST—RRes基因工程和基因组学联合实验室，华中科技大学生命科学院，湖北 武汉 43(~4； 2．湖北大学生命科学院，湖北 武汉 430062；3．安琪酵母股份公司，湖北 宜昌443000) 摘要：目的：找出快速有效的鉴别酵母耐热性的方法。方法：酿酒酵母菌经过不同温度热激处理后，用美兰染色计数、稀释平 板计数、发酵活力直接测定法和浊度测定法对酿酒酵母菌耐热性进行了测定，同时对酵母菌的形态也进行了观察。结果： 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明浊 度测定的结果和发酵活力直接测定法测定的结果关系没有相关性，不便用来测定酵母菌的活力。用美兰染色计数、稀释平板计 数和发酵活力直接测定法所得的结果有同样的趋势，通过相关性分析，这些方法都可以表示酵母菌的活力，但各有其特点。其 中，美兰染色计数是鉴别酵母耐热性的快速有效的方法。 关键词：酿酒酵母 ；耐热性；快速鉴别方法 中图分类号：Q93—331 文献标识码：A 文章编号：1004—311X(2006)04—0033—03 Study on the Rapid Methods to Identify the Thermotolerance oI ~accmu'myces ceremsme KE T幻 ，ZHU Chang—xiong，，YU Hua—shun3，MA Xiang—aons~，HE Guang—yuan (1．China—UKHUST—RResGenetic：Engineering and Genomics Joint Laboratory，HuazhongUniversity 0f Science andTechndogy(HUST)． Wuhan 430074；2．College 0fLifeScience，I-hbeiUniversity，Wuhan 430063；3．AnlgelYeastCo．Dd，Yichang443000，China) Abl如 d：Objective：Several methods to identify the thermotoleranee of Saccharmyces cerev／s／ae are adopted after different temperature of heat shock treatments ofthe S．cerev／s／ae．Methods：The result got by the turbimemc measurement was difference from that by determination ofactivity and could not be used as a method to ident~ the activity ofthe thermotoleHlrIce of S．cere~s／ae．Resulls：The results showed the sⅢl1e trends of thermotoleranee of S．cerev／s／ae among the methylene blue stain method，the plate viable total co,mr method and the determination of activity me thod．These three methods could all be used to reveal the activity of S．o日 after heat shock trea~aents but had variety characteristic of them，whilethemethod ofmethylene blue stain giVethe exact activityofthenn~oleraneeofS．cerev~iae anditisthe nl0I mpid andthe simplest me thod． Key words：Saccharmyces cerev／s／ae；thermotoleranee；rapid iden右 ng me thod 传统的酿酒酵母酒精发酵的最适温度在 28—33℃，一般 不会超过36℃，但在气温较高地区和季节则无法保证正常生 产。应用耐高温酵母生产酒精，可节约能源、提高出酒率、缩 短发酵周期、提高设备利用率并维持夏季正常生产，因而对耐 高温酿酒酵母的筛选和酵母耐热机制的研究和应用日益受到 重视 0 。但如何准确快速鉴定酵母菌的耐热性却一直存在 争论。早期研究者采用活细胞计数的方法如美兰染色计数 法 和稀释平板计数法 等进行了研究，用细胞数量的多少 代表酵母的耐热性的强弱。结果发现美兰染色计数和稀释平 板计数的活细胞数差距达几个数量级 ，与细胞活力的相关性 也未做分析，对作出的结论无法肯定，且稀释平板计数法操作 复杂，所需时间也很长。为了解决这个问题，本研究分别采用 美兰染色计数法、稀释平板计数法、发酵活力直接测定法 】、 浊度测定法 和形态观察法等方法对在不同温度条件下热激 处理后的酿酒酵母菌的耐热性进行了鉴定，并对不同方法测 定的数据进行了相关性比较分析，以期找到一种可准确简便 快速鉴别酵母菌的耐热性的新方法。 l 材料与方法 1．1 材料 1．1．1 实验材料：酿酒酵母(Sacchannyces cereds／ae)菌株 YY， 安琪酵母股份公司提供。 收稿日期．．2006—03—11；修回日期,,2006—06—16 基金项目：国家基础研究发展规划 973项 目(2O02cB1l1302)；国家自 然科学基金资助项目(如 7唧 ) 作者简介：柯涛(1970一)，女，在读博士生，研究方向：微生物分子生物 学 ，E—mail：ketaol@163．com；*通讯作者：何光源(1958一)，男，教授， 华中科技大学特聘教授，教育部跨世纪人才，博士生导师，从事基因工 程研究，Tel：027—87792271，E—IIll|il：gtmng3~mn．he@bbsrc．ac．1llco 1．1．2 试剂 ：酵母抽提物(OXOID LTD，England)，胰蛋 白胨 (OXOID LTD，Er· and)，葡萄糖(国产分析纯)，琼脂粉(广州)。 美兰染色液：以pH 6．0的0．02mol／L磷酸缓冲液配制的0．05％ 美兰染色液(w／v) 。 1．1．3 仪器：恒温培养箱，光学显微镜 ，751型紫外可见分光 光度计。 1．1．4 培养基：YPD液体培养基：胰蛋白胨2％、酵母抽提物 1％、葡萄糖2％，prI 5．0—5．5，121℃灭菌20rain。固体培养基 为在液体培养基基础上加入 1．O％琼脂粉。 1．2 方法 1．2．1 培养条件：接种酿酒酵母YY到固体斜面培养，30℃培 养24h，从培养好的斜面转接到装有灭菌的100ml液体培养基 的三角瓶中，30℃ 200r／rain培养 15h。 1．2．2 热激处理和耐热性培养方法：在每个装有 5ml YPD液 体培养基的试管 中，加入培养 15h后的菌液0．5ml，分别在 30℃、37℃、42℃、45℃、48℃热激处理30rain，然后5O℃检验培 养 20rain。对照 CKI为不经热激和 5o℃检验培养的酵母菌。 对照 c 为不经热激的样品直接50~C检验培养 20rain。检验 培养结束后，进行耐热性检测。每次实验重复3次 。 1．2．3 耐热性检测方法 1．2．3．1 美蓝染色活细胞计数：参照文献L3J。 1．2．3．2 稀释平板计数：用YPD固体培养基进行稀释平板计 数。 1．2．3．3 发酵活力直接测定：取0．5ml菌液于装有20ml YPD 培养基的艾氏管中，30℃静置培养，记录从接种时间到产满 10ml气体所需的时间，以此来检查酵母菌的发酵活力【5】。 1．6．4 浊度的测定：取 2．0ml菌液于50ml的离心管中，用无 菌水洗涤沉淀，最后用 10ml的无菌水悬浮沉淀，以无菌水为对 照，在波长 650、680、70o衄 下测其透光率L6J。 维普资讯 http://www.cqvip.com 生 物 技 术 第 16卷第4期 2 结果与分析 2．1 不同温度条件下热激处理对酵母茵形态的影响 对热激处理过的菌液进行细胞形态学观察。经不同温度 3o℃、37℃、42℃、45℃、48℃热激处理过程中的酵母菌，其细胞 形态和细胞内含物在显微镜下的折光率上呈现出了明显差 别，42~C热激处理的酵母与其他温度热处理的酵母相比，形态 更加饱满一致，圆形、椭圆形居多，出芽率高，且与30~C培养条 件下的细胞形态相差不大。未经热激处理直接50~C检验培养 20min的细胞则形态异常，小而稀少，呈老化状态。 2．2 美兰染色法测定不同温度条件下热激处理的酵母茵耐 热性分析 对不同热激温度条件下的酵母菌 50~C耐热检测后，进行 美兰染色，计活细胞数，实验结果见表 1。 表 1 美兰染色法测定不同温度条件下热激处理的酵母菌耐热性分析 Table 1 Th e analyses 0fthe thermotolerance 0f S、cerev／s／ae at different tern— peratures ofheat shocktreatment usingmethylene bl — u — e stainmeth — od — 从以上结果可看出，42~C热激处理后的酵母菌耐热性最 强，活菌数最大，48~C的处理活菌数最低。42~C的处理和其他 相比达到了显著水平，各处理之间的数据也有一定的差距，因 此利用美兰染色法反映出了不同热激温度处理之间的差异。 2．3 稀释平板计数法测定不 同温度条件下热激处理后酵母 茵的耐热性分析 对不同热激温度条件下的酵母菌 50~C耐热检测后，进行 稀释平板计数 ，实验结果见表 2。 表 2 稀释平板计数法测定不同温度条件下热激处理后酵母菌的耐热 性分析 Table2 The analyses 0fthe thermotolerance of S．cerev／s／ae at diffemat tern- 由表2可看出，通过稀释平板计数得到的数据显示，37~C、 42~C、45~C热激处理之间的酵母菌耐热性差异极其显著，同时 与其他热激温度处理的差异极其显著，30~C、48~C、c 之间差 异不显著。但总体也可以反映各个处理之间的差异。 2．4 发酵活力法测定不同温度条件下热激处理后酵母 茵的 耐热性分析 不同热激温度处理后，经50~C耐热检验培养，酵母的发酵 活力检测结果见表 3。 从表 3中可看出，42~C热激处理后的酵母菌耐热性最强 ， 发酵活力最大，48~C的处理发酵活力最低。各个热激温度处 理相互之间的差异达到了极其显著水平，利用发酵活力测定 的方法可以准确地反映不同热激温度处理之间的差异。 表 3 发酵活力法测定不同温度条件下热激处理后酵母菌的耐热性分析 Table 3 Th e analyses 0fthe thermotolerance 0f S．cerev／s／ae at different tern- ~ amres 0fheat shocktreatmentusingthe determination 0factivitymethod 2．5 浊度法测定不同温度条件下热激处理后酵母茵的耐热 性分析 对不同热激温度条件下的酵母菌 50~C耐热检测后，在波 长650、680、700nm下测其透光率。浊度用透光率T表示，T值 越低表示浊度越高，结果见表 4。 表4 浊度法测定不同温度条件下热激处理后酵母菌的耐热性分析 Table4 Th e analyses 0fthe thermotolerance 0f S．cerev／s／ae at different tern一 ~ amres 0fheat shock tremmentusingtheturbime~clr 8sll 盯哪tsme thod 从表 4可看出，随着热激温度的升高 ，在 650nm、680nm、 700nm波长下，透光率不断上升，和前面的几种方法测出的结 果没有相关趋势 ，这说 明用浊度不能反映酵母菌经热激处理 后的活细胞数和活力的关系。 2．6 三种耐热性检测方法的相关性分析 为了便于分析，以美兰染色、稀释平板计数、发酵活力法 中42~C条件下处理所得实验数值定为 100％，将其他数据条件 下的数据做相应换算处理，绘制成图1。 l20 l00 0 ． 20 ． 5 30 35 40 45 1 0 Temperature ofheat shock(℃) 图 1 酵母菌耐热性不同测定方法结果的趋势对比 Fig．1 Com~ 8Oll 0fthetrends 0fdiffematlI_le略u Ⅱ哪tmethodsforthenm- ~lerance 0f S．cerev／st~ 从图1可以看出，美兰染色法、稀释平板计数法和发酵活 力法有很强的相关性。因此，可以采用操作最简便的美兰计 舳 ∞ 加 加 ^ v Q∞鼻8 3I＆ 褥求阻 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 16卷第 4期 ：35 2OO6年 8月 生 物 技 术 BIaIECHNo1 0GY V01．16，No．4：35 AIlg．2OO6 数法来测定酵母菌的耐热性。 3 讨论 3．1 通过以上实验结果，我们可以看到，应用美兰染色计数 法、发酵活力法和稀释平板法都能得到酵母菌热激处理后的 耐热性鉴别结果，比较而言，几种方法中酵母活力直接测定法 比较准确，但这种方法操作复杂，稀释平板法的缺点是耗时较 长，而浊度测定法与其他几种方法没有一致性，不能反映酵母 菌热激后活力的强弱。所以应用美蓝染色记数法得到酵母菌 的耐热性的特性，结果可靠，方法简单。 3．2 通过对以上几种方法的比较，我们找到了一种初步筛选 耐热性的酵母菌株的好方法，即经过热激处理或高温培养后， 用美兰染色法所测数据可以直接反映该菌株耐热性的强弱。 同时也说明活菌数可以直接表达酵母菌的发酵活力。 参考文献： [1]陈叶福，王正祥，王晨霞，等．耐高温酵母菌株的分离、鉴定及其酒 精发酵初步研究[J]．微生物学通报，2OO3，3O(5)：24—27． [2]路玲玲，檀建新，张伟，等．高温和高酒精浓度下的酵母特性[J]．中 国酿造，2OO4，138：5—7． [3]杜连祥，王昌禄，鲁梅芳．工业微生物学实验技术[M]．1版．天津： 天津科学技术出版社，1992：45—46． [4]钱存柔，黄仪秀．微生物学实验教程[M]．1版．北京：北京大学出版 社。1997．65—66． [5]马向东，朱昌雄，余华顺，等．酵母菌耐热性的最适热激条件研究 [J]．华中科技大学学报：自然科学版，2OO4，12：88—9o． [6]Col-ry J E．Sugar and p0lyolpem~ ility ofSabnonega and 0611~ ilic yeast cell~ 1"811e8 messta~ by m ，md its relallon to heat resi~nee [J]．JAl3p1．Baetefio1．，1976，4O(3)：277—284． [7]马向东，郭永豪，余华顺，等．三株酵母的抗热激性与 l基因表达 的关系[J]．郑州大学学报：理学版，2OO5，37(1)：3o一33． [8]郭永豪，黄春晓，余华顺，等．一个耐高温酵母菌株的 q)sl基因克隆 及序列分析[J]．生物技术 ，2OO5，15(z)：3—5． 木霉 I3—1，3一葡聚糖酶的分离纯化 唐 治玉，熊善柏 (华中农业大学食品科技学院，湖北 武汉 43oo7o) 摘要：目的：对木霉菌株 锄 2所产 一1，3一葡聚糖酶的分离纯化方法进行研究。方法：粗酶液分别用硫酸铵、乙醇和丙酮进 行沉淀，再用 DEAE—Sepharose CL一6B离子交换层析进一步分离纯化，并用 SDS—PAGE法测其分子量。结果：硫酸铵分段盐析法 沉淀酶蛋白的效果优于乙醇和丙酮沉淀；盐析得到的酶蛋白经透析浓缩后，再经DEAE—Sepharose CL一6B层析分离，可得到单一 酶蛋白，总酶活回收率达 78．71％，比酶活达到 689．9U／rag，提高了53．74倍，经 SDS—PAGE法测得该 一1，3一葡聚糖酶的分子量为 80．137kDa。结论 ：采用硫酸铵分段盐析和离子交换层析法可获得电泳纯的 G一1，3一葡聚糖酶，且酶活回收率高。 关键词： 一1，3一葡聚糖酶；分离纯化；木霉 锄 2 中图分类号．*TQ925．9 文献标识码：A 文章编号：1004—311X(2006)04—0035—04 Separation and Purification of an B一1，3一~Jucanase from Ttichoderma Strain TANG i—yu．XIONG Shah—bai (College 0f Food Science and Tedmolo~"，Hua2hong A nl】ral University，Wuhan 430070，China) A1)strad：Objective：The purification methods of 一1，3一glucanase from Tr／choderma strain珊 2 were investigated．Methods：Crude enzyllle was precipitated by ammonium sulfate，ethanol and acetone respectively，andthen purified byDEAE—SepharoseCL一6B anion—excl~nge clam· matogtaphy．Molecularweight ofthe purified p一1，3一glucanasewasdeterminedby SDS—PAGE．Results：Two—step s8ld“g—out using ammo- nium sulfate was betterthan ethanol Or acetone precipitation．Crude enzyine was salted—out by anl／lm um sulfate，followed by alalysea，COlleen— trated with polyethylene 6 000。and fl1．rthel"purified by DEAE—Sepharose CL一6B anion—exchange chromatography．The purified activity I'~20％r— ery of p一1，3一glucanase was 78．71％，and speeitic activity increased 12．839U／mg to 689．932 U／mg．And the purified 一1，3一glu． (3a13ase was a single band on both Native—PAGE and SDS—PAGE，with molecular weight of80．137kDa．Cbndu嫡0Ils： 一1，3一Glucanase of electrophoresis gracle was obtained by ammonium sulfate two—step salting—out and anion—exchange chromatography，and its activity recovery was high． Key words~ 一1，3一glucanase；separation and purificadon；Tr／chodenna strain锄 2 一 1，3一葡聚糖酶( 一1，3一glucanase，EC3．2．1．39>是一 类能特异作用于 一葡聚糖中p一1，3一糖苷键的水解酶，可应 用于啤酒和饲料工业 。 、制备酵母原生质体 、多糖改性增 溶 J、植物有害真菌防治与真菌细胞壁结构的分析 。 等方 面。该酶广泛存在于动物、植物、微生物中，已从真菌 、细 菌 以及放线菌 。 等微生物中分离到产 B一1，3一葡聚糖酶 的菌株，但是目前分离得到的菌株产酶量较低，最高的也仅 42．13IU／mL。因此筛选出产酶量大、活力高的菌株也就成为众 多研究者追求的目标。 木霉 锄 2是本研究室从土样中分离得到的产胞外 G一1， 3一葡聚糖酶的菌株，其液态发酵酶活力 71．09IU／mL，固态发 酵酶活力则高达583．02IU／g·ssc，且具有专一性强、酶活力高、 易分离纯化、发酵周期短等优点，是一种非常具有开发潜力的 p一1，3一葡聚糖酶产生菌。本文对木霉p一1，3一葡聚糖酶进 行分离纯化，为进一步研究该酶奠定基础。 l 材料与方法 收稿日期-'2006—02一l8；flJ回日期-'2006—05—02 攻关项目：湖北省重大科技攻关项目(2003AA2OlAo6) 作者简介：唐治玉(1979一)，女，硕士研究生，从事食品酶学方面的研 究 ，E—inllil．*tzhy79018105@yahoo．cola．∞；*通讯作者：熊善柏 (1963 一 )，男，教授，博士生导师，从事食品酶学及食品加工技术研究，E— mail： @mail．hzau．edu．cao 1．1 材料 1．1．1 实验材料 供试菌株：木霉 I~O2(Ttichoderma Strain I~O2>由本研究室 分离得到；低糖酵母粉：宜 昌安琪酵母股 份有 限公司提供 ： I砌inarin from Lam／nar／a啦 口：Sigma Co．，U．S．A；分子量 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 蛋白质：肌球蛋白(200kO)，钙调素结合蛋白(130k0>，兔磷酸化 酶B(97．4kO>，牛血清白蛋白(66．2kO>，兔肌动蛋白(43k0)，色 谱纯，中国科学院上海生物化学研究所。 1．1．2 试剂 醋酸钠：分析纯，天津市博迪化工有限公司；冰醋酸：分析 纯，国药集团化学试剂有限公司；氯化钠：分析纯，天津市科密 欧化学试剂开发中心；硫酸铵：分析纯，上海化学试剂有限公 司；无水乙醇：分析纯，上海振兴化工一厂；丙酮：分析纯，国药 集团化学试剂有限公司。 1．1．3 仪器 可见分光光度计：722S型，上海精密科学仪器有限公司； 净化工作台：FLC一3型，哈尔滨东联有限公司；恒温培养振荡 器_-Z~WY一2102C型，上海智城分析仪器制造有限公司；梯度 混和器：TH一1000型，上海青浦沪西仪器厂；自动部分收集器： BS—IOOA型，上海沪西分析仪器厂有限公司；电子恒温数显水 浴锅：HIt一4型，江苏国华仪器厂；手提式压力蒸汽灭菌锅： YXQ．SG41．28O型，上海化线核子仪器有限公司；稳 压稳流 电 维普资讯 http://www.cqvip.com