抗原抗体反应与非标记免疫分析

抗原抗体反应与非标记免疫分析 概念：是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合。体内反应：中和消除异物，维持正常。体外反应：诊断、鉴别抗原或抗体。 血清学反应：≠抗原抗体反应第一节抗原抗体反应 抗原抗体反应在体外，依相应抗原物理性状（颗粒状或可溶性）以及反应的条件（电解质、补体等）不同，可出现凝集、沉淀、细胞溶解和补体结合等反应。 分为两个阶段第一阶段：特异性结合——不可见第二阶段：免疫复合物沉积——可见物质基础:抗原表位与抗体高变区间的互补结合抗原表位与抗体高变区的沟槽分子表面的结合抗原抗体之间的结合力亲水胶体转化为疏水胶体一、抗原抗体的结合力 抗原和抗体的结合是互补性的特异性结合 不形成牢固的共价键，通过非共价键结合 这种弱的结合力涉及几种分子间的作用力*1．静电引力：相反电荷的基团之间。距离越近，作用力越强。*2．范德华引力：电子云产生。*3．氢键结合力：氢原子间。*4．疏水作用：疏水基团排水积聚的力。最强的抗原抗体反应力。静电引力（electrostaticforces）范德华引力:作用最小（vanderWaalsinteractions）氢键:最具特异性（hydrogenbond）疏水作用力:作用最大（hydrophobicinteractions）抗原抗体结合力示意图抗原抗体结合力二、抗原抗体的亲和性和亲和力 亲和性是抗体分子上一个抗原结合点与对应的抗原决定簇之间的相适应性而存在着的引力，这是抗原与抗体之间固有的结合力。 抗体亲合力是指反应系统中复杂抗原与相应抗体之间的结合能力。多价优势。 亲和力与亲和性、抗体的结合价和抗原的有效决定簇数目相关。亲和力越大，抗原抗体结合越牢固。三、亲水胶体转化为疏水胶体 血清学反应条件下，抗原抗体均带负电荷，使极化的水分子在其周围形成水化层，成为亲水胶体。 当抗原与抗体结合后，表面电荷减少，水化层变薄；而且由于抗原抗体复合物形成后，与水接触的表面积减少，由亲水胶体转化为疏水胶体。 在电解质作用下，各疏水胶体之间靠拢，形成可见的抗原抗体复合物。返回亲水胶体疏水胶体转化NaCl可见反应可见反应(沉淀)抗原抗体复合物(疏水胶体)电解质抗原(亲水胶体)抗体(亲水胶体)+第二节抗原抗体反应的特点1.特异性2.比例性3.可逆性特异性：抗原与抗体结合反应的专一性抗原抗体反应特异性示意图分子基础：抗原表位与抗体分子高变区之间空间构型的互补性一、特异性*交叉反应(crossreaction)两种不同的抗原物质具有部分相同或类似结构的抗原决定簇，则可与彼此相应的抗体反应。交叉反应特异性示意图前带：抗体过量后带：抗原过量等价带：抗原抗体比例合适抗原抗体反应比例性示意图比例性：抗原与抗体发生可见反应需遵循一定的量比关系二、比例性网格学说（latticetheory）抗体过剩抗原过剩抗体抗体比例合适比例性示意图抗体过量比例合适抗原的量抗原过量抗体沉淀的量前带等价带后带三、可逆性 概念：是指抗原与抗体复合物在一定条件下可解离为游离抗原与抗体的特性。解离后抗原抗体仍保持原有特性。 一定条件：低pH、高浓度盐等。 常用于解离抗原抗体复合物的物质有：3mol/L硫氰化钾、pH2.40.1mol/L甘氨酸、7mol/L尿素等。抗体混有Ag抗体-Ag抗体-Ag分离剂一、抗原抗体结合二、分离抗体可逆性示意图抗体111可逆性K（亲和常数）=Ag+AbAgAb四、影响抗原抗体反应的因素（一）反应物自身因素*抗原：1.理化特性2.Ag决定簇数量3.Ag决定簇种类例如，可溶性抗原与相应抗体反应出现沉淀，而颗粒性抗原与相应抗体反应则出现凝集;单价抗原与抗体结合不出现可见反应;粗糙型细菌在生理盐水中易出现自凝；红细胞与IgG类抗体结合不出现直接凝集等。*抗体：1.来源2.特异性与亲合力3.浓度来源：来自不同动物的免疫血清，其反应性有差异。家兔等大多数动物的免疫血清具有较宽的等价带，通常在抗原过量时才易出现可溶性免疫复合物；马等大动物和人的免疫血清等价带较窄，少量的抗原或抗体过剩，均可形成可溶性免疫复合物；家禽免疫血清不能结合哺乳动物的补体，并且在高盐浓度（80g/L）NaCl溶液中沉淀现象明显。单克隆抗体一般不适用于沉淀反应或凝集反应。（二）环境条件：*电解质：0.85%NaCl*酸碱度：pH6～9*温度：15～40℃*酸凝集：当pH为3左右时，接近细菌Ag的等电点，可出现非特异性凝集。酸碱度温度作用时间 抗原抗体反应应有足够的时间，不同反应时间不同。抗血清：指抗原人工免疫实验动物，获得含特异性抗体的血清。多克隆抗体（PAb）：多个抗原决定簇免疫机体所产生的多种抗体的混合物。多个B淋巴细胞克隆所分泌的抗体单克隆抗体（monoclonalantibody，MAb）：只针对某一特定的抗原决定簇，纯度高的抗体。单个B淋巴细胞克隆所分泌的抗体第三节抗血清的制备和抗体的纯化抗原表位，抗原结合位点，抗原决定簇（epitope）Ag1234Ag单克隆抗体B1B2B3B4B3B3B3B32多克隆抗体3411、单克隆抗体的特点 特异性强，具有抗原结合位点的专一性。（不是抗原的专一性！） 因结合位点的单一性，有时不易捕捉抗原，一株单克隆抗体与抗原不易产生凝集反应或沉淀反应。 抗体的性质相同，容易纯化、标记。2、多克隆抗体的特点多抗是单抗的混合物，因此多抗的性质是一个群体综合的性质。 特异性一般比单抗差因为由不同性质的抗体组成，只要其中含交叉反应的抗体，多抗就有交叉反应，所以多抗更容易有交叉反应。比单抗更容易捕捉抗原。因为含有抗不同表位的抗体，多种抗体都可与抗原结合。 抗体的纯化、标记比单抗难，因为含有各种不同类型、亚类的抗体，提纯、标记的方法有所差别。同时，血清中含有的杂蛋白比较多。二、抗体的制备1、单克隆抗体的制备无法采用生物化学的方法从多抗中分离必须采用细胞杂交的方法来制备能否筛选到理想的单克隆抗体有技术问题也有机遇问题制备单克隆抗体的基本原理：致敏的B淋巴细胞骨髓瘤细胞（myeloma）（能够分泌特异性的抗体，（不能分泌特异性的抗体，不能在体外长期生存）但能在体外长期生存）阳性杂交瘤细胞(hybridoma)（既能分泌特异性抗体，又能够在体外长期生存）克隆化培养（产生单克隆的阳性杂交瘤细胞）生产单克隆抗体1222212脾脏细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞融合**2、多抗的制备常用的免疫动物免疫的基本步骤1）常用的免疫动物兔子（rabbit）：最常用于自制抗体，抗体量较多。（新西兰，大耳白）小鼠（mouse）：可用于自制抗体，但抗体量很少。（BALB/C，昆明鼠）大鼠（rat）：可用于自制抗体，免疫过程要麻醉动物。（Wistar大鼠）羊（sheep、goat）：常用于较大批量地生产抗体（商品）。马（horse）：常用于大批量生产治疗用抗体（商品）。豚鼠（guineapig）：国外实验室常用。2）免疫的基本步骤基础免疫：首次，抗原用量大，用弗式完全佐剂（ComplateFreund’adjuvand，含矿物油，卡介苗等）。加强免疫：第2次以后，抗原量减半，多次，间隔2-4周，用弗式不完全佐剂（IncomplateFreund’adjuvand，不含卡介苗）。 取血测效价：加强免疫两次或三次以后的第7天取血。 放血制备血清：最后一次免疫后7-10天放血。（在三角瓶中加一些生理盐水，放血放置一段时间，凝固，吸取血清，离心，分装，冻存）3)如何免疫兔子 2000g（雌雄均可），健康，无病原（小鼠20g，大鼠200g） 基础免疫0.5ml抗原(含0.25~0.5mg蛋白或108颗粒抗原)0.5ml弗式完全佐剂(CFA)（小鼠0.2ml）制备抗原-佐剂乳化液背部、颈部皮下多点注射或腿部肌肉注射（注意：不要剪毛） 加强免疫间隔2-4周,可进行多次0.5ml抗原（蛋白量减半）0.5ml弗式不完全佐剂（IFA）制备抗原-佐剂乳化液背部、颈部皮下多点注射或腿部肌肉注射 免疫3~4次以后从耳静脉取血检测效价酶联法：1:104以上，能达到1:106。免疫双扩散：1:16以上，能达到1:64 效价达到要求的可放血制备血清可一次放血（颈动脉）也可多次取血（耳静脉）单抗与多抗的区别单抗多抗抗体组成单一复杂抗体性质个体的属性群体综合的性质纯化标记容易，效果好难度高一些种属来源绝大多数是小鼠兔子、羊、豚鼠等制备周期长（最短4个月）短（2个月）制备技术复杂简单经费多少什么情况需要制备单抗 目的蛋白有结构类似物 抗原不纯，无法分开 多抗效果不好（已排除非特异性反应） 希望将抗体用于治疗，研制成药品 希望将抗体用于诊断，研制成诊断试剂三、抗体的纯化盐析法（硫酸铵沉淀）辛酸-硫酸铵沉淀法离子交换法亲和层析法凝胶过滤法1、盐析法（硫酸铵沉淀）原理在高浓度中性盐存在下，蛋白质在水中的溶解度降低而产生沉淀不同蛋白质的盐析常数不同硫酸铵的加入量通常以饱和度表示（100%饱和度：767g/L）*硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。 主要步骤在血清或腹水中加入硫酸铵使抗体沉淀；4℃高速离心，弃上清，溶解沉淀；可反复操作，逐级降低硫酸铵的浓度:50%饱和度：0.313g/ml45%饱和度：0.277g/ml40%饱和度：0.243g/ml最后一次离心后，用少量PBS溶解沉淀，透析，测定浓度。2、正辛酸-硫酸铵沉淀法 原理两步沉淀：先加正辛酸去杂蛋白。正辛酸是一种有机酸，在酸性条件下（pH4.5）可使大分子的杂蛋白沉淀。后加硫酸铵使抗体沉淀。主要步骤：调节样品的pH值，加入正辛酸（25µl/ml），搅拌30分；室温高速离心（10000g，30分钟），收集上清液；再加入硫酸铵（40%饱和度）；4℃高速离心（10000g，15分钟），弃上清；溶解沉淀，透析，测定浓度。3、离子交换法 原理利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进行物质分离。DEAE是一种阴离子交换剂，自身带正电荷（Diethylaminoethyl，二乙氨基乙基）将样品的pH值调至等电点以上，使样品带负电荷。采用盐溶液洗脱，通过高浓度的带同种电荷的离子(Cl-)置换被分离的组分.+++++--------带负电荷的被吸附上带负电荷少的先被置换带负电荷多的后被置换 主要步骤先用硫酸铵沉淀抗体，粗提；将样品过柱；洗去没有结合的物质；用梯度NaCl溶液洗脱，等量收集洗脱液；紫外分光光度计测量，保留A280值明显升高的样品；汇集样品，浓缩，测定浓度。4、亲和层析法 原理利用蛋白质之间的特异性结合（抗体-抗原，受体-配体）将一种配基与凝胶颗粒结合，捕捉与它相配的物质。洗脱一般采用改变pH值的方法使用前样品结合(Binding)洗脱(Elution)5、凝胶过滤法（分子筛） 原理将样品混合物通过一定孔径的凝胶介质，由于流经路径的差异，使不同分子质量的组分分离。大分子物质直接从凝胶颗粒外通过，走得快；小分子物质进入凝胶颗粒的内部再出来，走得慢。适合于IgM类抗体的纯化（五聚体，分子量约800KD） 主要步骤将腹水或血清处理后上柱，样品要浓；(可用G-200，柱子要长，80-100cm)待样品入柱后，用缓冲液过柱；等量收集洗脱液，测定洗脱液的A280值。收集第一峰。第四节抗原与抗体反应-免疫检测法抗原与抗体结合后，只有出现可见的反应，如凝集、溶血、沉淀试验等，或用荧光素、酶、放射性同位素等标记方法提高可测性，才便于在免疫检测中运用。可见性反应的出现，对抗原抗体分子合适比例的要求远比对彼此绝对量方面要高得多。这就是说，一方面在进行免疫检测时要注意抗原、抗体的用量；另一方面只要提高可见度或可测性，便可大大提高免疫检测方法的灵敏度。 反应类型 实验技术 结果判断 凝集反应 直接凝集试验 观察凝集现象 间接凝集试验 同上 抗球蛋白试验 同上 沉淀反应 液相沉淀试验 观察沉淀，检测浊度 免疫电泳技术 观察扫描沉淀峰、沉淀弧 补体参与的反应 补体溶血试验 观察测定溶血现象 补体结合试验 同上一、凝集反应凝集反应是指颗粒抗原与相应抗体结合反应出现的可见性现象。颗粒抗原如完整的细菌、红细胞等与相应抗体相混合，在一定条件下出现凝集。凝集反应中抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。颗粒性抗原（或可溶性抗原吸附在与免疫无关的载体上）与相应抗体在适当条件下形成肉眼可见的凝集小块。*特异性。可逆性。以非共价键结合可见性。Ab＋Ag------当比例合适----形成肉眼可见聚合物。Ag决定簇--1、直接凝集反应： 天然颗粒性抗原（细菌或细胞）与相应抗体直接结合所出现的凝集现象：（1）玻片法—定性试验：已知Ab未知Ag(?)ABO血型鉴定，细菌种属抗原型别的鉴定+（2）试管法—半定量试验：诊断伤寒副伤寒的“肥达氏反应”病人血清倍比稀释*机体感染伤寒、副伤寒杆菌后会产生相应抗体，正常人因隐性感染或预防接种，血清中可含有一定量的抗体。一般当H≥1：160，O≥1：80，副伤寒凝集价≥1：80时，才有诊断意义。病程中应每周复查一次，如病人H与O的凝集价均高于参考值或较原凝集价升高4倍以上，则患伤寒的可能性很大。若H凝集价高而O低于正常值，则可能是以往预防接种疫苗的结果或非特异性回忆反应所致。+很小的凝集颗粒混浊-无凝集现象与对照相同++小、部分凝集块中等混浊+++大多凝集管底轻度混浊++++大的凝集块清亮凝集程度沉淀上清*管底沉淀凝集程度最高稀释比例待测血清的滴度一般当H≥1：160，O≥1：80，副伤寒凝集价≥1：80时，才有诊断意义。*2、间接凝集反应++—载体：红血球：间接血凝试验乳胶颗粒：间接乳胶凝集试验*载体可溶性抗原致敏致敏颗粒NS凝集颗粒常用的载体颗粒有人O型红细胞、绵羊红细胞、乳胶颗粒等。如载体颗粒是红细胞，称间接血凝试验；若为乳胶颗粒，则称为乳胶凝集试验。如用乳胶凝集试验测定相关抗体，可用于辅助诊断钩体病、血吸虫病、类风湿性关节炎等。3、间接凝集抑制试验乳胶妊娠试验*人绒毛膜促性腺激素二、沉淀反应可溶性抗原与相应抗体发生特异性结合，在适当条件下而出现的沉淀现象。可溶性Ag相应Ab★特点： 抗原分子量小，是可溶性抗原 抗原抗体复合物中主要由抗体组成 反应时常稀释抗原 反应结果以抗原的稀释度来判定效价☆沉淀反应的分类：☺液体内沉淀试验 环状沉淀试验 絮状沉淀试验 免疫浊度沉淀☺凝胶内沉淀试验 单向琼脂扩散试验 双向扩散试验☺凝胶免疫电泳技术 对流免疫电泳 免疫电泳 火箭免疫电泳 免疫固定电泳1、絮状沉淀反应一系列试管中加入等量的抗体和递增量的抗原，在中性条件下37℃保温1-2h，便可见到絮状的蛋白质沉淀。可用于寻找抗原抗体反应的合适比例，检测抗原抗体的分子比。在Ab浓度不变的情况下随着Ag浓度不断上升免疫沉淀反应变化如图所示各管Ag倍比稀释加入抗血清各管Ab量不变振摇混匀、37℃孵育沉淀量不同轻摇2.环状沉淀试验【原理】：将Ag溶液叠加在细玻璃管内的Ab液面上，37℃保温10-20min二者在两液面交界处形成白色沉淀环。【评价】：简便快速只能定性敏感性低目前多被其他方法替代3、双向琼脂扩散试验：是利用琼脂凝胶作介质的一种沉淀反应。琼脂是多孔的网状结构，可使大分子物质通过，分子的扩散作用使分别两处的抗原抗体相遇，比例合适时形成沉淀。可观测到沉淀弧。沉淀弧的特征与位置取决于抗原分子的大小、结构、扩散系数和浓度等。当抗原、抗体存在多种体系时，会出现多条沉淀弧。双向琼脂扩散试验的应用1.检测未知抗原或抗体2.抗原性质分析3.抗体效价滴定4.抗原或抗体纯度鉴定生理盐水配制1%-5%的琼脂，取4mL倒在显微镜用的载玻片上，凝固后打孔，中心孔滴入抗原，外周孔滴入抗体用于测定抗体效价；中心孔滴入抗体，外周孔滴入抗原，用于检测抗原的存在和定性抗原。染色标本图1.抗原抗体双向自由扩散2.24h出结果3.呈现沉淀线或弧3.PrecipitationReactions*特异性。可逆性。以非共价键结合可见性。Ab＋Ag------当比例合适----形成肉眼可见聚合物。Ag决定簇--A:浓度Ag、Ab及扩散率近似B：浓度Ag、Ab近似，扩散率Ag＞AbC：浓度Ag、Ab近似，扩散率Ag＜AbD：浓度Ag＞Ab，扩散率近似E：浓度Ag＞Ab，扩散率Ag＞AbF：浓度Ag＜Ab，扩散率Ag＜Ab4、单向免疫扩散：又称单向琼脂扩散，是定量抗原的一种检测方法。与双向扩散不同的是在琼脂中含有一定量的抗体，孔内加入未知量的相应抗原。在37℃保温过程中，孔内的抗原向周围扩散，与抗体形成沉淀圈。沉淀环大小与Ag浓度呈正相关。倾注平板　打孔　加样　放置37℃　24～48h观察沉淀环单向扩散试验（平板法）*含抗人IgG琼脂制成平板待测血样(IgG浓度?)1.测定沉淀环直径2.在 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 曲线上查找相应抗原浓度绘制标准曲线免疫电泳是一种将区带电泳和双向免疫扩散相结合的免疫化学分析技术。5.免疫电泳试验实验原理先将抗原样品在琼脂平板上进行电泳，使其中的各种成分因电泳迁移率的不同而被分离成肉眼不可见的区带。停止电泳后，在与电泳方向平行的槽内加入相应抗血清，使抗原和抗体呈双向扩散，已分离的各抗原与相应抗体在琼脂中扩散而相遇，在二者比例合适处形成肉眼可见的沉淀弧。根据沉淀弧的数量、位置和形状与已知标准抗原进行比较，可分析、鉴定样品中所含的抗原成分及其性质。应用粗略分析纯化抗原或抗体的纯度。正常及异常体液中蛋白质分析。免疫后抗体组分的动态变化研究。6.火箭电泳是单向免疫扩散和电泳相结合的一种定量检测Ag的技术。在含已知Ab琼脂中打孔，再加入待测Ag，通电后Ag定向地通过含有Ab的琼脂，相应的Ag和Ab在比例合适处形成沉淀峰。沉淀峰的高度与Ag浓度呈正比。该法可定量检测Ag。三、补体结合试验当抗体与细菌、红细胞等颗粒抗原结合并形成抗原抗体复合物后，可结合补体引起溶菌、溶血效应。用补体结合试验既可以测知患者血清中补体的总量，也可以检测未知抗原或抗体的量。用于测定未知抗原/抗体时，采用两套系统，一套是待测的抗原抗体系统，称为检测系统，一套是包括绵羊红血球和抗绵羊红血球抗体的指示系统。待测系统中有无待测的抗原/抗体是利用指示系统中是否出现溶血来判断。反应的过程是首先加待测抗原/抗体，反应一段时间后加入补体，在反应一段时间后加指示系统。有待测抗原抗体结合时，必然结合补体，不会出现溶血，没有待测物质时出现溶血。指示系统:绵羊红细胞+溶血素+补体待检系统:已知Ag+未知Ab或已知Ab+未知Ag。四、中和试验是免疫学和病毒学中常用的一种抗原抗体反应试验方法，用以测定抗体中和病毒感染性或细菌毒素的生物学效应。凡能与病毒结合，使其失去感染力的抗体又称中和抗体。能与细菌外毒素结合，中和其毒性作用的抗体称为抗毒素。中和试验可以在敏感动物体内（包括鸡胚），体外组织（细胞）培养或试管内进行。观察特异性抗体能否保护易感的试验动物死亡；能否抑制病毒的细胞病变效应或中和毒素对细胞的毒作用；以及测定抗体的其他生物学效应。根据稀释成分不同可分为两种方法。一为固定病毒用量与等量一系列倍比稀释的血清进行中和试验，以血清中和抗体滴度表示。二为固定血清用量与等量一系列对数稀释的病毒进行中和试验。结果以中和指数表示。固定血清稀释病毒法：已知效价的抗血清（通常为阴性对照）测定未知效价的抗血清结果以中和指数表示试验组LD50　(EID50、TCID50)中和指数=──────────────────对照组LD50　(EID50、TCID50)固定病毒稀释血清法：已知效价（滴度）的病毒测定抗血清的效价结果以血清中中和抗体滴度表示***硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。*特异性。可逆性。以非共价键结合可见性。Ab＋Ag------当比例合适----形成肉眼可见聚合物。Ag决定簇--*机体感染伤寒、副伤寒杆菌后会产生相应抗体，正常人因隐性感染或预防接种，血清中可含有一定量的抗体。一般当H≥1：160，O≥1：80，副伤寒凝集价≥1：80时，才有诊断意义。病程中应每周复查一次，如病人H与O的凝集价均高于参考值或较原凝集价升高4倍以上，则患伤寒的可能性很大。若H凝集价高而O低于正常值，则可能是以往预防接种疫苗的结果或非特异性回忆反应所致。****人绒毛膜促性腺激素*特异性。可逆性。以非共价键结合可见性。Ab＋Ag------当比例合适----形成肉眼可见聚合物。Ag决定簇--*