基于CRISPRCas9系统的人胚肾上皮细胞UHRFl基因定向编辑

第二军医大学硕士学位 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 基于CRISPR／Cas9系统的人胚肾上皮细胞UHRFl基因定向编辑UHRFl第二军医大学基础医学实验教学中心HumanEmbryonicSystemGeneTargetedEditinginKidneyEpithelialCellsasedCRISPR／Cas9B硕士研究生：丁超导师：曹洁副教授导师组成员：于文强教授学科：生物学专业：微生物学论文提交日期：2014年6月on髫漉6月岁日学位论文作者签名：丁独创性声明学位论文版权使用授权声明日期：01．01I|[．．m占月Z日日期：矗ol《f-m日期：多F／牛年二月乡日学位论文作者签名：＼】本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本人承担本声明的法律责任。本人完全了解第二军医大学有关保留、使用学位论文的规定，第二军医大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权第二军医大学可以将学位论文全文或部分 内容 财务内部控制制度的内容财务内部控制制度的内容人员招聘与配置的内容项目成本控制的内容消防安全演练内容 编入《中国学位论文全文数据库》、《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》等数据库进行检索。可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)导师签名：_一C。，录目缩略词表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯j⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．5第二部分：连续共转染法建立UHRFl基因敲除HEK293T细胞株⋯⋯⋯芝5中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3第一部分：UHRFl基因靶位点设计及gRNA载体构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．11一、材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．12二、实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．20一、材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．26二、实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．33第三部分：UHRFl基因敲除对HEK293T细胞生物学功能的影响⋯⋯⋯38参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．5个人情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．6致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯62三、讨论⋯_⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯24三、讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．36一、材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．38二、实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．43三、讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．49综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯54日U暑i⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．71—、L—j一摘要研究目的：应用基因组编辑技术CRISPR／Cas9系统，在人胚肾上皮细胞系研究方诖：①设计靶向UHRFl基因外显子区域的gRNA序列，克隆至gRNA载实验结果：成功筛选获得UHRFl基因特异性靶位点并构建gRNA载体，与hCas9repeats)系统是细菌对噬菌体的长期抗争过程中进化产生的一种获得性免疫防御系统，普遍存在于细菌与古生菌中。CRISPR系统由重复序列(CRISPRarray)和重复序列上游的Cas蛋白家族操纵子构成。外来序列经识别并插入到重复序列之间作为间隔序列(protospacers)，这样CRISPR系统就具有了识别外侵DNA的能力。根据参与组分不同，CRISPR系统可以分为三种类型，分别为I型、II型和III型。其中II型CRISPR系统参与组分最为简单，最新的基因组编辑技术CRISP刚Cas9系统即基于II型开发而来。与锌指核酸酶(Zinc．fingernuclease，ZVN)技术和转录激活因子样效应子核酸酶(Transcriptionnucleases，TALEN)技术这两种相对成熟的基因编辑技术相比，CRISPR／Cas9系统在操作上更灵活便捷，大大缩减了构建动物或细胞模型所需的时间和资金。人类UHRF1(ubiquitin．1ike1)蛋白是由UHRFl基因表达的一类多功能结构域蛋白，参与多种生物学过程，包括基因调控、甲基化遗传、细胞周期进程以及肿瘤发生等，但目前对其作用的精确机制并不完全清楚，因此建立UHRFl基因敲除人类细胞模型对更细致地研究UHRFl蛋白的功能有非常重要的意义。(HEK293T)中尝试建立UHRFl基因特异敲除的人单克隆细胞株，并初步分析UHRFl基因敲除对HEK293T细胞生命进程的影响。体。将克隆获得的gRNA载体与hCas9载体共转染人胚肾上皮细胞(HEK293T)，经嘌呤霉素(puromycin)及有限稀释法对细胞进行筛选后，建立多个单克隆细胞株；②通过测序以及Westemblot方法进行目的蛋白表达验证，获得UHRFl基因敲除的单克隆细胞株；⑨用LUMA实验验证UHRFl蛋白敲除引起的HEK293T细胞基因组整体甲基化水平变化；④用流式细胞技术 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 UHRF1蛋白低表达对HEK293T细胞周期以及细胞凋亡的影响。载体共转染HEK293T细胞后建立34个单克隆细胞株；经Westemblot鉴定，获得三株UHRFl蛋白低表达HEK293T细胞株，靶位点测序证实均为UHRFl杂合子(UHRFl+／")细胞株；选取一株UHRF1蛋白表达量最低HEK293T细胞株经LUMA实验证实，该细胞基因组DNA呈低甲基化状态，且UHRFl蛋白恢复表达可恢复该基于CRISPR／Cas9系统的人胚肾上皮细胞UHRFi基因定向编辑CRISPR(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicactivator-likeeffectorwithPHDandRINGfingerdomains结论：本研究应用CRISPR／Cas9系统，首次在HEK293T细胞中对UHRFl基因关键词：CRISPR／Cas9系统，基因敲除，UHRFl基因，HEK293T细胞，DNA甲基化基因组的甲基化水平；流式细胞技术检测结果显示，UHRFl蛋白低表达可延长HEK293T细胞G1期并使细胞凋亡率显著增加。进行特异性敲除，建立UHRFl蛋白低表达人单克隆细胞株，且该细胞株基因组整体甲基化水平降低。进一步实验表明，UHRFl基因敲除引起HEK293T细胞周期变化及高凋亡率，实验结果不仅为深入研究UHRFl参与细胞表观调控的作用机制提供有效的人类细胞模型，而且对基于UHRFl基因／蛋白的肿瘤诊断与新药研发也具有潜在的参考应用价值。第二军医大学硕士学位论文．2．Abstractknockoutsequences(CRISPRarray)andfamily(Cas)recognizedtechnology,ZFN(Zinc—fingernuclease)andTALEN(transcriptionnucleases)，CRISPR／Cas9UHRFlknockoutMETHODS：(￡)Designstrains；Qldentificationsequencing；③Verificationassay；QDetectionstrains．Western基于CRISPR／Cas9系统的人胚肾上皮细胞UHRF!基因定向编辑CRISPR(clusteredrepeats)system1(ubiquitin·like1)UHRFlLUMAconstructregularlyinterspacedshortpalindromicisadaptiveimmunitymechinaryubiquitouslyinbacteriaandarchaea，aimingdefendgenomeintegritybyrecognizingsilencingbacteriophageDNA．CRISPRsystemconsistsofrepeatupstreamCRISPRassociatedproteinoperon．Exogenoussequencesinsertedintothebetweentermedproto—spacers，thusacquireabilitydistinguishendogenousexogenoussequences．CRISPRclassifiedthreecategoriesbasistheirdifferentcomponents：typeI，typeIItypeIII．Asnewesteditingtechnology,CRISPR／Cas9developedbasedbecauseitsminimumcomponents．Comparedwithrelativelymatureactivator-likeeffectoreasierengineer,morescalableaffordable．HumanUHRFPHDRINGfingerdomainsmultifunctionalexpressedgene．Itparticipatesmanybiologicalprocessesincludinggeneregulation，methylationinheritance，cellcycleprogressiondevelopment，butdetailedmechanismsentirelyclear．Constructionhumancellmodelwillhelpformorein-depthstudy1function．OBJECTIVE：EstablishHEK293TstrainsthroughCRISPR／Cas9lowoff-targettendencypreliminarilyanalysiseffectsHEK293T．gRNAtargetingcloningvector．Co-transfectionconstructedhCas9cells．ScreeningcellspuromycinresistanceestablishmentmonoclonalwestemblottargetedsitesDNAglobalmethylationinducedinfluenceapoptosisflowcytometrycells．RESULTS：Obtainedspecifictargetsuccessfully．Co—transfecteditestablished34identifiedsignificantlydeclinedexpressionlevel．Sequencingresultsshowedthatboththemtoarraynotvector．3．anareonaevencancerexonknockoutWORDS：CRISPR／Cas9knockout，UHRFlUHRFlLUMACONCLUSIONS：UHRFlheterozygousgenelocus．ChosenHEK293TcellstrainwiththelowestUHRF1expressionandconfirmeditsgenome—widehypomethylationbyassay．Overexpressinstaincouldgenomemethylationlevelofstrain．FlowcytometryshowedthatdeclinedproteincellsexhibitedprolongedG1一phasehighapoptosispopulation．specificmonoclonalstrainswerefirstestablishedCRISPR／Cas9systemwhichdisplaysgenome‘widehypomethylation．Ourresultsprovideeffectivemodelforfurtherstudyingepigeneticregulationpotentialvaluetumordiagnosisdrugdiscovery．KEYsystem，genegene，HEK293Tcell，DNAat．4arescueanon异丙基⋯13缩略词表英文缩写英文全称中文名称UHI疆ljoiningProto·-spacer·-adjacent氨苄青霉素碱基对双链断裂非同源末端连接同源重组锌指核酸酶转录激活因子样效应子核酸酶无CRISPR相关蛋白人源化Cas9蛋白向导RNACRISPR干扰技术乙二胺四乙酸酶联免疫吸附实验D硫代半乳糖苷LB培养基分钟秒纳米光密度基于CRISPR／Cas9系统的人胚肾上皮细胞UHRFI基因定向编辑PAMLUMAMethylationMinuteAmpbpDSBNHEJHRZFNTALENCRISPRCashCas9CrRNAgRNACRISPRiEDTAPCRIPTGAmpicillinbasepairDoublestrandbreakNonhomologousendHomology-directedrepairZinc—fingernucleaseTranscriptionactivator-likeeffectornucleasesUbiquitin—likewithPHDandRINGfingerdomains1ClusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeatsassociatedproteinHumanizedCas9RNAsmotifGuideRNAinterferenceLUminometricAssayEthylenediaminotetraaceticacidPolymerasechainreactionIsopropyl--beta-·D·-thiogalactopyranosiI．uria-BertanimediumminnmODSecondNanometerOpticaldensityLB．5．SeC磷酸盐缓冲液绿色荧光蛋白每分钟转速十二烷基磺酸钠N-tris(hydroxymethyl)aminomethaneN．三(羟甲基)氨基甲烷脱氧三磷酸核苷酸第二军医大学硕士学位论文PBSEGFPr．p．mSDSTrisdNTPsPhosphate-bufferedsalineEnhancedGreenFluorescenceRotationperminuteSodiumdodecylsulphateDeoxynucleotidetriphosphates．6．前言一、CRJSPR／Cas9系统概况莉昌系列蛋白)被划分为三种主要类型，分别以I型、II型和Ⅲ型表示【101，CRISPR／Cas9基因组编辑(genomeediting)是一类通过精确改变特定模式生物基因来研究基因功能的技术。这种技术通常是将核酸酶导向到特定DNA序列进行剪切造成双链断裂(Double．strandbreak，DSB)，激活细胞内的非同源末端连接修复机制joining，NHEJ)或同源重组修复机制(Homology．directedHR)，造成移码突变或同源重组，利用细胞自身的修复机制对DNA进行遗传学改变J。锌指核酸酶(Zinc．fingernuclease，ZFN)技术和转录激活因子样效应子核酸酶nucleases，TALEN)技术是其中最具代表性的两种技术：通过克隆技术将核酸酶与DNA序列特异性结合元件(锌指结构或转录激活样效应子)嵌合形成融合蛋白，这样非特异性的核酸内切酶被改造成序列特异性的核酸内切酶，在细胞内表达后，能精确地对细胞基因组中的目标DNA序列进行DSB剪切[2J。ZFN和TALEN技术发展较为成熟，并己被商业化应用。然而，由于需要构建融合蛋白，克隆难度相对较大，构建组装时间较长，因此这两种方法在 实验室 17025实验室iso17025实验室认可实验室检查项目微生物实验室标识重点实验室计划 一般很难得到有效利用，尤其是ZFN技术已经被Sigma公司商业化垄断多年。2012年出现的一种新的基因组编辑技术—CRjSP刚Cas9系统则克服了上述两种技术的缺点，可直接通过RNA与DNA的碱基互补配对引导核酸酶(Cas9)的特异剪切，与前两种方法相比，CRISPR／Cas9系统在应用上具有更省时快捷的特点[3’4'5】。repeats)系统于1987年首先在大肠杆菌中被发现，而后的研究证实这是一种广泛存在于古生菌和细菌体内的获得性免疫系统。CRISPR系统被认为是细菌与噬菌体长期抗争过程中不断进化的产物，能为细菌提供获得性免疫保护，通过RNA介导的DNA剪切机制使细菌免受外源DNA的侵扰【6'71。CRISPR系统由CRISPR位点及其上游的Cas蛋白家族操纵子组成。CRISPR位点(CRISPRarray)主要由保守的短重复序列组成，长度通常21-48bp，重复序列之间被间隔序列(spacer)隔开(图1)【81。在CRISPR位点上游附近，存在编码一系列CRISPR相关蛋白(CRISPR．associated，Cas)的操纵子，编码的Cas系列蛋白具有核酸酶特有的结构域【9]。CRISPR防御系统的作用机制可分为三个阶段，分别为整合、表达和效应阶段。目前根据其参与组分不同(主要是Cas技术是基于Ⅱ型CRISPR系统开发而来。基于CRISPR／Cas9系统的人胚肾上皮细胞UHRFI基因定向编辑(Nonhomologous(TranscriptionCRISPR(clusteredendrepair，activator-likeeffectorregularlyinterspacedshortpalindromicIoci／CRISPR【l．7．一一I一一：一-j●Zhang等首次利用这一原理应用到真核细胞中，正式将其开发为基因巨大的潜力，已经成功在大肠杆菌、果蝇、斑马鱼、拟南芥，K562细胞等模式动物利用CRISPR／Cas9技术在人类小肠成熟干细胞团和小鼠受精卵中，通过遗传重组成II型CRISPR系统最早是在酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)中发现的。病毒侵入酿脓链球菌后，病毒基因组中的短序列(proto．spacer)被选择性整合到宿主基因组的CRISPR重复序列之间(spacer)即CRISPR的整合阶段⋯】。在表达阶段由CRISPR位点上游的前导序列启动CRISPRarray转录成crRNA前体(pre．crRNAs)。Pre—crRNAs包含多个间隔和重复序列。Pre．crRNAs的加工首先由一种反式激活RNAcrRNAs，tracrRNAs)识别，以碱基互补方式结合到pre．crRNA的重复序列上，然后在Cas9的参与下由双链特异性的核酸酶(RNaseIII)剪切加工成成熟的crRNAs[圮J。成熟的crRNAs由识别位点(spacer)以及单侧的重复序列组成，重复序列与tracrRNA以互补形式结合并与Cas9蛋白组成复合体。在效应阶段crRNAs的proto．spacer序列通过碱基互补，靶向到噬菌体基因组相应序列并由Cas9发挥酶切作用而断裂目标区域双核苷酸链【4J。2012年，Jinek等发现将crRNA与tracrRNA嵌合形成的gRNA(guideRNA)在体外同样能引导Cas9发挥这种特异性剪切作用[3】，2013年，Feng组编辑新技术【41。与Ⅱ型CRISPR系统不同，I型与III型CRISPR系统pre．crRNA表达后，由特异的Cas内切酶加工pre．crRNA，成熟的crRNA被募集到由多个Cas蛋白形成的复合体中，进而通过碱基互补靶向到特异基因序列，组分复杂不利于体外利用。需要强调的是，CRISPR系统中Cas9蛋白剪切目标DNA序列的下游必须存在一个PAM(proto．spacer-adjacentmotif)序列，不同类型的细菌中PAM序列不同，如酿脓链球菌的PAM为NGG序列，N为任意核苷酸。研究结果表明，CRISPR／Cas9系统因其在操作上灵活便捷在基因组编辑中展现了或细胞中得到应用。此外，在CRJSP刚Cas9基础上，也衍生出了其他几种技术，如CRISPRi[13J和CRISPRnickase[14J，进一步拓宽了CRISPR／Cas9系统的应用范围。在遗传病治疗方面，CRISPR／Cas9技术也初步显露出其大好前景，目前已经有两篇报道功修复遗传缺陷基因【15,16】。第二军医大学硕士学位论文Cas基因前导序列重复序列间隔序列(trans．activatinglIl。，，一图1细菌CRISPR位点结构示意图．8．二、I腮Fl研究概况(一)U旅¨蛋白的发现(二)UⅧⅫ1蛋白参与DNA甲基化的遗传CRISPR／Cas9系统的应用还在起步阶段，应用过程中同样存在不少缺陷。高脱靶效应是该系统的固有缺陷，是制约其完全普及应用的最大障碍。人类细胞基因组的复杂性更增加了其脱靶概率，到目前为止还不能应用CRISPR／Cas9系统对人类细胞中任意基因进行敲除，因此寻求降低其脱靶效应的有效方法是目前该领域的研究热点之一。此外，应用CRISPR／Cas9系统另一不足之处是其低阳性率，尽管该系统相对TALEN和ZFN技术获得阳性细胞的概率更高，但通常仍需要筛选几十个单克隆细胞才能获得阳性细胞株，故如何提高CRISPR／Cas9系统阳性率也是目前亟待解决的一个问题。1)是一种CCAAT序列结合蛋白，主要存在于细胞核内，具有独特的SRA结构域(SET与RING)，参与生物体内一系列重要的生物学过程，对DNA甲基化的维持以及组蛋白修饰具有重要作用，与肿瘤发生发展也密切相关。早在1998年在小鼠组织细胞的细胞核中发现了UHRFl蛋白，并证明其与细胞增殖有关，因其分子量为95kd，最初被命名为NP95t⋯71。随后在人体内发现了与拓扑异构酶IIa表达有关的NP95的同源物，体外实验发现其有CCAAT序列结合活性，因此命名为ICBP90(invertedkDa)【18】。因为NP95和ICBP90是最早发现的UHRF基因家族的表达产物，所以称之为UHRFl蛋白，主要分布于细胞核内。UHRF家族的蛋白均有一个独特的SRA结构域(SET与RING)。在早期，对UHRFl蛋白的功能研究主要集中在细胞增殖、蛋白定位以及基因表达调控这几个方面。Fujimori等通过免疫组化实验发现小鼠胸腺细胞中NP95特异性表达于细胞S期，而在淋巴细胞的整个细胞周期中均处于高表达状态；同时发现NP95的表达具有明显的组织特异性【17】，这些实验结果表明，UHRFl参与了细胞周期进程并极有可能参与到DNA复制过程中。DNA甲基化在真核生物中具有极其重要的生物学意义，主要表现在调控基因的表达，维护染色体完整性等方面。分化的细胞含有特定的表观遗传修饰，细胞增殖过程中，这些表观修饰模式将完整地传递到子代细胞。而UHRFl蛋白被证实与DNA甲基化的传递有关【l91，能忠实地将母本甲基化信息传递到子代细胞。UHRFl蛋白的SRA结构域在这个过程中发挥重要作用。DNA复制产生的双链，一条链来自母本基因组，具有全部甲基化信息，另一条为新合成链，是未甲基化链，这样的双链称为半基于CRISPR／Cas9系统的人胚肾上皮细胞UHRF!基因定向编辑UHRFI(ubiquitin．1ikewithPHDandRINGfingerdomainsCCAATboxbindingproteinof90．9．(三)ulIlⅫ1蛋白与肿瘤甲基化双链。UHRFl的SRA结构域具有半甲基化CpG结合活性，能将甲基化转移酶DNMTl召集到DNA复制叉周围，对未甲基化链进行甲基化修饰，从而完成DNA甲基化的保留复带1]i20,211。UHRFl蛋白参与许多生理和病理现象，从胚胎发生到细胞迁移甚至肿瘤的发生发展都与其密切相关。UHRFl蛋白的表达存在组织特异性：在高度分化组织中不表达，在增生性组织中，UHRFl蛋白通常高表达【l引。对非肿瘤细胞，UHRFl蛋白的表达水平与细胞周期有关，在G1晚期与G2／M期出现峰值；而在多种肿瘤细胞中，UHRFl蛋白的表达水平都处于明显高值，高水平的UHRFl蛋白对癌症患者来说预示着极低的生存率【221。UHRFl蛋白被证明是保持肿瘤细胞增殖未分化状态的关键因子并参与了肿瘤抑制基因的沉默【23，24'251，因此其表达基因被认为是一种原癌基因。此外，有实验证实UHRFl蛋白的高水平表达也与肿瘤预后差以及与放射性治疗的敏感性减弱相关【26，2。”。综上所述，UHRFl蛋白参与多种生物学过程，包括生物体发育、基因调控、DNA甲基化的保留复制以及肿瘤发生等，是生物体内一种非常重要的功能蛋白。本论文研究的主要内容是首次尝试建立人HEK293T细胞UHRFI基因敲除细胞株，并进一步研究UHRFl蛋白对基因组甲基化、细胞凋亡以及细胞周期进程的影响，实验结果不仅有助于对生物体不同生命过程的深入理解，而且对肿瘤的诊断及其新药研发也具有潜在的实际应用价值。第二军医大学硕士学位论文．10．第一部分UHRFl基因靶位点设计及gRNA载体构建细菌II型CRISPR／Cas9系统整合外源序列后，表达的crRNA前体(pre．crRNA)需要一种非编码RNA(transRNA，tracrRNA)以及Cas9蛋白的辅助，由III剪切而完成加工成熟过程。成熟的crRNA由插入的靶向序列及单侧的重复序列组成，crRNA的重复序列与tracrRNA碱基互补结合并与Cas9蛋白形成复合体，引导Cas9蛋白发挥剪切功能。将crRNA与tracrRNA嵌合形成的具有颈环结构的gRNA(guideRNA)能直接发挥这种引导功能，这样体外合成的gRNA不用依赖RNaseIII的剪切加工，可直接与人源化的hCas9共同导入真核细胞后就能发挥特异性的剪切作用。本研究中所用CRISPR／Cas9系统由两套载体系统组成：gRNA和hCas9。利用CRISPR／Cas9系统敲除特异基因的最关键步骤是确定靶向位点以及构建gRNA载体，这是本研究第一部分的内容。细菌的CRISPR系统识别位点下游必须存在PAM(Protospacer-adjacentmotif)序列，不同细菌的．T、^Aitv4-"序列不同，如酿脓链球菌(S．pyogenes)为NGG序列，嗜热链球菌(S．thermophilus)为NGGNGl2引，其中N为任意碱基。本实验所用质粒载体系统由酿脓链球菌的CRISPR系统改造，靶向序列需要20个碱基，靶向位点下游PAM序列为NGG。靶位点的设计基于以下基本原则：(1)以G开始，这是由gRNA．puro载体上的U6启动子决定的；(2)尽量避开GC富集区域，以防止甲基化对互补配对可能的干扰；(3)选择特异性位点，降低脱靶概率；(4)靶位点设计在外显子上，在基因上游越靠前越好。许多人类蛋白表达基因并不存在完全符合上述设计要求的特异性靶位点，即便某一基因存在特异性靶位点，也不能保证以该靶位点设计的gRNA能起高效引导作用。人UHRFl基因位于第16号染色体上，全长98250bp，其中包含有17个外显子，含有上千个PAM序本研究首先从(http：／／genome．UCSC．edu／cgi．bin／hgGateway)中获得UHRFl基因外显子序列，并根据以上原则设计靶位点，首先从1-5个外显子中尝试寻找特异性靶位点。由于gRNA序列比较短(103bp)，我们直接设计长引物以gRNA．puro载体为模板经PCR扩增获得目的序列后，再克隆至gRNA．puro载体。基于CRISPR／Cas9系统的人胚肾上皮细胞UHRFI基因定向编辑列activatingRNaseUCSC。一、材料与方法(一)实验材料1、试剂2、仪器Mix(上海莱枫生物科技有限公司)；限制性内切酶(NEB公司)；DNA连接酶(Takara公司)：感受态DH5a(天根生化科技有限公司)；质粒抽提试剂盒(天根生化科技有限公司)；DNA纯化试剂盒(天根生化科技有限公司)；胶回收试剂盒(天根生化科技有限公司)；氨苄青霉素Amp(天根生化科技有限公司)；ladder(天根生化科技有限公司)；氯化钠(上海化学试剂有限公司试剂四厂)；乙醇(上海振兴化工一厂)；TRIS(上海蓝季科技有限公司)；乙二胺四乙酸(中国医药集团上海化学试剂公司)；冰乙酸(中国医药集团上海化学试剂公司)；琼脂粉(中国医药集团上海化学试剂公司)；琼脂糖(上海爱紫特科技有限公司)；酵母抽提物(OXOID)；胰蛋白胨(OXOID)；丙烯酰胺(BBI)；过硫酸铵(Amresco)；溴化乙锭(Amresco)；甘油(Amresco)；十二烷基硫酸钠(Ammsco)；台式天平(上海天平仪器厂，JA61001)；第二军医大学硕士学位论文MasterMouse2xTaqPCRT4DNAanti—ICBP90(BDBioscience)；ActinmAb(Abmart)。．12．电泳仪以及附件(BIO一＆∞)；3、实验溶液配置(2)lOmg／mL溴化乙锭(3)LB液体培养基37℃恒温培养箱(天呈公司)；37℃恒温水浴锅(上海浦东物理光学仪器)；16℃恒温水浴锅(宁波海曙赛福实验仪器)；移液枪(Gilson)；PCR仪(ABI&东胜)；水平摇床(上海浦东物理光学仪器)；电子天平(METTLERTOLEDO—JA5002)；一20℃冰箱(海尔公司)；．80℃冰箱(Thermo二级生物安全柜(海尔公司)；细菌超净工作台(金净)；涡旋混合器vortex(其林贝尔公司)；恒温振荡器DDHZ．300(江苏太仓仪器)；台式离心机(Thermo4"C冷库(上海冰泉制冷公司)；高压灭菌锅(上海医用核子仪器厂，VXQ．SG41．28V)；超纯水系统(Millipore公司)；微波炉(格力公司)；凝胶成像系统(Tanon，3500R)。(1)50xTAE称取242．28Tris碱，37．20Na2EDTA·2H20，加入600mL的ddH20溶解，然后加入57．1mL醋酸，ddH20定容至1．0L，室温保存。称取0．20g溴化乙锭溶解于20ddH20中，4℃避光保存。称取蛋白胨10．oog，酵母提取物5．oog溶解于1．0基于CRISPR／Cas?系统的人胚肾上皮细胞UHRFI基因定向编辑scientific)；NANODROP(ThermomLgg，NaCI10．00LddH20．13．4、菌株与质粒Puromycin卜(4)LB固体培养基以l：1000比例加入氨苄青霉素(100mg／mL)，混合均匀后铺至平板中并标记，(5)80％甘油(6)lOOmg／mL氨苄青毒素(1)菌株(2)质粒Il中，121℃高温高压灭菌20分钟，4℃保存。称取蛋白胨lO．00g，酵母提取物5．00g，15．00～20．009琼脂粉，溶解于1．0ddH20中，121℃高温高压灭菌20分钟，冷却至60。C左右后0C冷库保存。取80．0mL甘油，加入无菌双蒸水至100．0mL，混合均匀，121℃高温高压灭菌，室温保存。称取氨苄青霉素1．oog溶解于10．0mL的ddH20中，于超净台中经0．22I．tm滤头过滤后分装，．20。C保存。大肠埃希菌(Escherichiacoli)DH5a由复旦大学生物医学研究院EpiRNA实验室保存。本研究所用载体gRNA．puro和hCas9由复旦大学生物医学研究院党永军教授惠赠。人源化的hCas9载体由pcDNA3．3TA载体改造而来，转染入真核细胞后能表达人源化的hCas9蛋白。gRNA—puro载体由pCR·BluntII-TOPO载体改造而来，gRNA．puro载体图谱见图1．1和图1．2。第二军医大学硕士学位论文g，NaCI10．00L4TOPO图1．1gRNA-puro表达载体gRNA·puro载体由U6启动子启动，含有XbaI与EcoRI酶切位点用于gRNA克隆，下游puromycin基因表达嘌呤霉素用于细胞抗药性筛选。．14．XbaTargetgRNAscaffoldEcoRI．．．．．．．．．J一I------------_-●L__________-·_·-·__-·___一⋯一．一察，一一～。§。藿瑚141qmcegc丝照豳gga耐gaggCggaagatccgtttta(二)实验方法1、UHRFl基因中靶位点设计2、引物设计扩=譬：皇=66”矿电增6。66～6⋯。扩⋯”嬲(3)引物合成(见表1．1)(3)根据靶位点设计原则进行筛选，找出最适合的靶点。若最终无合适靶位根据筛选确定的靶位点序列，构建gRNA序列，设计gIⅢA引物(图1．3)。表1．1体外合成gRNA引物名称及其序列(1)通过UCSC(http：／／genome．UCSC．edu／cgi-bin／hgGateway)下载人类UHRFl基因组序列和外显子序列；(2)从首个至第五个外显子中寻找所有可能的靶位点，将所有下游含NGG序列的潜在靶位点列出；点，则顺次往下游外显子寻找。基于CRISPR／Cas9系统的人胚肾上皮细胞UHRFI基因定向编辑序列(5’一3含靶位点上游引物注：下划线部分分别为XbaI和EcoRI酶切位点，灰色背景部分为靶序列。图1．2gRNA空间结构模拟图gRNA．puro由U6启动gRNA的转录，转录后支架部分形成发卡结构。名称描述7)企蜘陆．bI．游芦I怖gagctagaaatagcaagttaaa下游引物cggaaacaaaaaaagcaccgactcggGuideRNAmatchestargethuHRFl～arget．FhUHRF—l—t．15．arget—Rg枞卿哆叵丑互丑3’一5’回Targ吼．3、载体构建(1)含靶位点DNA片段的合成(2)PCR产物的纯化、酶切及胶回收以gRNA—puro质粒为模板，以hUHRFl一target-F和hUHRFl一target—R为上下游引物，经PCR扩增设计的gRNA片段，序列全长为119bp。PCR反应体系与条件见表1．2和表1．3，PCR产物经1．5％琼脂糖凝胶电泳对目的片段进行检测。表1．2PCR反应体系模板(载体gRNA)hUHRFl-target—F(109M)hUHRFl一target—R(109M)至50．0pl总计表1．3PCR反应条件1、取上述PCR产物用DNA产物纯化试剂盒(天根生物科技有限公司)纯化，纯化步骤见 说明书 房屋状态说明书下载罗氏说明书下载焊机说明书下载罗氏说明书下载GGD说明书下载 ，309lddH20溶解产物。第二军医大学硕士学位论文MixgRNA引物合成模式图hUHRFl-target·F对应实线为上游引物，含有靶向序列(粗线)，hUHRFI—target·R对应实线为下游引物。10．0ng2．0pl2．09l2xPCR25．O“lddH2050．09l1Cycle35Cycles94℃58℃72℃2miIl10sec30sec5minhUHRgl—target·R图1．3．16．(3)连接与转化2、纯化产物用XbaI和EcoRI进行双酶切，gRNA-puro载体亦同时用XbaI和EcoRI进行双酶切，37*(2恒温培养箱中酶切过夜，反应体系见表1．4与表1．5。表1．4PCR产物双酶切体系总计表1．5载体双酶切体系hCas9载体(4p．g)3、酶切产物用胶回收试剂盒(天根生物科技有限公司)回收目的片段和载体，胶回收步骤见试剂盒说明书。胶回收后Nanodrop检测浓度。1、胶回收产物用T4DNA连接酶进行连接，16。C连接2小时以上，反应体系见表1．6。表1．6连接反应体系回收的目的片段(50ng／I，t1)回收的载体(150ng／}t1)T4连接酶基于CRISPR／Cas9系统的人胚肾上皮细胞UHRF!基因定向编辑PCRproduct30．0斗lCutsmart5．01alEcoRI2．5tLtlXbaI2．59lddH2010．01al50．01alXbal2．5肛lECO·RI2．5pl5．0pl25．01al15．09l10xT4DNAligasebuffer1．09l3．09l1．01xlO．59l4．591．17．GAATTGG邢ACA]睛ACAA，下游引物为hUHRFl．target．R，反应体系与条①将DH5a菌株以平板划线方法涂布于无抗生素的LB平板上；(4)克隆鉴定与测序2、CaCl2制备感受态细胞DH5a：②于玻璃试管中加入3～5mLLB培养基，从DH5a平板上挑取一个单克隆接种至LB培养基，37℃，250r．p．m摇床培养16小时；③取2mL菌液接入200mL新鲜的LB培养基中，37"C，250r．p．m摇床培养至OD600约为O．4．0．5，然后将菌液置于冰上冰浴40分钟；④提前预冷离心机，将预冷后的菌液4。C，5000r．p．m离心5分钟，弃上清；⑤用40mL0．1M预冷的CaCl2轻轻吹打，充分悬浮后冰浴10分钟；⑥4℃，5000r．p．m离心5分钟，弃上清；⑦用8mL0．1M预冷的CaCl2轻轻吹打，充分悬浮后冰浴30分钟；⑧以1009l每管分装至1．5mL离心管中，感受态可直接使用或．80。C冻存。3、将连接产物转化入DH5a细菌中，转化步骤如下：①取一支感受态细胞于冰上，溶解后加入51xl连接产物，冰浴20～30分钟；②42℃水浴热激活90秒，立即置于冰上5分钟；③于超净台中加入灭菌的LB培养基5001xl，37℃、150r．p．m摇床中培养40分钟左右；@5000r．p．m离心3分钟；⑤弃部分上清，保留约100p．1，混匀后涂布于含氨苄青霉素的LB平板上；⑥倒置放于37*C恒温培养箱中培养16～18小时。l、单克隆接种与鉴定：①挑取合适大小的菌落接到含氨苄青霉素的LB培养基中；②37℃，260r．p．m恒温摇床培养6小时；③取l“l菌液为模板做PCR鉴定，上游引物为：件见表1．7与1．8；④根据PCR结果，将有目的片段插入的样品继续摇菌，37。C、260r．p．m恒温摇床培养过夜。第二军医大学硕士学位论文．18．表1．7菌液PCR反应体系菌液上游引物(101lM)总计表1．8菌液PCR反应条件2、对菌液PCR鉴定为阳性细菌用质粒小抽试剂盒进行质粒抽提(天根生物科技有限公司)：①取2mL培养过夜的菌液，于离心机中13000r．p．m离心2分钟收集沉淀，弃上清；②加入250914。C保存的溶液P1(含RNaseA)，涡旋振荡确保菌体充分混匀；③加入2509l溶液P2，温和颠倒6次(不超过5分钟)；④加入350I_tl溶液P3，温和颠倒混匀6次，以13000r．p．m室温离心10分钟；⑤取上清分次过吸附柱，以13000r．p．m离心1分钟，弃滤液；⑥于吸附柱内加600I．tlr．p．m离心1分钟，弃滤液：⑦重复上述操作一次；⑧弃去滤液，13000r．p．m再次离心2分钟；⑨小心加609165。C预热的ddH20于吸附柱的膜中央，室温静置2～3分钟；⑩13000r．p．m离心1分钟收集洗脱质粒，Nanodrop检测浓度。3、所提质粒取部分直接送到上海杰李生物技术有限公司测序，测序引物序列为hUHRFl．target-R，测序结果用DNAStar软件分析。基于CRISPR／Cas9系统的人胚肾上皮细胞UHRFI基因定向编辑01jM)MasterMixW．ash1．Opl1．09lhUHRF1-target-R(11．0¨l2xTaqPCR10．09lddH207．0I．tl20．01al1Cycle35Cycles94℃58℃72℃min10sec30sec5Buffer，13000．19．ccgccagagcctcgtgctcccccacagcaccaaggagc职actccgagctctccgacaccga=g舀ggaggagctgagg嘤aagatccaggagctgttccac醴踣二、实验结果(一)UHRFl基因靶位点确定与引物合成1、靶向位点确定①从UCSC(http：／／genome．UCSC．edu／cgi—bin／hgGateway)中下载人类UHRF基因前五个外显子(Exon)序列(表1．9)。表1．9UHRFl前五个外显子序列cgccgacaccat星^ggatccaggttcggaeCat鹊acg鹊aggCagacccacacggtggact②找出所有下游含NGG位点的以G开始的潜在靶位点序列，见表1．10。第二军医大学硕士学位论文cgct垂ccaggctgaccaccgagactgacagcaggccagccgatgaggacat融盈落atgagacggaattggggctgtacgtcaatgagtacgtcgatgctcgggacacgaacatgggggc醇蹈；tttgaggcgcaggtggtcacgggaactctacgccaac舀ggtgctggg注：下划线部分为连续的GG序列。1atcagagcagctggcagcgcggcgggcagcgtttgccgagcgggcgctccgggtcg．c．acgcExonaagtccgcgcggggtccgggccacgcacgcggtttcatcgccatccccagccgggccacgcgcgcaggcagacaagctgttcgcggcgaccggagag2agccaggcctgcagaggctgttctacaggggcaaacagatggaggacggccataccctcttcgactacgaggtccgcctgaatgacaccatccagctcctggtactccggctgctgcctgggccagagtgagtcagacaagtectccacccacggtgaggcggccg3aaggggtgacgcggaaggccccctcccgggacgagccctgcagctccacgtccaggccggcgctggaggaggacgtcatttaccacgtgaaatacgacgactacccggagaacggcgtggtccagatgaactccagggacgtccgagcgcgcgcccgcaccatcatcaagtggcaggacctggaggtgggccaggtggtcatgctcaactacaaccccgacaaccc5caaggagcggggcactggtacgacgcggagatctccaggaagcgcgagaccaggacggcg一20．4GACAAGCTGTTCGCGGCGAC汹GGGGGCGTGGTTTGAGGCGCA∞GCAGGACCTGGAGGTGGGCCA∞表1．10前五个外显子中所有潜在靶位点基于CRISPR／Cas9系统的人胚肾上皮细胞UHRFI基因定向编辑注：灰色部分为NGG序列。GGGTCGCACGCAAGTCCGCGCGGGTTTCATCGCCATCCCCAGCeGGGCAGGCAGACAAGCTGTTCGCGGGTCCAGGCTGACCAAGGTGGAGGGAGCTCTCCGACACCGACTCCC蛔GGCGTGGTTTGAGGCGCAGGTGGGCGCGAGACCAGGACGGCGCGG0GGCGGGCAGCGTITGCCGAGC_GQGTTTGCCGAGCGGGCGCTCCGGGExonlGGTCGCACGCAAGTCC(℃GCGGGGTCGCACGCAAGTCCGCGCGGGQGTGGATCCAGGTTCGGACCATGGGGACGGGAGGCAGACCCACACGGExon2GGAGCTGAGGCGGAAGATCCAGGGAGCTGTTCCACGTGGAGCCAGG3GTCCTCCACCCACGGTGAGGCGGGGCCAGCCGATGAGGACATGTGGGATGCTCGGGACACGAACATGGGGAACATGGGGGCGTGGTTTGAGGExon4GGllTGAGGCGCAGGTGGTCAGGGTTTGAGGCGCAGGTGGTCAGGGGGTGGTCAGGGTGACGCGGAAGGGACGCGGAAGGCCCCCTCCCGGGGTCCAGGCCGGCGCTGGAGGAGGGCGTGGTCCAGATGAACTCCAGGGCGCCCGCACCATCATCAAGTGGGGACCTGGAGGTGGGCCAGGTGG5GCGGGGCTTCTGGTACGACGeGGGCGGGAACTCTACGCCAACGTGG．21．GCGGGCAGCGTTTGCCGAGCGGGGCTGTCCAGGCTGACCAAGGTGGGATCCAGGAGCTGll℃CACGTGGGCCTGCAGAGGCTGTTCTACAGGGAATGACACCATCCAGCTCCTGGGCCAGCCGATGAGGACATGTGGGGGGACACGAACATGGGGGCGTGGGGTACGACGCGGAGATCTCCAGGcg蝴ttCaaaaaaagcaccgactcgg(二)gRNA表达载体构建鲤』鱼：至互丝鳗垡鎏丝箜谜嚣篓盎GG2、引物合成1一gct嘲酾GGAGCTGAGGCGGAAG1、gRNA片段的扩增结果③CRISPR／Cas9系统的正确剪切需要靶向20个序列中PAM上游的12个碱基与gRNA的精确配对，而对靶向位点PAM上游远端的8个碱基的配对要求并不严格。将以上所有潜在位点剔除前8个核苷酸后，余下的12个核苷酸与NGG序列在NCBI(http：／／blast．ncbi．nlm．nih．gov／Blast．cgi)中与整个基因组序列进行比对(Blast)，若存在非特异位点则剔除该序列。由于NGG的N为任意核苷酸，故将余下位点的NGG中的N与A、G、C、T进行任意切换后进一步比对，最终获得位于基因第二外显子上的最优靶位点：GGAGCTGAGGCGGAAGATCCAGG(图1．4)。确定靶位点序列后，设计gRNA的PCR引物，由生工生物工程有限公司合成。引物合成模式图见图1．3，引物序列见表1．1l。表1．11gRNAPCR引物名称序列(5’-÷3’)第二军医大学硕士学位论文注：灰色背景部分分别为XbaI和EcoRI酶切位点，大写字体为靶位点序列。UHRFl图1．4UHRFi基因靶位点模式图白色框为上下游非编码区，黑色框为UHRFl基因外显子，共17个。靶位点位于第二外显子上。hUHRFtarget-FATCCgttttagagctagaaatagcaagttaaahUHRFl-target．RUItRFIgeneC震ISPRsite．22．17target。．；；。。2、重组质粒的鉴定结果以gRNA-puro质粒为模板，利用含UHRFl靶向位点的引物PCR扩增gRNA片段。取69l产物经2％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，结果显示PCR扩增产物大小与理论值119bp相符(图1．5)。菌液PCR鉴定结果见图1．6，其中l、2、4、5条带大小与理论值664bp相近，测序结果显示皆为正确阳性载体。基于CRISPR／Cas9系统的人胚肾上皮细胞UHRF!基因定向编辑图1．5体外合成gRNA片段PCR产物marker；l：PCR产物；2：阴性对照；2％琼脂糖凝胶。图1．6菌液PCR产物marker；l-7：不同单克隆菌液；M．-D2000MM：D2000．23．1234567三、讨论因组中唯一存在的靶位点，能有效避免潜在的脱靶效应，为后续实验建立UHRFl基本论文第一部分研究结果最终确定的UHRFl靶位点位于UHRFl基因的第二外显子上，其完全符合靶位点的设计原则：载体中U6启动子决定了靶位点由G开始；尽可能避开了CG富集位点，因为靶位点的CpG甲基化可能会影响gRNA的识别与结合；UHRFl靶位点位于基因上游有利于保证蛋白完整的敲除。本研究将获得的UHRFl靶位点NGG及其上游12个核苷酸在PubMed数据库中进行blast，确认其为细胞基因敲除单克隆细胞株提供了可靠的实验基础。已知靶位点寻找是各种基因组编辑技术的核心，是决定各套基因组编辑系统能否成功运作的关键。锌指核酸酶(Zinc．fingernuclease，ZFN)技术和转录激活因子样效应子核酸酶(Transcriptionnucleases，TALEN)技术的特异性序列识