生物化学实验（2）讲稿

西南科技大学 生命科学与工程学院 讲 稿 2011～2012 学年第 2 学期 系（中心）： 生物技术与工程系 课程名称： 生物化学实验（2） 课程类型： 专业必修 课程学时： 24 授课班级： 生工2010 主讲教师： 徐健蓉 职 称： 副教授 使用教材： 《基础生物化学实验》，魏群等编，高等教育出版社（第三版） 实验一 酪蛋白的制备 一、目的 1、学习从牛奶中制备酪蛋白的原理和方法。 2、掌握等电点沉淀法提取蛋白质的方法。 二、原理 牛乳中的主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯酪蛋白。 三、材料、试剂与器具 （一）材料 新鲜牛奶 （一）试剂 1、95%乙醇 1200mL 2、无水乙醚 1200mL 3、0.2mol/L pH4.7醋酸——醋酸钠缓冲液 300ml 先配A液与B液 A液：0.2mol/L醋酸钠溶液 称NaAC·3H2O 54.44g，定容至2000ml。 B液：0.2mol/L醋酸溶液，称优 纯醋酸（含量大于99.8%）12.0g定容至1000ml。 取A液1770ml，B液1230ml混合即得Ph4.7的醋酸——醋酸钠缓冲液3000ml。 4、乙醇——乙醚混合液 乙醇：乙醚=1 ：1（V/V） （二）器具 1、离心机 2、抽滤装置 3、精密pH试纸或酸度计 4、 电炉 5、烧杯 6、温度计 四、操作步骤 （一）酪蛋白的粗提 100mL牛奶加热至40℃。在搅拌下慢慢加入预热至40℃、pH4.7的醋酸缓冲液100mL.用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。 将上述悬浮液冷却至室温。离心15分钟（3000 r /min）。弃去清液，得酪蛋白粗制品。 （二）酪蛋白的纯化 1、用水洗涤沉淀 3次，离心10分钟（3 000r/min），弃去上清液。 2、在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。 3、将沉淀摊开在 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面 上，风干；得酪蛋白纯品。 （三）准确称重，计算含量和得率。 含量：酪蛋白g/100 mL牛乳（g%） 式中理论含量为3.5g/100mL牛乳。 五、注意事项 1、由于本法是应用等电点沉淀法来制备蛋白质，故调节牛奶液的等电点一定要准确。最好用酸度计测定。 2、精制过程用乙醚是挥发性、有毒的有机溶剂，最好在通风橱内操作。 3、目前市面上出售的牛奶是经加工的奶制品，不是纯净牛奶，所以计算时应按产品的相应指标计算。 六、思考题 1、制备高产率纯酪蛋白的关键是什么？ 2、试设计另一种提取酪蛋白的方法？ 实验二 酶的特性 一、目的   酶是生物催化剂，生物体内化学反应基本上都是在酶的催化下进行的。通过本实验了解酶催化的特异性以及pH、温度、抑制剂和激活剂对酶活力的影响，对于进一步掌握代谢反应及其调控机理具有十分重要的意义。   二、原理 通过比较淀粉酶在不同pH、不同温度以及有无抑制剂或激活剂时水解淀粉的差异，说明这些环境因素与酶活性的关系。 酶与一般催化剂最主要的区别之一是酶具有高度特异（专一）性，即一种酶只能对一种底物或一类底物（此类底物在结构上通常具有相同的化学键）起催化作用，对其他底物无催化反应。例如，淀粉酶和蔗糖酶虽然都是催化糖苷键的水解，但是淀粉酶只对淀粉起作用，蔗糖酶只水解蔗糖。还原糖产物可用Benedict试剂鉴定。 三、试剂和器材  （一）、试剂 2%蔗糖溶液：用分析纯蔗糖新鲜配制。 1%淀粉溶液：1g淀粉和0.3g NaCl，用5ml蒸馏水悬浮，慢慢倒入60ml煮沸的蒸馏水中，煮沸1min，冷却至室温，加水到100ml，冰箱贮存。 0.1%淀粉溶液：0.1g淀粉，以5ml水悬浮，慢慢倒入60ml煮沸的蒸馏水中，煮沸1min，冷却至室温，加水到100ml，冰箱贮存。 Benedict试剂：17.3g CuSO4•5H2O，加100ml蒸馏水加热溶解，冷却；173g柠檬酸钠和100gNa2CO3•2H2O，以600ml蒸馏水加热溶解，边加边搅匀，最后定容至1000ml。如有沉淀可过滤除去，此试剂可长期保存。 碘液：3g KI溶于5ml蒸馏水中，加1g I2，溶解后再加295ml水，混匀贮存于棕色瓶中。 磷酸缓冲液： A液：0.2mol/L Na2HPO4 称取28.40g Na2HPO4(或71.64g Na2HPO4•12H2O)溶于1000ml水中。 B液：0.1mol/L 柠檬酸 称取21.01g柠檬酸（C6H8O7•H2O）溶于1000ml水中。 pH5.0缓冲液：10.30ml A液+9.70ml B液 pH7.0缓冲液：16.47ml A液+3.53ml B液 pH8.0缓冲液：19.45ml A液+0.55ml B液 1% CuSO4•5H2O溶液。 1% NaCl。   （二）、材料 (1) 唾液淀粉酶溶液：先用蒸馏水漱口，再用10ml左右蒸馏水，轻轻漱动，2分钟后吐出收集在烧杯中，即得清澈的唾液淀粉酶原液，根据酶活高低稀释50倍，即为唾液淀粉酶溶液。 (2) 蔗糖酶溶液：取1g鲜酵母或干酵母放入研钵中，加入少量石英砂和水研磨，加50ml蒸馏水，静置片刻，过滤即得。   （三）、仪器 恒温水浴（37℃，70℃）、沸水浴（100℃）、冰浴（0℃），试管18×180共19支，吸管1ml7支、2ml3支、5ml5支，量筒100ml1个，白瓷板，胶头滴管3支   四、操作 （一）、温度对酶活力的影响 取3支试管，按下表操作： 操作项目 管号 1 2 3 唾液淀粉酶溶液(ml) 1 1 1 pH7.0磷酸缓冲液(ml) 2 2 2 温度预处理5min（℃） 0 37 70 1%淀粉溶液(ml) 2 2 2 摇匀，保持各自温度继续反应，5分钟后每隔1分钟从第2号管吸取1滴反应液于白瓷板上，用碘液检查反应进行情况，直至反应液不再变色（只有碘液的颜色），立即取出所有试管，流水冷却2min，各加1滴碘液，混匀。观察并记录各管反应现象，解释之。 （二）、pH对酶活力的影响 取3支试管，按下表操作： 操作项目 管号 1 2 3 pH5.0磷酸缓冲液(ml) 3 0 0 pH7.0磷酸缓冲液(ml) 0 3 0 pH8.0磷酸缓冲液(ml) 0 0 3 1%淀粉溶液(ml) 1 1 1 预保温 混匀，37水浴中保温2min 唾液淀粉酶溶液(ml) 1 1 1 检查淀粉水解程度 摇匀，置37℃水浴中继续反应2分钟，每隔1分钟从第2号管中取出1滴反应液于白瓷板上，加碘液检查反应进行情况，直至反应液不再变色，即可停止反应，取出所有试管。 碘液(滴) 1 1 1 现象      （三）、唾液淀粉酶的活化与抑制 操作项目 管号 1 2 3 1% NaCl(ml) 1 0 0 1% CuSO4(ml) 0 1 0 蒸馏水(ml) 0 0 1 唾液淀粉酶溶液(ml) 1 1 1 0.1%淀粉溶液(ml) 3 3 3 保温反应并检查淀粉水解程度 摇匀，37℃水浴反应1min左右即可用碘液检查1号试管淀粉水解程度，待1号试管的反应液不再变色时取出所有试管。 碘液(滴) 1 1 1 现象 　 　 　 （四）、酶的专一性 取6支干净试管，按下表操作： 操作项目 管号 1 2 3 4 5 6 1%淀粉(ml) 1 1 0 0 1 0 2%蔗糖(ml) 0 0 1 1 0 1 唾液淀粉酶原液(ml) 1 0 1 0 0 0 蔗糖酶溶液(ml) 0 1 0 1 0 0 蒸馏水(ml) 0 0 0 0 1 1 酶促水解 摇匀，37℃水浴中保温10min Benedict试剂(ml) 2 2 2 2 2 2 反应 摇匀，沸水浴中加热5～10min 现象   　   　   　    注意事项   （1）各人唾液中淀粉酶活力不同，因此实验2、3、4应随时检查反应进行情况。如反应进行得太快，应适当稀释唾液；反之，则应减少唾液淀粉酶稀释倍数。 （2）酶的抑制与激活最好用经透析的唾液，因为唾液中含有少量Cl－。另外，注意不要在检查反应程度时使各管溶液混杂。   思考题： 1、何谓酶的最适温度及其应用意义？ 2、何谓酶的最适pH？对酶的活性有什么影响？ 3．什么是酶的活化剂？ 4、什么是酶的抑制剂？ 5、酶作为一种生物催化剂，有哪些催化特点？ 实验三、菜花（花椰菜）中核酸的分离和鉴定 1、 目的 初步掌握从菜花中分离核酸的方法和RNA、DNA的定性鉴定。 2、 原理 　用冰冷的稀三氯醋酸或稀高氯酸溶液在低温下抽提菜花匀浆，以除去酸溶性小分子物质；再用有机溶剂，如乙醇、乙醚等抽提，去掉脂溶性的磷脂等物质。最后用浓盐溶液（１０％氯化钠溶液）和0. 5mol/L高氯酸（７０℃）分别提取ＤＮＡ和ＲＮＡ，再进行定性检定。 　由于核糖和脱氧核糖有特殊的颜色反应，经显色后所呈现的颜色深浅在一定范围内和样品中所含的核糖和脱氧核糖的量成正比，因此可用定糖法来定性定量测定核酸。 　１．核糖的测定： 　 测定核酸的常用方法是苔黑酚（ 即：３，５－二羟甲苯）法（Orcinol反应）。当含有核糖的ＲＮＡ与浓盐酸及３，５－二羟甲苯在沸水浴中加热1０-２0分钟后，有绿色物产生，这是因为ＲＮＡ脱嘌呤后的核糖与酸作用生成糠醛，后者再与３，５－二羟甲苯作用产生绿色物质。 　　　　　 　　　　　 100℃ ＲＮＡ＋浓盐酸＋二羟甲苯───→ 绿色复合物 FeCl3 ＤＮＡ、蛋白质和粘多糖等物质对测定有干扰作用。 　 ２．脱氧核糖的测定： 　测定脱氧核糖的常用方法是二苯胺法。含有脱氧核糖的ＤＮＡ在酸性条件下和二苯胺在沸水浴中共热１０分钟后，产生蓝色。这是因为ＤＮＡ嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成ω－羟基－６－酮基戊醛，它再和二苯胺作用产生蓝色物质。 　　　　　 100℃ 　　　　　 ＤＮＡ＋少量浓Ｈ2ＳＯ4＋二苯胺 ───→蓝色物 　 此法易受多种糖类及其衍生物和蛋白质的干扰。 　 上述两种定糖的方法准确性差，但快速简便，能鉴别ＤＮＡ与ＲＮＡ，是检定核酸、核苷酸的常用方法。 三、器材试剂和材料 四、操作 一、核酸的分离： 　１．取菜花的花冠20克，剪碎后置于研钵中。加入20毫升９５％乙醇和４００毫克海砂，研磨成匀浆。然后用布氏漏斗抽滤，弃去滤液。 　２．滤渣中加入２０毫升丙酮，搅拌均匀，抽滤，弃去滤液。 　 ３．再向滤渣中加入２０毫升丙酮，搅拌５分钟后抽干（用力挤压滤渣，尽量除去丙酮）。 　 ４．在冰盐浴中，将滤渣悬浮在预冷的２０毫升５％高氯酸溶液中。搅拌抽滤，弃去滤液。 　５．将滤渣悬浮于２０毫升９５％乙醇中，抽滤，弃去滤液。 　 ６．滤渣中加入２０毫升丙酮，搅拌５分钟。抽滤至干，用力挤压滤渣尽量除去丙酮。 　 ７．将干燥的滤渣重新悬浮在４０毫升１０％氯化钠溶液中。在沸水浴中加热１５分钟。放置，冷却，抽滤至干，留滤液。并将此操作重复进行一次。将两次滤液合并，为提取物一。 　 ８．将滤渣重新悬浮在２０毫升０．５mol/L高氯酸溶液中。 加热到７０℃，保温２０分钟(恒温水浴)后抽滤。留滤液(提取物二)。 二、ＲＮＡ、ＤＮＡ的定性检定： 　１．二苯胺反应： ──────────────────────────────────── 管 号 　　　 １ 　 ２ 　 ３ 　 ４ 　 ５ ──────────────────────────────────── 蒸馏水（毫升） 　１ 　 － 　 － 　 － 　－ ＤＮＡ溶液（毫升） － 　 １ 　 － 　 － 　－ ＲＮＡ溶液（毫升） － 　 － 　１ 　 － 　 － 提取物一（毫升） － － － １ － 提取物二（毫升） － － － － １ 二苯胺试剂（毫升） ２ ２ ２ ２ ２ 放入沸水浴中１０分钟后的现象 ──────────────────────────────────── ２．苔黑酚反应： ──────────────────────────────────── 管 号 １ ２ ３ ４ ５ ──────────────────────────────────── 蒸馏水（毫升） １ － － － － ＤＮＡ溶液（毫升） － １ － － － ＲＮＡ溶液（毫升） － － １ － － 提取物一（毫升） － － － １ － 提取物二（毫升） － － － － １ 三氯化铁浓盐酸溶液（毫升） 2 ２ ２ ２ ２ 苔黑酚乙醇溶液（毫升） 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 放沸水浴中10-20分钟后的现象 ──────────────────────────────────── 　根据现象分析提取物一和提取物二主要含有什么物质？ 思考题 1、核酸分离时为什么要除去小分子物质和脂类物质？本实验是怎样除掉的？ 2、实验中呈色反应时RNA为什么能够产生绿色复合物？DNA产生蓝色物质？ 实验四 小麦萌发前后淀粉酶活力分比较 一、目的 1、学习分光光度计的原理和使用方法 2、学习测定淀粉酶活力的方法 3、了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化 二、原理 种子中贮藏的糖类主要以淀粉的形式存在。淀粉酶能够使淀粉分解为麦芽糖。 2（C6H10O5）n+nH2O nC12H12O11 麦芽糖具还原性，能使3.5二硝基水杨酸还原成棕色的3-氨基5-硝基水杨酸，后者可用分光光度法测定。 休眠种子的淀粉酶活力很弱，种子吸胀萌动后，淀粉酶活力组建增强，并随发芽天数的增长而增加。本实验观察小麦种子萌发前后淀粉酶活力的变化。 三、仪器设备 1、有关玻璃仪器 2、乳钵 3、离心机 4、分光光度计 5、恒温水浴 四、试剂和材料 1、0.1% 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 麦芽糖溶液 50mL 2、PH6.9，0.02mol/L 磷酸缓冲液 100mL 3、1%淀粉 100ml 4、1%3,5-二硝基水杨酸 200ml 5、1%NaCL 500ml 6、石英砂若干 7、小麦种子 五、操作 1．种子萌发 2．酶液提取 3．酶活力测定 4．计算 六、思考题 1、为什么此酶提纯整个过程在0～5℃条件下进行？而测酶的活力时要在25℃预保温？反应后又放入沸水中？ 2、实验结果说明什么？ 实验五 植物可溶性蛋白的提取、分离和定量测定 目的 1、 了解和掌握植物可溶性蛋白的提取和定量测定的原理和基本操作技术， 2、 了解和掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白的原理和基本操作技术 一、植物可溶性蛋白的提取 植物材料中通常含有两类蛋白，一种是易溶于水主要存在于细胞基质、叶绿体基质和线粒体等细胞器基质中的可溶性蛋白，另一类是难溶于水主要存在于各种细胞器膜上的膜结合蛋白。将植物材料在一定的提取缓冲液和0～4℃低温下充分研磨，可溶性蛋白将溶解在提取缓冲液里，通过一定的离心力将未破碎细胞器和膜蛋白去除，得到的离心上清夜就是可溶性蛋白的粗提物。 二、考马斯亮蓝染色法测定可溶性蛋白的含量 原理 考马斯亮蓝 G-250 （ Coomassie brilliant blue ， G-250 ）法是利用蛋白质-染料结合的原理，定量地测定微量蛋白质浓度的快速、灵敏的方法。 考马斯亮蓝 G-250 存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德瓦尔键结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律。此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变成蓝色形式，最大光吸收由465nm 变成595nm ，通过测定595nm 处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。 蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min 即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定 1 h ，之后，蛋白质-染料复合物发生聚合并沉淀出来。此法灵敏度高（比 Lowry 法灵敏 4 倍），易于操作，干扰物质少，是一种比较好的定量法。其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。 实验材料、试剂与仪器设备 （一）实验材料 植物材料。 （二）试剂 1. 标准蛋白质溶液（100 μg/mL 牛血清白蛋白）：称取牛血清蛋白25mg ，加水溶解并定容至100mL，吸取上述溶液40mL ，用蒸馏水稀释至100mL 即可。 2. 考马斯亮蓝试剂：称取 100 mg 考马斯亮蓝 G-250，溶于50 mL 90 ％乙醇中，加入100 mL85 ％（W/V）的磷酸，再用蒸馏水定容到 1000 mL ，贮于棕色瓶中。常温下可保存一个月。 （三）仪器设备 分光光度计，离心机，研钵，烧杯，量瓶，移液管，试管等。 实验步骤 1. 标准曲线的绘制 取 6 支试管，按表 26–1 加入试剂，摇匀，向各管中加入5mL 考马斯亮蓝试剂，摇匀，并放置5min 左右，以 0 号试管为空白对照，在595 nm下比色测定吸光度。以蛋白质含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。 2. 样品测定 （1） 样品提取 称取鲜样0.25 - 0.5 g，用5mL 蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后，3000 r/min 离心10 min ，上清液备用。 （2）吸取样品提取液 1.0 mL （视蛋白质含量适当稀释），放入试管中（每个样品重复 2 次），加入5 mL 考马斯亮蓝试剂，摇匀，放置2 min 后在 595nm 下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查得蛋白质含量。 表 1-1 绘制标准曲线的各试剂加入量 试 剂 管 号 1 2 3 4 5 6 标准蛋白质（ mL ） 0 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 蒸馏水量（ mL ） 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0 蛋白质含量（ μg ） 0 20 40 60 80 100 四、结果计算 样品中的蛋白质含量＝（C×VT）/(VS×WF×1000) （ mg/g ） 式中： C ——查标准曲线值，μg 。 VT ——提取液总体积 , mL 。 VS ——测定时加样量 , mL 。 WF ——样品鲜重 , g 。 实验六，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离植物可溶性蛋白 原理 带电粒子在电场中向带有相反电荷的电极移动，叫做电泳。若以V代表球形分子在电场中的移动速度，E代表电场强度，Q为带电粒子所带电荷量，粒子半径为r，溶液粘度为η，则： ν/E=Q/6πηr 即为电泳速度与电场强度和颗粒所带电荷量成正比，而与颗粒的大小、溶液的粘度成反比。在一定的pH条件下，每一种分子都具有一定的电荷、大小与形状，在相同的电场经一定时间的电泳，便会集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。不同组分的蛋白质（包括同工酶）分子组成、结构、大小、形状均有所不同，在溶液中所带的电荷多寡不同，在电场中的运动速度也不同。因此经过电泳便会分成不同的区带。然后用适当的染料着色，这样就可以在凝胶上展现出蛋白质或同工酶的谱带。聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，缩写为PAGE）是以聚丙烯酰凝胶作支持介质的一种电泳方法。它是由丙烯酰胺单体（Acrylamide简称Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（N·N'-methylena Bisacrylamide简称Bis）在催化剂的作用下，聚合交联而成的三维网状结构凝胶。当Acr和Bis遇到自由基时，便能聚合。引发自由基产生的方法有两种：化学法和光化学法，亦称为化学聚合或光化学聚合法。化学聚合的引发剂是过硫酸胺（简称PA）。在催化剂N，N，N'，N'-甲基乙二胺 （Tetramethylenediamine 简称TEMED）的作用下，由PA形成氧自由基而引发聚合反应，由于反应需要TEMED的游离碱基，所以在低pH下，聚合反应可能延迟甚至被阻止。增加TEMED或过硫酸铵浓度可以增加聚合反应速度，但速度过快影响制板操作，两者浓度过高也影响蛋白质活性。光聚合以核黄素（VB2）作为催化剂（可以不加TEMED），在痕量氧的存在下，光照起动核黄素光解形成自由基，从而引发聚合作用。但过量的氧会阻止链长的增加。若在光聚合时加入TEMED可以加速聚合。光聚合形成的凝胶孔径较大，而且随时间延长逐渐变小，不太稳定，所以用它来制备大孔径凝胶较合适。采用过硫酸铵-TEMED化学聚合形成的凝胶孔径较小，而且重复性好，常用来制备分离胶。氧抑制聚合反应，因此凝胶混合物在聚合前需要脱气。Acr和Bis的浓度、交联度可以决定凝胶的密度、粘度、弹性、机械强度以及孔径大小。100ml凝胶溶液中含有的单体和交联剂总克数为凝胶浓度，用T%表示。凝胶溶液中交联剂占单体加交联剂总量的百分数称之为交联度，用C%表示。 T%＝（a+b）×100/m C%＝b×100/(a+b) 式中 a—Acr的质量（g）； b—Bis的质量（g）； m—凝胶溶液总体积（ml）。 在此，a∶b（W/W）是关键；a∶b ＜10时，形成的凝胶脆、硬、呈乳白色；a∶b＞100时，即使5%的凝胶也呈糊状，易断裂。要制备透明而有弹性的凝胶，a∶b要控制在30左右。通常T = 2%~5%时，a∶b =20左右；T = 5%~10%时，a∶b =40左右；T = 15%~20%时，a∶b =125~200左右。T在3%~25%的范围内，凝胶易发生聚合。T=7.5%的胶称作标准凝胶。大多数生物体内的蛋白质在此凝胶中电泳能得到满意的结果。聚丙烯酰胺凝胶电泳使蛋白质分离的效应有三个，一是电荷效应：各种蛋白质分子所带电荷不同，在同一电场中泳动率不同；二是分子筛效应；蛋白质分子大小和形状各不相同，在通过一定浓度（一定孔径）凝胶时受阻力各不相同，泳动率也不相同；三是凝胶为不连续系统（凝胶层、pH、电位梯度均不连续），从而使样品浓缩在一个极窄的起始区带，即所谓浓缩效应，提高了条带分辩率。 器材、试剂和材料 电泳仪一套（稳压电源，垂直电泳槽和相配套的凹槽玻璃）；真空泵及真空干燥器；台式高速离心机（10000rpm）；烧杯：50ml×1、25ml×1；三角瓶：100ml×1；微量进样器：50μl×2；注射器：5ml×1；穿刺针头；皮头滴管；刻度吸：10ml×3、5ml×2、0.1ml×1；医用胶布；培养皿：20ml×2（或用白瓷盘代替，染色用）。 试剂 30%丙烯酰胺（Acr，未纯化的试剂，配制后需过滤）； 1%甲叉双丙烯酰胺(Bis)； 10%的过硫酸铵（AP冰箱贮藏，不得超过5天）； 分离胶缓冲贮备液（3 mol/LTris-HCl pH8.8）：称取36.6gTris加30ml蒸馏水和48ml 1mol/L HCl，再用酸度计调pH至8.8，定容至100ml； 浓缩胶缓冲贮备液（0.5mol/L Tris-HCl pH6.8）：称取6.0gTris溶于40ml蒸水中，用1mol/L HCl约48ml调至pH=6.8，定容至100ml； 电极缓冲液（0.25mol/LTris，1.92mol/L甘氨酸，pH8.3）：称取3gTris 14.4g甘氨酸，重蒸馏水定容至100ml，用时稀释10倍。 N，N，N，，N' -甲基乙二胺（TEMED）； 提样缓冲液：稀释4倍的浓缩胶缓冲液； 样品处理液：5ml甘油，0.5ml 0.1%溴酚蓝，5ml浓缩胶缓冲液，加水14.5ml；1.5%琼脂。 操作 1.凝胶制备： （1）取两块电泳玻板（其中一块有凹槽），用热去污剂洗净，蒸馏水冲洗，直立干燥。洗净的玻板内面要避免手指触摸以防沾污。根据所需凝胶厚度选择1~3mm厚的玻璃或Teflon夹条，按图29-1安装并用胶布将两侧封好。将板用铁夹固定于制胶架上，下部插入封胶琼脂小盒中。待模具安装好后，用电极缓冲液配制1.5%琼脂液（冬天1.5%，夏天2%），沸水浴加热至琼脂完全溶化后，用皮头滴管先沿板上部灌入两侧的封胶孔(图29-1d)再直接于琼脂盒（图29-1c）将琼脂灌入，注意不要产生气泡。一旦用琼脂封板后，模具不应再挪动，以防产生裂缝。封好的模具应三面有连续琼脂封闭区(图29-1b)。 表29-1丙烯酰胺凝胶配制表 类别 分离胶 浓缩胶 T% 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 3 30%Acr 5.0 7.3 9.75 12.32 14.88 17.4 20.0 1 1%Bis 4 5.6 7.5 5.4 3.5 3.5 3 1 分离胶缓冲液 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 - 浓缩胶缓冲液 - - - - - - - 2.5 重蒸水 17.05 13.15 8.8 8.33 7.67 5.15 3.05 5.43 10%AP 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.07 注：分离胶30ml，浓缩胶10ml，可根据需要，按比例增减各成份的体积。 （2）根据需要从表29-1中选择适当浓度值，配制凝胶。一般同工酶可选择7.5%~10%的胶（过氧化物酶和酯酶7.5%较合适，超氧化物岐化酶用10%，可溶性蛋白可根据需要配制）。将配制好的凝胶液置真空干燥器中，抽气10min，再加入TEMED 15μl，混匀后用一细玻棒引流，沿无凹槽的玻板缓缓注入胶室中，注胶过程防止气泡产生。胶液加到离凹槽3cm处为止，立即用注射器轻轻在胶溶液上面铺1cm高的水层，但不要扰乱丙烯酰胺胶面。待分离胶和水层之间出现清晰的界面时，表示聚合已完成。用注射器小心吸出上层覆盖水，按上表配制好浓缩胶，抽气后加入5μl TEMED，混合后加到分离胶上层，插入预先选择好的样品梳，注意不要带入气泡。 2.样品制备：采小麦幼苗上数第一展开叶，取中部，除去叶脉，准确称取1g，加入少量提样缓冲液，置冰浴研磨匀浆后定容至5ml，10000rpm离心15min，上清液为可溶性蛋白和的粗提液。取此液0.5ml加入等体积样品处理液，混匀后贮于冰箱备用。 （1）将制好的凝胶板夹在电泳槽上，向上下槽注入电极缓冲液，取下样品梳（注意不要拉断样槽隔墙）。将微量进样器针头插入样槽下部慢慢进样。每槽点样15~20μl。 （2）上槽接负极，下槽接正级，接通电源，电流调至15~20mA，电压为200V，电泳至溴酚蓝标志到达凝胶前沿为止。将电流、电压调至零后断电。 （3）电泳结束后，取下玻板，揭掉胶布，抽出夹条，将两块玻板置自来水龙头下，借助水流，用解剖刀柄轻轻从板侧缝间撬开玻板（注意切忌从凹槽处撬），将胶放入染色液中。 3.染色： （5）可溶性蛋白的染色 称取0.2g考马斯亮蓝R250，用少量无水乙醇溶解，用含有40%乙醇和7%醋酸的水溶液稀释至200ml。将胶板浸入此液室温下染色5~6h，倒去染色液，用水冲洗附着于胶面的染料，再将胶浸入脱色液中（400ml乙醇，70ml冰醋酸加水到1000ml）更换脱色液几次，直到背景清晰为止。 （6）结果保存 将脱过色的凝胶照像或扫描后作为实验 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 的凭证。作为学生实验报告可用绘图或制作干胶的方法记录酶谱带或可溶性蛋白质的主要谱带或用干胶片保存结果。方法如下： A. 干胶制备：裁下2张比胶片四边长3cm左右的玻璃纸在水中浸湿后，先将一张平铺在玻璃板上，放上凝胶片再盖上另一张，用玻棒赶走气泡，将玻璃纸边缘折向玻板底部，用另一块同样大小的玻璃板压住，再用夹子夹住两端固定，室温下避光放置一天左右即可，然后取下干胶，修剪整齐保存。 B. 绘图表示：将各种酶带按照颜色深浅绘成谱带图 思考题 1、 植物可溶性蛋白含量的测定方法有几种？各有什么优缺点？ 2、 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白的基本原理？ 3、 什么是凝胶的浓缩效应？ _1113652170.unknown