食品中苯并咪唑类农药残留的液相色谱-质谱_质谱法(HPLC-MS_MS)分析研究(可编辑)

食品中苯并咪唑类农药残留的液相色谱-质谱_质谱法(HPLC-MS_MS) 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 研究(可编辑) 食品中苯并咪唑类农药残留的液相色谱-质谱_质谱法 (HPLC-MS_MS)分析研究 集美大学 硕士学位论文 质谱/质谱法(HPLC- 食品中苯并咪唑类农药残留的液相色谱- MS/MS)分析研究 姓名:王冰 申请学位级别:硕士 专业:食品加工与安全 指导教师:熊何健;徐敦明 -12-19食品中苯并咪唑类农药残留的液相色谱-质谱/质谱法 2010 (HPLC-MS/MS)分析研究 摘 要 本研究建立了同时测定基质中多菌灵、噻菌灵、麦穗宁、硫菌灵、甲基硫菌灵和烯菌 灵残留的液相色谱-质谱/质谱(HPLC-MS/MS)的分析方法。 在国内外研究的基础上,通过实验对前处理的提取、净化条件进行了优化,由实验结 :采用乙腈提取,PSA-C18-石墨化炭黑粉净化,提取净化的效果最好。 果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明 在本研究的色谱条件下,多菌灵、噻菌灵、麦穗宁、硫菌灵、甲基硫菌灵和烯菌灵在 0.2?g/mL~10?g/mL间呈现良好的线性关系,相关系数?0.9990。经过实验确定了液相色谱 -质谱/质谱(HPLC-MS/MS)法中多菌灵、噻菌灵、麦穗宁、硫菌灵、甲基硫菌 灵和烯菌 灵的检出限为 5?g/kg。在大米、小麦、猪肉、猪肝、牛奶、柑橘、苹果、 土豆、核桃仁、 菠菜和茶叶基体中进行添加回收实验,添加浓度在 5~25?g/kg 间,回收率为 61.6%~ 104.8%,变异系数为 6.0%~14.4%。 本方法的测定低限可达 5mg/kg,完全能满足当前各国的残留限量要求。检测 本方法前 处理过程简便,灵敏度高,定量结果准确,适用于食品中苯并咪唑类农药残留 量的检测。 外拓性强可根据要求,增加检测农药品种,值得在进出口食品检测中推广使 用。 关键词 HPLC-MS/MS,苯并咪唑类农药,残留,固相萃取Ι Determination of Benzimidazoles residues in Foodstuffs by HPLC-MS/MS Abstract One-step extraction and high performance liquid chromatographyHPLC-MS/MS have been developed and validated for the determination of 6 kinds of benzimidazoles Carbendazim, Thiabendazole, Fuberidazole, Thiophanate, Thiophanate methyl, and Imazalilresidues in food matrices including rice, corn ,bean, orange, apple, potato, spinach, fish, pork, pig liver, milk, graph, and tea.The extraction efficiency of ethyl acetate and acetonitrile,different cleanup methods including Cl8 solid phase extractionSPEcartridge, hydrophilic?lipophilic balanceHLBSPE cartridge,activated carbon,florisil and Vario GPC and separation by HPLC are extensively investigated.The extraction recoveries of the seven kinds of benzimidazoles are between 61.6% and 104.8% for spiked level of 5-25?g/kg.The limits of quantification are 0.005 mg/kg for the 6 pesticidesS/N1 0.There are good linear correlations between the peak areas and concentrations of the seven kinds of benzimidazoles, the line arrange is 0.2?10?g/mL and the correlation coefficients are above 0.999. Keywords:HPLC-MS/MS; benzimidazoles; foodstuff; residue; LOQ II 学术诚信声明 兹呈交的学位论文,是本人在导师指导下独立进行的研究工作及取 得的研究成果。除文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其 他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。本人依法享有和承担由此 论文产生的权利和责任。 声明人(签名): 时 间: 保护知识产权声明 本人完全了解集美大学有关保留、使用学位论文的规定,即:学校 有权保留送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅,可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意集美大学可以 用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 作 者(签名):导 师(签名): 时 间:集美大学硕士专业学位论文 食品中苯并咪唑类农药残留的液相色谱-质谱/质谱法分析研究 第 1章 引言 1.1 苯并咪唑类农药的性质和用途 其主要品种有多菌灵、苯并咪唑类农药是高效低毒、广谱、内吸性杀菌剂, 噻菌灵、 甲基硫菌灵、硫菌灵,麦穗宁和烯菌灵等。2-氨基苯并咪唑是此类杀菌剂的主要降解产物, 对人体皮肤及眼睛有毒害作用。各物质的结构与性质见表 1.2。这类杀菌剂广泛应用于水 果等多种作物生长期和储存期真菌性病害的防治,若使用不当,会在水果及蔬菜中残留。 多菌灵在果树生长季包括果实成熟期常用于防治多种病害,由于其化学性质稳定, 能够 持久地残留在果品蔬菜中,导致多菌灵残留累积,可通过食物链影响人体健康。研究表明, 多菌灵对大鼠急性口服半数致死量为 8000~1000mg/kg,小鼠口服半致死量为 5000mg/kg。 对人、畜有一定的毒性,可引起兴奋、抽搐、精神恍惚、恶心呕吐、头昏头疼、胸闷、上 腹压痛等中毒症状。并能引起肝病, 还能导致染色体畸变等病症。噻菌灵具 有抑制霉菌 生长繁殖的作用,常用于水果的防腐保鲜。但水果中残留的噻菌灵对人体有一定的毒性, 主要侵害人体的肝脏,神经系统和骨髓,麦穗宁为一种广谱性内吸杀菌剂,用于种子处理, 防治镰刀菌引起的小麦、燕麦等麦类雪腐病、小麦腥黑穗病和大麦条病。烯菌灵(又名抑 霉唑)用于防治柑桔、香蕉等水果的青霉菌、绿霉菌、炭疽病、蒂腐病等贮藏病害。甲基 硫菌灵(又名甲基托布津)和硫菌灵广泛用于禾谷类、蔬菜、果树和某些经济作物病害的 防治,喷洒防治麦类赤霉病、白粉病、水稻稻瘟病等。具有高效、广谱、内吸等特点,它 对同类杀菌灵具有更高的活性和更强的内吸作用,并且具有杀螨卵效果。药剂在植物体内 转化为多菌灵而起杀菌作用。 1.2日本肯定列表以及欧美等国对咪唑类农药残留的限量要求 由于苯并咪唑类杀菌剂在农作物病害的防治方面有着广泛的应用,但其对人体又有一 定的毒害性。因此,国内外对多菌灵和噻菌灵的残留量都十分重视。我国及其他国家和组 织都制定了苯并咪唑类杀菌剂在不同种类农副产品中残留量的限量标准。最低残留限量 达 0.05 mg/kg。国际食品法典委员会CAC规定蔬菜和水果中 MBC限量为 0.5 mg/kg,欧 盟规定黄瓜和西红柿中多菌灵限量为 0.5 mg/kg,噻菌灵为 0.05 mg/kg。加拿大国家标准规 定黄瓜、西葫芦等蔬菜中多菌灵残留量每公斤不得超过 0.5 mg;马来西亚规定蔬菜类中 多菌灵残留量每公斤不得超过 1 mg;我国卫生标准 B14870-94中规定蔬菜、水果中多菌灵 残留量每公斤不得超过 0.5mg/kg。日本 2006年实行的农药、兽药及相关化学物质“日本肯 定列表制度”规定水果中多菌灵(苯菌灵,硫菌灵,甲基硫菌灵,多菌灵)总量最低限量不 超过 2mg/kg。各国食品中苯并咪唑类农药的最大残留限量见表 1.1。 1 集美大学硕士专业学位论文 食品中苯并咪唑类农药残留的液相色谱-质谱/质谱法分析研究 表 1.1 各国食品中苯并咪唑类农药的最大残留限量 (mg/kg) 最大残留限量值(mg/kg) 农药名称 荷 大 小 土 柑 葡 核 牛 猪 蓝 菠菜 茶叶 猪肝 米 麦 豆 橘 萄 桃 奶 肉 豆 多菌灵,托 日本 1.0 0.6 0.6 0.6 3.0 7.0 3 0.1 10 0.3 0.1 0.1 布津,甲基 托布津,苯 菌灵(总 欧盟 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.05 量) 中国 2 0.05 0.5 3 CODEX2 加拿大1.0 10.0 5 多菌灵 澳大利亚 0.05 100.2 0.1 0.1 5.0 2.0 0.1 韩国 日本 噻菌灵 中国 0.2 加拿大10 10麦穗宁日本 0.05 0.01 0.02 5.0 5.0 0.02 0.02 0.1 0.02 0.02 0.3 美国 00.1 0.02 0.01 澳大利亚 5 10 50.01 烯菌灵 中国5 CODEX 0.01 5 5 5欧盟0.050.05 5 0.050.05 韩国 0.05 0.01 5 5 1.3国内外检测技术现状 目前在国内外已报道的苯并咪唑类杀菌剂的残留分析中以研究多菌灵、噻菌 灵和烯菌 灵为主。分析方法有生物测定法、紫外分光光度法、荧光分析法、酶联免疫 分析法、液相 色谱分析、毛细管电泳法,气相色谱法、薄层扫描法等。苯并咪唑类属于热 不稳定,不适 于用气相色谱直接分析。主要采用液相色谱法或液相色谱-质谱/质谱法。样品的前处理方 法有液-液萃取法、固相萃取法、超临界流体萃取法和微波萃取法等。如 Amadeo等用液相 色谱-质谱/质谱法来测定水果蔬菜中多菌灵的残留,Rodney等用液相色谱法来测定蓝莓中 [22] 高效液相色谱荧光检测法测定番茄中多菌灵和的多菌灵的残留。胡彦学等 噻菌灵。廖国 [38] [82] 会等 固相萃取-HPLC法同时测定果蔬中多菌灵和噻菌灵残留量。付新梅等 用高效液相 [83] 色谱法同时测定甜瓜样品中的抑霉唑和噻菌灵;郝金芝等 高效液相色谱法测定水果中的 [24] 多菌灵。吴刚等 采用加速溶剂萃取一固相萃取结合液相色谱分析茶叶中多菌灵残留量。 2 集美大学硕士专业学位论文 食品中苯并咪唑类农药残留的液相色谱-质谱/质谱法分析研究 采用 HPLC法的相关研究报道还可见对油菜籽、芦笋、葡萄酒、食用菌、果汁、大豆植株 [11]-[13][16] 和土壤、芦笋、龙眼和中药铁皮石斛、西洋参药材中多菌灵残留量的测定 [20][28][42]-[45][54][56][73][78] 。 由于苯菌灵很不稳定,遇有机溶剂或水会易分解成多菌灵,因此存在苯菌灵原型药物 [76] 的可能性很小,检测时大多用多菌灵作为指标物来进行检测。何强等 对苯菌灵在苹果汁 中的降解行为进行了研究.Jeanne A. Itak等用磁性免疫颗粒检测水,土壤和水果中的苯菌 灵(以多菌灵计)和多菌灵。Chao Hong Liu等用LC/MS检测苹果,桃子和土豆中苯菌 灵,结果表明苯菌灵定量转化为多菌灵。同时甲基硫菌灵和硫菌灵在生物体内和环境中也 不稳定,易转化为多菌灵。国内外有关甲基硫菌灵和硫菌灵残留量文献报导不多,主要以 二氯甲烷为提取剂,经酸一碱液液分配使样品中的部分或全部甲基硫菌灵转变成多菌灵进 行测定。如 Carl F. Aten等用液相色谱法检测洋葱和甘蓝中甲基硫菌灵(以多菌灵计); Shashi B. Singh等用微波辅助提取法同时测定蔬菜中甲基硫菌灵和多菌灵残留量。少部分直接测 [81] 定样品中的甲基硫菌灵。如海云等 固相萃取-高效液相色谱法测定辣椒中甲基硫菌灵的残 留量。Attilio Veneziano等用高效液相色谱法检测香蕉中多菌灵、噻菌灵 和甲基硫菌灵。2- [57] 氨基苯并咪唑作为此类杀菌剂的主要降解产物,更少有报道。近来牟仁祥等 报道了采用 PSA分散固相萃取和离子对液相色谱测定蔬菜中多菌灵、甲基硫菌灵、噻菌灵及其有毒代 谢物 2一氨基苯并咪唑。 1.4本研究的提出 噻菌灵和多菌灵残留量检测的国外标准主要采用的是 FDA的分析方法,通过连续的 操作繁琐。目前国液一液分配步骤来实现样品的萃取与净化以制备供试品, 内标准有 [30] GB/T5009.188?2003 《蔬菜水果中甲基托布津、多菌灵的测定》, 采用液液萃取一紫外 [53] 分光光度计法,方法操作和数据处理较为复杂,灵敏度低; SN 0220?93 《出口水果中 多菌灵残留量检验方法》,采用的是连续的液一液分配法,检测限为 0.7 mg/kg。 SN 0606-1996 《出口乳及乳制品中噻菌灵残留量检验方法一荧光分光光度法》,采用连续的液一液分配 法, 检测限为 0.02mg/kg;SN 0520-1996 《出口粮谷中烯菌灵残留量检验方法》,采用连续 的液一液分配法,检测限为 0.025mg/kg。SN/T 1753-2006《进出口浓缩果汁 中噻菌灵、多 菌灵残留量检测方法高效液相色谱法》,检测限分别为 0.02mg/kg。综上所述,尽管我国目 前现有的标准尽管能满足水果、蔬菜和乳及乳制品中噻菌灵、多菌灵的检测要求。但未能 完全覆盖日本肯定列表中对食品检测所要求的品种,如动物组织样以及其它食品。且对甲 基硫菌灵,硫菌灵,麦穗宁,烯菌灵和 2-氨基苯并咪唑的检测缺少相应的方法。针对食品 中多种苯并咪唑类农药残留量的测定,国内外还没有对各类食品中多种苯并咪唑类农药残 留量检测的标准,而且检测低限不能满足日本肯定列表一律标准(0.01mg/kg)要求,因此, 需制定满足日本肯定列表中对食品要求的,苯并咪唑类农药残留量的检测标准。本标准在 3 集美大学硕士专业学位论文 食品中苯并咪唑类农药残留的液相色谱-质谱/质谱法分析研究 各种方法的基础上,对食品中苯菌灵,多菌灵,噻菌灵、甲基硫菌灵,硫菌灵,麦穗宁, 烯菌灵和 2-氨基苯并咪唑残留量检测方法进行试验并不断改进,根据苯并咪唑类杀菌剂在 各种溶剂中的溶解度,采用乙腈作为提取剂,用 SPE固相萃取小柱进行净化,液相色谱- 质谱/质谱法检测。 4 集美大学硕士专业学位论文 食品中苯并咪唑类农药残留的液相色谱-质 谱/质谱法分析研究 表 1.2 各物质的结构与性质 分子 药物名称 结构式 CAS 分子式 物理性质 毒性 LD50mg/kg 量 纯品是白色粉末,难溶于水,微溶于 急性经口:大白鼠 15000 mg/kg Carbendazim 丙酮、氯仿、乙酸乙酯,溶于无机酸 以上,兔、狗 8000 mg/kg 以上; 191.2 10605-21-7 灵和乙酸、油酸、硬脂酸等有机酸而形 雄鹌鹑 10996mg/kg饲料。小多菌 白成相应的盐。 鼠急性经皮 10000 mg/kg以上。 白色粉末。熔点 304-305?。在 25?, pH2.0的水中溶度为 1%,在 pH5-12 Thiabendazole 大白鼠 3330 mg/kg,小白鼠 水中溶解度低于 50ppm。丙酮中溶解 噻菌灵 3810 mg/kg,兔 3850 mg/kg。 201.2 148-79-8 度为 28g/L,苯 2.3g/L,氯仿 0.8g/L, (又名硫苯唑、涕必 大小白鼠极性经皮大于 15000 甲醇 9.3g/L,二甲基亚砜 80g/L,二 灵) mg/kg。甲基甲酰胺 39.0g/L。在水、酸、碱 性溶液中均稳定。 Thiophanate methyl 无色棱状结晶。熔点 181.5-182.5?。 大鼠急性经口 甲基硫菌灵(又名甲 23564-05-8 342.4 溶于丙酮、甲醇、氯仿、乙腈,不溶 LD507500mg/kg。 基托布津) 于水。在碱性介质中分解。 Thiophanate 结晶固体。熔点 195?(分解)。几 大鼠急性经口 硫菌灵 23564-06-9 C14H18N4O4S2 370.4 乎不溶于水,微溶于有机溶剂。遇 碱 LD5010000mg/kg。 (又名托布津) 性水溶液形成不稳定盐 Imazalil大鼠急性经口 LD50为 320 烯菌灵 35554-44-0 C H C NO 297.1 微溶于水,易溶于有机溶剂 mg/kg,急性经皮为 4200~4880 14 14 l2 2 (又名抑霉唑) mg/kg 不溶于水,易溶于甲醇、乙醇、丙酮 fuberidazole麦穗宁 3878-19-1 C H NO 184.2 大鼠经口 LD50为 1100 mg/kg 11 8 2 等有机溶剂 2-amino-benzimidazol 易溶于水、乙醇和丙酮,难溶于乙醚 934-32-7 C H N 133.2 大鼠经口 LD50为 500 mg/kg 7 7 3 2-氨基苯并咪唑 和苯 5 集美大学硕士专业学位论文 食品中苯并咪唑类农药残留的液相色谱-质谱/质谱法分析研究 2章 材料与方法 第 2.1试剂与材料 均为分析纯,水符合 GB/T 6682规定的一级水。 所用试剂除另附说明外, 主要试剂:甲醇:Tedia公司,色谱纯;乙腈:Tedia公司,色谱纯;丙酮:国药集团; 甲醇-HCl(2+8,V/V);乙酸乙酯:国药集团;三氯甲烷:国药集团;无水 MgSO :国药 4 集团;NaC1:国药集团;中性氧化铝、硅胶、Florisil柱:Supelc公司;C18、WatersMCX: Waters 公司。 2.2标准品 多菌灵、噻菌灵、麦穗宁、硫菌灵、甲基硫菌灵、烯菌灵标准品:Dr.Ehrenstrofer GmbH 公司提供。 2.3标准溶液 使用乙腈配制多菌灵、噻菌灵、麦穗宁、硫菌灵、甲基硫菌灵、烯菌灵的标 准溶液, 并于 0~4?条件下冷藏保存。 2.4仪器与设备 实验仪器:液质联用仪(HPLC-MS/MS),API5000型,美国 AB公司;分析天平,感 量 0.1mg,上海民桥精密科学仪器有限公司;均质器,K600型,德国博朗;涡旋混合器, MSI型,IKA公司;离心机,ANKE TGI-16G,上海安亭科学仪器厂;氮吹浓缩仪,Caliper Life Sciences。 2.5供试基质 大米、小麦、猪肉、猪肝、鱼肉、牛奶、柑橘、苹果、土豆、核桃、菠菜和茶叶。 制样要求:制样操作过程中应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。 茶叶及粮谷类:取代表性样品约 500 g,经磨碎机全部磨碎并通过 2.0 mm 圆孔筛, 混匀,装入洁净容器内密封,标明标记,于(0-4)? 冷藏存放。 蔬菜及水果类:取代表性样品约 500 g,将其可食部分先切碎,经多功能食品搅拌机 充分捣碎均匀,装入洁净容器内密封,标明标记,于-18 ?以下冷冻存放。 坚果:取代表性样品约 500 g,取出其可食部分,用磨碎机全部磨碎并通过 2.0 mm 圆 孔筛,混匀,装入洁净容器内密封,标明标记,于(0-4)? 冷藏存放。 6 集美大学硕士专业学位论文 食品中苯并咪唑类农药残留的液相色谱-质谱/质谱法分析研究 动物肌肉、肝脏、鱼肉:取代表性样品部分约 500 g,将其可食部分先切碎,经多功 能食品搅拌机充分捣碎均匀,装入洁净容器内密封,标明标记,于-18 ?以下冷冻存放。 2.6前处理方法 2.6.1提取 称取均质样品 2g(精确到 0.01g),置于 25mL离心管中,加入 10mL乙腈溶液,使用 加入 5gNaCl和无水 MgSO ,剧烈震荡 2min后,以 4000r/min均质器均质, 的转速离心 4 3min,取上清液,待净化。 2.6.2净化 取 PSA和 C18各 200mg,石墨化炭黑 10mg,置于盛上清液的离心管中,在涡旋混匀 器上震荡 2min,移取上清液与 20mL玻璃试管中,在 25?水浴氮吹仪中由氮气吹至剩余 0.5ml提取液,用乙腈定容至 1mL,过 0.22?m有机滤膜,待上机检测。 2.6.3添加回收实验 在 2g的样品中添加标准工作液,使其浓度分别为 5?g/kg、10?g/kg、25?g/kg进行添加 回收实验,每个水平做 6个平行样。测定每个样品含量,计算样本总体标准偏差与相对标 准偏差(变异系数)。 2.7结果计算 采用外标法定量, 用数据处理软件或按式(1)计算试样中多杀菌素药物的残 留量: A × Cs ×V X „„„„„„„„„„„1 As × m 式中: X - 试样中多杀菌素残留量的数值,单位为毫克每千克(mg/kg);A 样液中多杀菌素的峰面积; - A s ? 标准工作液中多杀菌素的峰面积; Cs - 标准工作液中多杀菌素的浓度,单位为毫克每升(mg/L); V - 样品最终定容体积,单位为毫升(mL); m - 试样量,单位为克(g) 7 集美大学硕士专业学位论文 食品中苯并咪唑类农药残留的液相色谱-质 谱/质谱法分析研究 第 3章 结果与分析 3.1测定方法的选择 苯并咪唑类农药属于热不稳定,不适于用气相色谱直接分析。国内外文献大 多采用 LC 或 LC-MS/MS测定苯并咪唑类农药中的多菌灵、噻菌灵或烯菌灵等几种农药 残留量。目前 国内标准有 GB/T 5009.188?2003《蔬菜水果中甲基托布津、多菌灵的测定》,采用液液萃 取一紫外分光光度计法,方法操作和数据处理较为复杂,灵敏度低;SN/T 0220?93《出口 水果中多菌灵残留量检验方法》,采用的是连续的液一液分配法,检测限为 0.7 mg/kg。SN/T 0606-1996《出口乳及乳制品中噻菌灵残留量检验方法一荧光分光光度法》,采用连续的液 一液分配法, 检测限为 0.02mg/kg;SN/T 0520-1996《出口粮谷中烯菌灵残留量检验方法》, 采用连续的液一液分配法,检测限为 0.025mg/kg;SN/T 1753-2006《进出口浓缩果汁中噻 菌灵、多菌灵残留量检测方法高效液相色谱法》,检测限分别为 0.02mg/kg。常用的高效液 相色谱法,检测低限尽管能满足水果和蔬菜中苯并咪唑类农药残留量的限量要求,却远不能 满足日本肯定列表中对动物源性食品的限量要求。因此本标准选用 LC-MS/MS进行研究。 3.2提取条件的选择 苯并咪唑类农药极性差异很大,多菌灵、噻菌灵和烯菌灵在酸性条件下溶于水,碱性 条件下难溶于水。麦穗宁、甲基硫菌灵,硫菌灵几乎不溶于水,2-氨基苯并咪唑易溶于水。 大多易溶于乙腈、苯、甲醇、丙酮和乙酸乙酯等有机溶剂,按文献方法分别 采用丙酮、甲 醇-HCl(2+8,V/V)、甲醇、乙腈、乙酸乙酯,三氯甲烷作提取剂,提取效果见表 3.1。结 果表明用乙腈提取回收率高,杂质干扰少。因为乙腈不仅能沉淀蛋白质而脂肪提出又很少, 又有利于后续的盐析和净化。三氯甲烷提取液,杂质多,干扰大。 实验中发现 pH值是影响回收率的很重要因素。多菌灵、噻菌灵和烯菌灵都是两性化 合物,其溶解性受 pH值变化的影响较大。在酸性条件下,易溶于水。在中性和偏碱性水 溶液中其溶解度低,易被有机溶剂萃取。发现随着 pH值增大,多菌灵、噻菌灵和烯菌灵 回收率明显提高,甲基菌灵和硫菌灵的回收率也有所提高。但甲基硫菌灵和硫菌灵在强碱 性条件下不稳定,会缓慢降解,故在样品处理中调节 pH时最好控制在 7~8。提取过程中 加入适量 NaCl,一方面起盐析作用,提高回收率,减少溶性杂质进入乙腈层,另一方面使 乙腈与水层分层。由于 2-氨基苯并咪唑极性较强,文献报道,仅用 NaC1为盐析试剂时, 下层水虽被 NaC1饱和,极性仍然很强,2-氨基苯并咪唑还有部分溶解在下层 NaC1饱和 溶液中。为提高了它的溶解度,使其更容易分配到有机相中。故同时加入 MgSO 为盐析 4 试剂。8 集美大学硕士专业学位论文 食品中苯并咪唑类农药残留的液相色谱-质谱/质谱法分析研究 120 多菌灵100 噻菌灵 麦穗宁 硫菌灵 80甲基硫菌灵 烯菌灵604020 0 丙酮 甲醇-HCl 甲醇 乙腈 乙酸乙酯提取溶剂图3.1 不同提取溶剂提取效 果3.3净化条件的选择 酸?碱液液分配法是提取多菌灵的经典方法。在酸性条件下用二氯甲烷脱去脂溶性杂 质,在碱性条件下用二氯甲烷萃出多菌灵。但 1990年 Gilvydis 通过酸碱液液分配发现甲 基硫菌灵在分析过程中会转变成多菌灵。因此液液分配样品净化方式费时、费试剂、步骤 烦杂、再加上甲基硫菌灵和硫菌灵易降解,不适合多菌灵,噻菌灵,硫菌灵、甲基硫菌灵、 麦穗宁、烯菌灵和多残留测定。 凝胶渗透色谱法对油脂含量高的动物源性样品的除油效果较好, 但对色素含量高的水 果和蔬菜等植物源性样品的除色素效果较差。 采固相萃取净化技术先后对中性氧化铝、硅胶、Florisil柱,C18,WatersMCX 小柱净 化效果进行了比较,结果表明虽然用中性氧化铝、硅胶、Florisil柱,C18小柱也能获得良 好的回收率。但杂质去除效果不理想,特别是大量脂溶性色素不能去除,杂质干扰测定。 多菌灵和噻菌灵在 MCX固相萃取柱上能获得良好的回收率,并能够有效的去除更多杂质, 但硫菌灵和甲基硫菌灵不能很好的保留,其回收率低。氨基活性碳复合小柱能有效去除色 素、有机酸和糖,净化效果好。但多菌灵在活性碳上吸附较其它物质强,需要较大体积的 洗脱液才能洗脱完全。 固相分散萃取净化技术(QUECHERS)是近年来国际上普遍采用的多残留检测前处理 技术。该方法的简便、样品和溶剂用量少等优点,已被广泛应用于蔬菜、水果和植物中农 药、杀虫剂的检测。牟仁祥等报道了采用 PSA分散固相萃取和离子对液相色谱测定蔬菜中 多菌灵、甲基硫菌灵、噻菌灵及其 2一氨基苯并咪唑。PSA吸附剂能有效去除样本中的脂 肪酸、极性色素、糖类物质等极性基质杂质,C18吸附剂能去部分脂肪和脂溶性杂质。不 同剂量的吸附剂提取效果见图 3.2。实验中对添加 PSA和 C18的量进行了优化,添加量少, 干扰大,回收大于 120%,严重影响准确定量。添加达到 600mg,回收率明显下降,应是 9 回收率(%)集美大学硕士专业学位论文 食品中苯并咪唑类农药残留的液相色谱-质谱/质谱法分析研究 过多的吸附剂把分析目标物都吸附了。结果发现 PSA添加 200 mg,C18添加 200 mg即可 达到净化效果,继续添加,样液无明显改善,不过对回收率影响也不大。故本方法中添加 PSA和 C18各 200mg。对于猪肝、核桃、菠菜、柑橘和茶叶的净化除了加入 C18 PSA和 外,有些杂质干扰仍然无法去除,需加入一定量的石墨化炭黑净化。石墨化炭黑吸附剂加 入量越多色素等杂质吸附的效果越好,但多菌灵和噻菌灵的回收率明显下降,其回收率小 于 60%,综合考虑,本实验选择石墨化炭黑用量为 10mg。 硫菌灵和甲基硫菌灵对热不稳定。特别是硫菌灵,实验中发现其纯标准溶液(1?g/mL) 在 30?下旋转蒸发仪器上旋干。硫菌灵几乎完全降解。因此样品的浓缩过程,是较关键的 一个步骤,经常会因为操作不当,导致回收率偏低。为了抑制甲基硫菌灵在分析过程中降 解,必须避免浓缩过干。因此本标准在提取液浓缩步骤中保留约 0.5mL乙腈提取液。可以 避免真空浓缩时过干导致的损失。同时处理好的样品溶液应尽快测定,并且避光保存,试 验中发现样品溶液放置过夜后,硫菌灵和甲基硫菌发生明显降解现象。因此, 在进行氮吹 时,温度应低于 30?。本实验设定氮吹仪水浴温度为 25?。 250多菌灵200 噻菌灵 麦穗宁硫菌灵 150 甲基硫菌灵烯菌灵100 50050mg 100mg 200mg 400mg 600mg不同剂量的吸附剂(PSA/C18mg图3.2 不同质量的吸附剂提取效果图 3.4测定条件的选择 3.4.1色谱柱的选择 ,比较 COSMOSIL 5C18-MS-II Waters 柱 常用的色谱柱为 C18液相色谱柱 2.1×150 mm, 5?m和 ZORBAX Eclipse XDB-C18柱,4.6×150 mm, 5?m两种色谱的分离情况,结果发现 内径小的柱子多菌灵,噻菌灵出峰时间太快,较难分离。因而采用内径大的 ZORBAX Eclipse XDB-C18柱。 10 回收率(%)集美大学硕士专业学位论文 食品中苯并咪唑类农药残留的液相色谱-质谱/质谱法分析研究 3.4.2流动相的选择 分别使用水-甲醇、5mmol 乙酸胺水溶液-乙腈、0.1%乙酸-乙腈、0.1%甲酸-乙腈做流 动相。实验中发现采用等度洗脱,噻菌灵和甲基硫菌灵很难分离。加人酸能够明显改善 2- 氨基苯并咪唑的峰形,使多菌灵和噻菌灵的出峰时间显著提前。但烯菌灵峰型较宽。而采 用 5mmol乙酸胺水溶液-乙腈做流动相,烯菌灵峰形明显改善,仪器灵敏度增加,所以本 实验方法采用 5mmol乙酸胺水溶液与乙腈梯度洗脱,流动相梯度洗脱程序同表 3.1。 表 3.1流动相梯度洗脱程序 时间 5mmol/L乙酸胺 乙腈 min % % 0 70 30 4 60 40 7 10 90 13 10 90 14 70 30 18 70 30 3.4.3质谱条件的选择 基于 LC-MS/MS的工作原理,母离子和子离子一一对应,选择强度高的一级碎片离子 作为母离子,在电离轰击下产生较强的二级碎片离子做为子离子,最终监测的子离子产生 最强响的碰撞能量为最终优化碰撞能量。扫描类型:多反应检测MRM;离子极性:正离 子(+);离子源 :电喷雾,Turbo Spray;通过以上数据分析,确定 MRM参数见表 3.2。 表 3.2苯并咪唑类农药的 MRM参数去簇电压 碰撞电压 碰撞室出室电压 Q1 Q3 待测物 m/z m/z DP(V) CE(V) CXP(V) 92.0 94 35 15 2-氨基苯并 134.3 咪唑 80.0 94 40 10 132.1 66 41 6 多菌灵 192.0 2* 66 28 7131.2* 88 49 7 160. 噻菌灵 202.4 175.4 88 34 15 92.0 104 41 13 麦穗宁 185.2 157.1 104 32 5 151.1* 26 25 6 甲基硫菌灵 343.0 192.1 26 21 7151.1* 84 26 8 硫菌灵 371.3 240.0 84 16 16 159.0* 70 31 6 297.0 烯菌灵 201.0 70 23 7 11 集美大学硕士专业学位论文 食品中苯并咪唑类农药残留的液相色谱- 质谱/质谱法分析研究 3.5线性关系 在标准方法所确定的实验条件下,取一系列不同浓度的苯并咪唑类农药标准溶液,以 仪器响应峰面积对苯并咪唑类农药的浓度进行线性回归,结果表明,当浓度在 1?g/mL~ 0.2?g/mL范围内时,线性关系良好,其相关系数见表 3.3。当样品中苯并咪唑类农药浓度 超过此线性范围时,可适当加大样品的稀释倍数。 表 3.3苯并咪唑类农药的线性方程与相关性 线性方程 相关系数r 农药名称 2-氨基苯并咪唑 Y1.87e4x-3.21e4 0.9994 Y1.17e4x-5.7e3 0.9997 多菌灵 Y1.42e4x-2.58e4 0.9992 噻菌灵 Y2.08e4+8.14e4 0.9991 麦穗宁 Y8.02e4+1.87e5 0.9997 甲基硫菌灵 Y3.01e4x+9.64e4 0.9995 硫菌灵 Y2.03e4+6.47e4 0.9997 烯菌灵 3.6方法的测定低限、回收率和精密度 3.6.1测定低限 测定低限是根据有关国家在大米、玉米、大豆、柑橘、苹果、葡萄、土豆、菠菜、猪 肉、鱼肉、牛奶、猪肝、和茶叶中对苯并咪唑类农药限量要求,而采用添加法进行实测的 情况确定的。根据残留检测要求,在要求色谱条件下,按信噪比的 3倍计算仪器的检出限 LOD,按信噪比的10倍计算方法的定量限LOQ。苯并咪唑类农药的测定低限 为 5 ?g/kg, 各种基质的标准品谱图、测定低限谱图和基质的空白谱图参见(图 3.3~3.14 。可满足国 外限量和《基本规定》要求。国内标准有 GB/T 5009.188?2003《蔬菜水果中甲基托布津、 多菌灵的测定》,采用液液萃取一紫外分光光度计法,方法操作和数据处理较为复杂,灵敏 度低;SN/T 0220?93《出口水果中多菌灵残留量检验方法》,采用的是连续的液一液分配 法,检测限为 0.7 mg/kg。SN/T 0606-1996《出口乳及乳制品中噻菌灵残留量检验方法一荧光 分光光度法》,采用连续的液一液分配法, 检测限为 0.02mg/kg;SN/T 0520-1996《出口粮 谷中烯菌灵残留量检验方法》,采用连续的液一液分配法,检测限为 0.025mg/kg;SN/T 1753-2006《进出口浓缩果汁中噻菌灵、多菌灵残留量检测方法高效液相色谱法》,检测限 分别为 0.02mg/kg。综合分析,本研究建立的测定低限优于当前的国家标准或行业标准, 有很好的应用推广前景。 12 集美大学硕士专业学位论文 食品中苯并咪唑类农药残留的液相色谱-质谱/质谱法分析研究 3.6.2方法的回收率和精密度 3.6.2.1 苹果中 6种苯并咪唑类农药添加回收试验 采用标准添加法,在苹果基质中分别添加 0.005、0.01、0.025 mg/kg的多 菌灵,噻菌 灵,麦穗宁、硫菌灵、甲基硫菌灵、烯菌灵农药混标,进行添加回收实验,每种农药每次 加标水平平行测定 6次,回收数据见表 3.4。实验结果表明,方法的总体平均回收率范围 为 81.4%~97.6%,方法的变异系数为 1.6%~7.4%,满足国内外对残留分析的要求。 0.005mg/kg添加水平的苯并咪唑类农药在苹果基质中的加标回收及空白谱图见图 3.3。 图 3.3空白(左)与加标(右)苹果样品的重构离子色谱图 13 集美大学硕士专业学位论文 食品中苯并咪唑类农药残留的液相色谱-质谱/质谱法分析研究 表 3.4苹果样品添加回收及精密度 添加多菌灵 噻菌灵 麦穗宁 硫菌灵 甲基硫菌灵 烯菌灵 浓度 ?g/kg 1 4.68 4.86 4.12 4.03 4.00 4.74 2 5.09 4.52 4.26 4.32 4.41 4.76 3 5.02 4.23 4.33 3.89 4.23 4.60 4 4.49 4.75 3.99 4.80 4.15 4.33 5 4.82 4.96 4.62 4.15 4.46 4.89 5.0 6 4.80 4.42 4.75 4.32 4.20 4.43 平均值 4.82 4.62 4.35 4.25 4.24 4.625 平均回收率% 96.3 92.5 86.9 85.0 84.8 92.5 0.220 0.280 0.291 0.316 0.170 0.213 标准偏差 变异系数% 4.6 6.1 6.7 7.4 4.0 4.6 1 10.60 9.87 10.62 7.89 7.98 8.62 2 9.88 9.32 10.10 8.86 7.77 8.65 3 9.73 9.38 9.70 9.31 7.79 8.77 4 8.91 9.75 9.62 7.73 8.42 9.5 5 9.55 9.40 9.67 8.82 8.55 8.84 10.0 6 8.86 9.38 9.24 8.93 8.34 8.92 平均值 9.59 9.52 9.82 0.859 8.14 8.88 平均回收率% 95.9 95.2 98.2 85.9 81.4 88.8 标准偏差 0.652 0.232 0.476 0.631 0.338 0.323 变异系数% 6.8 2.4 4.8 7.3 4.2 3.6 1 21.70 24.40 22.20 19.60 23.80 24.9 2 24.76 24.63 23.04 21.22 21.90 23.88 3 24.85 24.31 23.09 23.45 23.94 22.2 4 23.92 25.01 22.87 22.76 23.05 23.21 25.0 5 24.53 24.11 23.69 23.44 21.61 24.47 6 24.54 23.89 24.15 23.66 21.56 23.21 平均值 24.05 24.39 23.17 22.35 22.64 23.65 平均回收率% 96.2 97.6 92.7 89.4 90.6 94.6 标准偏差 1.196 0.394 0.676 1.620 1.093 0.977变异系数% 5.0 1.6 2.9 7.2 4.8 4.114 集美大学硕士专业学位论文 食品中苯并咪唑类农药残留的液相色谱-质谱/质谱法分析研究 3.6.2.2牛奶中 6种苯并咪唑类农药添加回收试验 0.005、0.01、0.025 mg/kg的多采用标准添加法,在牛奶基质中分别添加 菌灵,噻菌 ,麦穗宁、硫菌灵、甲基硫菌灵、烯菌灵农药混标,进行添加回收实验,每灵 种农药每次 加标水平平行测定 6次,回收数据见表 3.5。实验结果表明,方法的总体平均回收率范围 为 61.6%~94.6%,方法的总体变异系数为 0.6%~9.7%,满足国内外对残留分析的要求。 0.005mg/kg添加水平的苯并咪唑类农药在牛奶基质中的加标回收及空白谱图见图 3.4。图 3.4空白(左)与加标(右)牛奶样品的重构离子色谱图 15 集美大学硕士专业学位论文 食品中苯并咪唑类农药残留的液相色谱-质谱/质谱法分析研究 表 3.5 牛奶样品添加回收及精密度 添加多菌灵 噻菌灵 麦穗宁 硫菌灵 甲基硫菌灵 烯菌灵 浓度 ?g/kg 1 4.12 3.72 3.87 3.15 3.06 3.73 2 4.87 4.28 3.80 3.27 3.56 3.87 3 4.14 4.16 3.86 3.05 3.62 3.90 4 4.11 4.78 3.78 3.28 3.75 3.88 5 4.42 4.75 4.18 2.85 3.74 3.96 5.0 6 4.25 4.74 4.09 2.89 3.82 3.79 平均值 4.318 4.405 3.93 3.082 3.592 3.855 平均回收率% 86.4 88.1 78.6 61.6 71.8 77.1 0.295 0.428 0.165 0.185 0.277 0.082 标准偏差 变异系数% 6.8 9.7 4.2 6.0 7.7 2.1 1 8.87 9.30 8.08 6.30 7.12 8.54 2 8.97 9.05 8.07 6.90 6.98 8.18 3 9.19 9.06 8.12 6.98 7.15 8.55 4 9.26 9.32 8.15 7.12 7.18 8.67 5 9.01 9.01 8.19 6.65 7.04 8.38 10.0 6 9.08 9.11 8.07 7.08 7.10 8.69 平均值 9.063 9.142 8.113 6.838 7.095 8.501 平均回收率% 90.6 91.4 81.1 68.4 71.0 85.0 标准偏差 0.144 0.134 0.049 0.312 0.0736 0.193 变异系数% 1.6 1.5 0.6 4.6 1.0 2.3 1 23.23 23.17 20.30 17.90 18.14 23.68 2 23.41 22.50 20.83 17.86 17.90 23.90 3 23.56 22.51 20.86 17.56 18.42 23.93 4 23.48 22.62 20.72 17.75 18.51 23.94 25.0 5 24.04 22.77 21.23 17.88 18.44 22.89 6 24.27 23.14 21.01 18.11 17.96 22.86 平均值 23.665 22.785 20.825 17.84 18.228 23.53 平均回收率% 94.6 91.1 83.3 71.4 72.9 94.1 标准偏差 0.402 0.303 0.3118 0.182 0.264 0.519变异系数% 1.7 1.3 1.5 1.0 1.4 2.2 16 集美大学硕士专业学位论文 食品中苯并咪唑类农药残留的液相色谱- 质谱/质谱法分析研究 3.6.2.3猪肉中 6种苯并咪唑类农药添加回收试验采用标准添加法,在猪肉 0.01、0.025 mg/kg的多菌灵,噻菌 基质中分别添加 0.005、 灵,麦穗宁、硫菌灵、甲基硫菌灵、烯菌灵农药混标,进行添加回收实验,每种农药每次 加标水平平行测定 6次,回收数据见表 3.6。实验结果表明,方法的总体平均回收率范围 为 72.2%~94.6%,方法的变异系数为 2.6%~10%,满足国内外对残留分析的要求。 0.005mg/kg添加水平的苯并咪唑类农药在猪肉基质中的加标回收及空白谱图见图 3.5。图 3.5空白(左)与加标(右)猪肉样品的重构离子色谱图 17 集美大学硕士专业学位论文 食品中苯并咪唑类农药残留的液相色谱-质谱/质谱法分析研究 表 3.6 猪肉样品添加回收及精密度 添加多菌灵 噻菌灵 麦穗宁 硫菌灵 甲基硫菌灵 烯菌灵 浓度 ?g/kg 1 4.13 3.70 4.34 3.83 3.84 4.36 2 3.94 3.98 4.23 3.47 3.96 4.91 3 4.09 4.11 4.12 4.02 3.64 3.95 4 4.78 3.44 3.45 3.68 3.45 3.79 5 4.23 4.55 4.56 3.88 3.24 4.21 5.0 6 4.35 4.31 3.98 3.45 3.52 3.89 平均值 4.25 4.02 4.11 3.72 3.61 4.19 % 85.1 80.3 82.3 74.4 72.2 80.5 平均回收率 标准偏差 0.292 0.403 0.380 0.230 0.263 0.414 % 6.9 10.0 9.2 6.2 7.3 9.9 变异系数 1 9.17 8.47 8.37 6.85 7.30 9.72 2 9.9 9.50 8.99 7.58 7.85 9.61 3 9.17 9.27 9.35 6.49 7.56 9.52 4 9.26 8.89 8.93 7.85 7.86 8.96 5 9.66 9.43 9.50 7.79 7.32 9.48 10.0 6 9.34 9.51 9.39 7.92 7.44 8.84 平均值 9.42