原生质体制备及转化
1.去皮的日本晴种子在75%的酒精中消毒1 min。然后用2.5%的次氯酸钠消毒20 min。用无菌水洗至少5次，然后在1/2 MS培养基上，12 h光照（大约150umol m-1 s-1）十二小时黑暗，26 ℃培养7-10天，提前一天烧好去尖的黄蓝枪头备用。
2.取40-60棵水稻幼苗的茎和叶鞘的绿色组织。
3.将一捆水稻植株（大概10棵幼苗）用剃刀一起切成大约0.5 mm的小段。
4.将小片段立刻放进0.6 M的甘露醇中，黑暗中放置10 min。
5.用100目钢制滤网去掉甘露醇，将小片段放在加入15mL酶液的25mL锥形瓶中，（1.5% Cellulase RS，0.75% Macerozyme R-10，0.6 M甘露醇，pH5.7的10mM MES，10mM CaCl2，0.1% BSA），28℃摇床中轻轻摇晃（50rpm），黑暗孵育4-6 h。
6.此时配置40%的PEG4000，酶消化后，分三次加入等体积15mL的W5溶液（154 mM NaCl，125mM CaCl2,5 mM KCl，pH 5.7的2mM MES）。用手充分摇晃10s。
7.用400目钢制滤网过滤得到原生质体在圆底管中。
8.80g离心（升降速度设为1档）5min，缓慢吸走上清液。
9.沿壁缓慢加入4mL W5溶液，轻轻悬浮，再离心80g，5min，弃上清
10.沿壁缓慢加入4mL Mmg溶液，离心80g，5min，弃上清
11.再加Mmg溶液，补至每个样品100μl 原生质体
12.分装2 mL离心管，每100μl 原生质体，加入20μl质粒和120μl新鲜制备的40%的PEG4000，混匀
13.28℃避光静置转化20--25min
14.加1.5 mL W5溶液混匀，80g离心3min，弃上清。
15.重复步骤14
16.加2mL W5溶液重悬，轻轻混匀，移到细胞培养板，锡箔纸包裹避光28℃避光静置培养15-20小时
17.培养完成后，将培养板中沉淀的原生质体轻轻混匀，吸到2 mL离心管中，80g离心3min，弃上清，保留100μl上清液
18.共聚焦显微镜观察拍照
配制溶液方法：
I：配成母液
试剂名称
MW
母液浓度
质量
配制体积
甘露醇（D-Mannitol）
182.17
0.6 M
54.651g
500mL
CaCl2
110.98
1 M
5.51g
50mL
BSA
2%
0.4g
20mL
KCl
74.55
0.1 M
0.373g
50mL
MES pH5.7
195.24
0.1 M
0.98g
50mL
MgCl2·6H2O
203.3
0.1M
1.017g
50mL
PEG4000
现配(W/V)
酶液
试剂
10mL
30mL
终浓度
Cellulase RS
0.15g
0.45g
1.5%
Macerozyme R-10
0.075g
0.225g
0.75%
D-Mannitol
7.5mL
22.5mL
0.6M
MES
1mL
3mL
10mM
CaCl2
0.1mL
0.3mL
10mM
BSA(2%)
0.5mL
1.5mL
0.1%
加ddH2O补足
10mL(~0.9mL)
30mL(~2.7mL)
W5溶液
试剂
60mL
100mL
终浓度
NaCl
0.54g
0.9g
0.9%
CaCl2
0.8325g
12.5mL
125mM
KCl
3mL
5mL
5mM
MES
1.2mL
2mL
2mM
加ddH2O补足
60mL(~52.5mL)
100mL(~85mL)
MMG溶液
试剂
5mL
50mL
终浓度
D-Mannitol
2.5mL
25mL
0.4M
MgCl2
0.75mL
7.5mL
15mM
MES
0.2mL
2mL
4mM
加ddH2O补足
5mL(~1.55mL)
50mL(~15.5mL)
PEG(5mL)
试剂
5mL
10mL
终浓度
PEG4000
2g
4g
40%(W/V)
D-Mannitol
1.25mL
2.5mL
0.2M
CaCl2
0.5mL
1mL
0.1M
加ddH2O补足
5ml(~1.25mL)
10mL(~2.5mL)
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