微生物检验指导

PAGE 1 微生物实验室操作指导书目录 （一）安全 守则 员工守则公司员工守则企业员工守则办公室安全用电规定加油站员工保密守则 （二）检验总则 （三）基本技术要求 （四）食品平板菌落计数 （五）食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 （六）沙门氏菌检验 （七）金黄色葡萄球菌检验 （八）霉菌计数 （九）革兰氏染色 （十）空气中微生物的检验 （十一） 水中微生物的检验 （十二）食品接触面的微生物检验 （一）安全守则 1 进入实验室工作衣、帽、鞋必须穿戴整齐。 2 在进行高压、干燥、消毒等工作时，工作人员不得擅自离开现场，认真观察温度、时间，蒸馏易挥发、易燃液体时，不准直接加热，应置水浴锅上进行。 3 严禁用口直接吸取药品和菌液，按无菌操作进行，如发生菌液、病原体溅出容器外时，应立即用有效消毒剂进行彻底消毒，安全处理后方能离开现场。 4 工作完毕，两手用清水肥皂洗净，必要时可用（杀菌剂）新洁尔灭、过氧乙酸液浸泡手，然后用水冲洗，工作服应经常清洗，保持整洁，必要时高压消毒。 5 实验完毕，及时清理现场和实验用具，对染菌带毒物品，进行消毒灭菌处理，并填写日常工作记录。 6 每日下班，认真检查水、相关电源是否关闭和正在使用的设备运转是否正常，并认真记录。下班前关好门窗，方可离去。 （二）检验总则 1 主题内容与适用范围　 本文规定了微生物检验一般规则。 本文适用于食品中微生物学检验的采样、检验及结果 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 。 2 样品的采集 2.1 采样目的 确保采集的样品能代表全部被检验的物质，使检验 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 更具代表性。 2.2 采样原则 2.2.1 采集的样品要有代表性，采样时应首先对该批食品原料、加工、运输、贮藏方法条件、周围环境卫生状况等进行详细调查，检查是否有污染源存在，同时能反映全部被检食品的组成、质量和卫生状况。 2.2.2 应设法保持样品原有微生物状况，在进行检验前不得污染，不发生变化。 2.2.3 采样必须遵循无菌操作程，容器必须灭菌，避免环境中微生物污染，容器不得使用煤酚皂溶液，新洁尔灭、酒精等消毒物灭菌，更不能含有此类消毒药物，以避免杀掉样品中的微生物，所用剪、刀、匙用具也需灭菌方可使用。 2.3 采样数量 取样数量的确定，应考虑分析项目的要求、分析方法的要求及被检物的均匀程度三个因素。样品应一式三份，分别供检验、复检及备查使用，每份样品数量一般不少于200g。 根据不同种类采样数量略有不同，实验室检验样品一般为25克。 2.4 采样方法 2.4.1 采取随机抽样的方式。 2.4.2 直接食用的小包装食品，尽可能取原包装，直到检验前不要开封，以防污染。 2.4.3 如为非冷藏易腐食品，应迅速将所采样品冷却至0－4℃。 2.4.4 不要使样品过度潮湿，以防食品中固有的细菌增殖。 2.4.5 在将冷冻食品送到实验室前，要始终保持样品处于冷冻状态。样品一旦融化，不可使其再冻，保持冷却即可。 2.5 样品的保存和运送 2.5.1 样品采集完后，应迅速送往实验室检验，送检过程中一般不超过3h，如路程较远，可保存在1－5℃环境中，如需冷冻者，则在冷冻状态下送检。 2.5.2 冷冻样品应存放在－15℃以下冰箱内；冷却和易腐食品应存放在0－5℃冰箱或冷却库内；其它食品可放在常温冷暗处。 2.5.3 运送冷冻和易腐食品应在包装容器内加适量的冷却剂或冷冻剂。保证途中样品不升温或不融化。 2.5.4 待检样品存放时间一般不应超过36小时。 3 检验样品的制备 3.1 样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。 3.2 检验冷冻样品前应先使其融化。可在0－4℃融化，时间不超过18小时，也可在温度不超过45℃的环境中融化，时间不超过15分钟。 3.3 检验液体或半固体样品前应先将其充分摇匀。如容器已装满，可迅速翻转25次；如未装满，可于7s内以30cm的幅度摇动25次。从混样到检验间隔时间不应超过3分钟。 3.4 开启样品包装前，先将表面擦干净，然后用75％乙醇消毒开启部位及其周围。 3.5 非粘性液体样品可用吸管吸取一定量，然后加入适量的稀释液或培养基内，吸管插入样品内的深度不应超过2.5cm,也不得将吸有样品的吸管浸入稀释液或培养基内。 3.6 粘性液体样品可用灭菌容器称取一定量，然后加入适量的稀释液或培养基。 3.7 固体或半固体样品可用灭菌的均质杯称取一定量，再加适量的稀释液或培养基进行均质，从样品的均质到稀释和接种，相隔时间不应超过15分钟。 4 检验 4.1 实验室收到样品后，首先进行外观检验，及时按照国家 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 检验方法进行检验，检验过程中要认真、负责，严格进行无菌操作，避免环境中微生物污染。 4.2 检验所使用的稀释液、试剂、培养基接触的一切器皿必须经过有效的灭菌。 4.3 实验室所用仪器、设备的性能应定期检查和校正。 4.4 制备试剂和培养基所用的水，应为无离子水或用玻璃器皿蒸馏的蒸馏水。 4.5 检验结束后，所有带菌的培养基、试剂、稀释液和器皿必须尽快灭菌和洗刷。清洗过的器皿不应残留洗涤剂的痕迹。 5 检验记录和结果的报告 5.1 经检验的每份样品都应有完整的检验记录。样品检验过程中所用方法、出现的现象和结果等均要用文字写出试验记录，以作为对结果分析、判定的依据，记录要求详细、清楚、真实、客观、不得涂改和伪造。 5.2 检验结束后，根据检验结果，及时填写检验报告书，签字并经负责人审核签字后发出。 （三）基本技术要求 1 无菌操作要求 微生物实验室工作人员，必须有严格的无菌观念，许多实验要求在无菌的条件下进行，主要原因，一是防止试验操作中人为污染样品，二是保证工作人员安全，防止检出的致病菌由于操作不当造成个人污染。要求如下： 1.1 接种细菌时必须穿工作服、带工作帽； 1.2 进行接种食品样品时，必须穿专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用； 1.3 接种食品样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用酒精棉球将手擦干净； 1.4 进行接种所用的吸管、平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用酒精点燃烧灼三次后使用； 1.5 从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及试管或平皿边； 1.6 接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌活样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒； 1.7 接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到针和环与杆的连接处，接种结核菌和烈性菌的接种环应在沸水中煮沸5min,再经火焰烧灼； 1.8 吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。 2 无菌间使用要求 2.1 无菌间应密封，不得随意打开，并设有与无菌间大小相应的缓冲间及门，另尽量设有的小窗，以备进入无菌间后传递物品。 2.2 无菌间应保持清洁，工作后用煤酚皂液溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放与试验无关的物品。 2.3 无菌间使用前后应将门关紧，打开紫外灯，如采用室内悬掉紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离工作台1m处，照射时间不少于30分钟，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精球轻轻擦拭，除去上面的灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响。 2.4 处理和接种食品标本时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。 2.5 在无菌间需用安装空调时，则应有过滤装置。 3 消毒灭菌要求 微生物检测用的玻璃器皿、金属用具及培养基、被污染和接种的培养物等，必须经灭菌后方能使用。 3.1 灭菌前准备 3.1.1 所有需经灭菌的物品首先要清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用纸包装严密，如用金属筒应将上面气孔打开。 3.1.2 装培养基的三角瓶塞好棉塞，用纸包好，试管盖好盖，注射器须将管芯抽出，用纱布包好。 3.2 装放 3.2.1 大型高压蒸气锅：放置灭菌物品不应超过锅内容积的80%，物品应放置锅内搁架上或铁丝筐中。 3.2.2 手提式高压锅：将物品分别包扎好，直接放入消毒筒内，物品之间不能过挤。 3.3 设备检查 3.3.1 检查门的开关是否灵活，橡皮圈有无损坏，是否平整。 3.3.2 压力表蒸气排尽时是否停留在零位，关好门和盖，通蒸气或加热后，观察是否漏气，压力表与温度计所标示的状况是否吻合，管道有无堵塞。 3.3.3 对有自动电子程序控制装置的灭菌器，使用前应检查规定的程序，是否符合于进行灭菌处理的要求。 3.4 灭菌处理 手提式高压锅或立式压力蒸气灭菌器的使用应按下列步骤进行： 3.4.1 手提式高压锅在主体内加入3L清水，立式高压锅加水16L（重复使用时应将水量补足，水变混浊需要更换）。 3.4.2 手提式压力锅将顶盖上的排气管插入消毒桶内壁的方管中（无软管或软管锈蚀破裂的灭菌器不得使用）。 3.4.3 盖好顶盖拧紧，勿使漏气；置灭菌器于火源上加热，立式压力锅通上电源，并打开顶盖上的排气阀放出冷气（水沸腾后排气10～15min）。 3.4.4 关闭排气阀，使蒸气压上升到规定要求，并维持规定时间（按灭菌物品性质与有关情况而定）。 3.4.5 达到规定时间后，对需干燥的物品，立即打开排气阀排出蒸汽，待压力恢复到零时，自然冷却至60℃后开盖取物，如为液体物品，不要打开排气阀，而应立即将锅去除热源，待自然冷却，压力恢复至零，温度降到60℃以下再打开盖取物，以防止突然减压液体剧烈沸腾活容器爆破。 3.5 灭菌温度与时间 3.5.1 压力蒸气灭菌锅灭菌温度与时间见下表： 物 品 灭菌时间，min 115℃ 121℃ 不含糖等耐热培养基 15 含糖类等耐热培养基 15～20 染菌培养物 30 器械器皿 30 3.6 灭菌处理：灭菌后物品，按正常情况已属无菌，从灭菌器中取出应仔细检查，以免再度污染。 3.6.1 物品取出，随即检查包装的完整性，若有破坏或棉塞脱掉，不可作为无菌物品使用。 3.6.2 取出的物品，如为包装有明显的水浸者，不可作为无菌物品使用。 3.6.3 培养基或试剂等，应检查是否符合达到灭菌后的色泽或状态，未达到者应废弃。 3.6.4 取出的物品掉落在地或误放不洁之处，或沾有水液，均视为受到污染，不可作为无菌物品使用。 3.6.5 取出的合格灭菌物品，应存放于贮藏室或防尘柜内，严禁与未灭菌物品混放。 3.6.6 凡属合格物品，应标有灭菌日期及有效期限。 3.6.7 每批灭菌处理完成后，记录灭菌品名、数量、温度、时间、操作者。 4 有毒有菌污物处理要求 微生物实验室所用实验器材、培养物等未经消毒处理，一律不得带出实验室。 4.1 经培养的污染材料及废弃物应放在严密的容器或铁丝筐内，并集中存放在指定地点，待统一进行高压灭菌。 4.2 经微生物污染的培养物，必须经121℃，30min高压灭菌。 4.3 染菌后的吸管，使用后放入5%煤酚皂溶液或石炭酸溶液中，最少浸泡24小时，再经121℃，30min高压灭菌。 4.4 涂片染色冲洗片的液体，一般可直接冲入下水道，染色的玻片放入5%煤酚皂液中浸泡24h后，煮沸洗涤。做凝集试验用的玻片或平皿，必须经高压灭菌后洗涤。 4.5 打碎的培养物，立即用5%煤酚皂液或石炭酸喷洒和浸泡被污染部位，浸泡半小时后再擦拭干净。 4.6 污染的工作服或进行烈性菌试验所穿的工作服、帽、口罩等，应放入专用消毒袋内，经高压灭菌后方能洗涤。 5 玻璃器皿的清洗要求 5.1 目的 为了保证微生物实验顺利进行，保证实验结果的准确性，不影响实验进度，必须把器皿彻底清洗干净。 5.2 注意事项 5.2.1 任何洗涤方法，都不应对玻璃器皿有所损伤，不能用有腐蚀作用的化学药剂，也不能使用比玻璃器皿硬度大的物品来擦拭玻璃器皿。 5.2.2 一般新的玻璃器皿用2%的盐酸液浸泡数小时，后用水冲洗干净。 5.2.3 用过的器皿应立即洗涤，放置太久会增加洗涤困难。 5.2.4 强酸、强碱及其它氧化物和有挥发性的有毒物品，都不能倒在洗涤槽内，以免污染环境水质，必须倒在废水缸中。 5.2.5 含有对人体有传染性病菌的器具，应先煮沸灭菌后再进行洗涤。 5.2.6 难洗涤的器皿不要与易洗涤的器皿放在一起，以免增加洗涤的麻烦。有油的器皿不要与无油的器皿混在一起，否则使本来无油的器皿沾上了油垢，浪费药剂和时间。 5.3 洗涤剂的种类：水、洗衣粉、柠檬洗涤剂、肥皂 5.4 洗涤方法 5.4.1 含有琼脂培养基的玻璃器皿的洗涤方法：事先应将器皿中的琼脂刮去，然后用清水洗涤，并用试管刷刷其瓶壁，以除去粘污在壁上的灰尘和油垢。用洗衣粉水洗去油污，然后用自来水冲洗。洗好后的器皿应倒置晾干或置于干燥箱中干燥至无水滴。 5.4.2 载玻片及盖玻片的洗涤法：新载玻片及盖玻片先在20%的盐酸溶液中浸一小时，然后用自来水冲洗2~3次，最后用蒸馏水换洗2~3次。用过的载玻片及盖玻片，应用纸擦去油垢，再放在5%的洗衣粉水中煮30分钟后立即用自来水冲洗，然后放在稀的洗液中浸泡2小时，再用自来水冲洗至中性。 5.4.3 移液管、倒管的洗涤方法：新的移液管及倒管先在的５％盐酸溶液中浸一小时，然后用自来水冲洗几次，最后用蒸馏水换洗几次。用过的移液管、倒管先用自来水洗去表面的残液，再放在洗衣粉水中浸泡一小时以上，再用自来水冲洗至管内壁无残渣，最后用蒸馏水换洗次，晾干后入恒温干燥箱中烘干。 6 培养基、无菌水的制备 6.1 基本原理 培养基的种类很多，不同微生物所需要的培养基不同。培养基制成后的物理状态可分为液体、固体、半固体三种类型。目前所用培养基均为已配制好的生物试剂和纸片。 6.2 器材 三角瓶、试管、烧杯、玻棒、天平、搪瓷杯、量筒、铝箔纸、角匙、杜氏小管、硅胶塞、电炉 6.3 培养基的种类 营养琼脂培养基、乳糖胆盐发酵培养基、乳糖发酵培养基、伊红美兰琼脂培养基、马铃薯-葡萄糖琼脂培养基(附加抗菌素)、平板计数琼脂、月桂基硫酸盐胰蛋白冻肉汤、煌绿乳糖胆盐肉汤、EC肉汤、高盐察氏琼脂、三糖铁琼脂等 6.4 方法步骤 6.4.1 培养基的制备： 6.4.2 称量：根据培养基的配方，称取适量药品于搪瓷杯中； 6.4.3 溶解：用量筒量取所需水量，置电炉上加热，一边搅拌，至完全溶解，加热至沸腾，拔掉电源，待冷却； 6.4.4 分装：根据不同需要，立即趁热分装入三角瓶或试管中，分装三角瓶以不超过三角瓶一半为宜，分装试管一般为管长的1/5（需根据试管的大小而定）。液体培养基如乳糖胆盐发酵培养基约分装10毫升左右。 6.4.5 塞硅胶塞：装好培养基的试管应塞上硅胶塞，松紧合适，紧贴管壁，不留缝隙，约1/2塞入内，这样即可过滤空气，避免杂菌侵入，又可减缓培养基水分的蒸发。 6.4.6 包装：三角瓶棉塞头部应用锡箔纸包扎，试管集中于试管篓。 6.5 无菌水的制备： 6.5.1 用10ml移液管量取9.2ml蒸馏水（稀释水）装入试管中。 6.5.2 用100ml量筒量取95ml蒸馏水（稀释水）装入150ml的三角瓶中。可置少许玻璃珠于三角瓶内，防止暴沸。 6.5.3 量取240ml蒸馏水（稀释水）于250ml的三角瓶中，塞上瓶塞用牛皮纸包扎好，高压灭菌备用。 7 设备使用原则 7.1 实验设备的使用由实验员严格按照操作说明书进行，其他人员不得随意操作。 7.2 实验设备的日常维护保养由实验员根据设备操作说明书进行，出现不可排除的故障时，经部门总经理批准，商请专业人员维修。 7.3 实验设备应定期进行计量检测，确保仪器的准确性。 7.4 实验员应爱护仪器设备，使用前应检查，使用后应及时清理清洁，并定期维护保养，下班前应检查设备电源是否关闭。 （四）食品平板菌落计数 1 主题内容与适用范围 本文规定了食品平板菌落计数的方法。 本文适用于航空配餐的各种半成品、成品及原料，有专门规定的检验方法的除外。 2 设备和材料 超净工作台、恒温培养箱（36±1℃）、均质器、振荡器、吸管（1ml、10ml）、平皿、稀释瓶、天平等 3 培养基和试剂 平板计数琼脂、75％乙醇、磷酸盐缓冲稀释液 4 操作程序 4.1 样品制备 4.1.1 以无菌操作取有代表性的样品盛于灭菌容器内。如有包装，则用75％乙醇在包装开口处擦拭后取样。 4.1.2 制备样品匀液 以无菌操作取25g样品，放入装有225ml稀释剂的灭菌均质杯内，于8000r/min均质1-2min，制成1：10的样品匀液。如样品均质时间超过2min，应在均质杯外加冰水冷却。 4.2 稀释样品匀液 4.2.1 用10ml灭菌吸管准确吸取1：10的样品匀液10ml，放入装有90ml稀释剂的150ml 稀释瓶中。迅速振摇，将样品混匀，制成1：100的样品匀液。振摇时，幅度为30cm，7s内振摇25次。从容器中吸取样品匀液和以后的稀释操作中，吸管尖不要碰着瓶口。吸入的液体应先高于所要求的刻度，然后提起吸管使其尖端离开液面并贴在容器内壁将液体调至所要求的刻度。 4.3 平板接种 4.3.1 对于每个样品，选用合适的三个连续稀释度的样品液进行平板计数。 4.3.2 分别用灭菌吸管吸取1ml样品液放入作了适宜标志的平皿内。每个稀释度的样品液用两个平皿。 4.3.3 分别加12-15ml平板计数琼脂（约45℃左右）到平皿内。立即将平皿内的样品液和琼脂培养基充分混合。要防止把混合物溅到平皿壁和盖上。同时将平板计数琼脂倾入加有1ml稀释剂的另一灭菌平皿作空白对照。将样品液加入平皿后应立即倾注琼脂培养基，每个样品从开始稀释到倾注最后一个平皿所用的时间不得超过20min。 4.4 培养 待琼脂凝固后将平皿翻转，立即放进36±1℃的恒温培养箱培养48±2h。培养箱应保持一定的湿度，经48h培养的琼脂培养基的失重不得超过15％。 4.5 菌落计数和记录 4.5.1 培养后，立即计数每个平板上的菌落数。25-250个菌落为合适范围。如不能立即计数，应将平板存放于0-4℃，但不得超过24h。 4.5.2 操作者对同一平板复核自己的计数结果，其差异应在5％之内，而其他人对这一平板重复计数，其差异应在10％这内。否则，应找出原因，加以校正。 4.6 计算和记录数字 适宜稀释度的两个平板的菌落数平均值或两个稀释度的平板菌落数平均值乘以相应稀释度倍数计算出每克（毫升）样品中平板菌落数。 记录时，只有在换算到每克（毫升）样品中平板菌落数时，才能定下两位有效数字，第三位数字采用四舍五入的方法记录。也可将样品的平板菌落数记录为10的指数形式。 5 结果报告 报告每克（毫升）样品中平板菌落数或估计的平板菌落数。 注：本文参照SN0168-92《出口食品平板计数》 （五）食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法 1 主题内容与适用范围 本文规定了食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法。 本文适用于航空食品的检验。 2 设备和材料 吸管（1ml、10ml）、恒温培养箱（36±1℃、44.5±0.5℃）、冰箱、均质器、振荡器、平皿、稀释瓶、天平、显微镜等 3 培养基和试剂 月桂基硫酸盐胰蛋白月示（LST）肉汤、煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤、EC肉汤、伊红美蓝琼脂（EMB）、营养琼脂斜面、色氨酸肉汤、MR-PV培养基、Korser氏枸掾酸盐肉汤、结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）、Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液、生理盐水、革兰氏染色液、Kovacs氏靛基质试剂、甲基红指示剂、Voges-pros kauer（V-P）试剂、 4 样品制备 4.1 以无菌操作取有代表性的样品盛于灭菌容器内。如有包装，则用75％乙醇在包装开口处擦拭后取样。 4.2 制备样品匀液 以无菌操作取25g样品，放入装有225ml稀释剂的灭菌均质杯内，于8000r/min均质1-2min，制成1：10的样品匀液。如样品均质时间超过2min，应在均质杯外加冰水冷却。 4.3 稀释样品匀液 用10ml灭菌吸管准确吸取1：10的样品匀液10ml，放入装有90ml稀释剂的150ml 稀释瓶中。迅速振摇，将样品混匀，制成1：100的样品匀液。 5 大肠菌群的测定 5.1 大肠菌群MPN值的测定 5.1.1 对每个样品，选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白月示（LST）肉汤，每管接种1ml。 5.1.2 将接种管置于36±1℃的培养48±2h。 5.1.3 观察试管的产气情况：检查倒管内是否有气泡产生，记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。如所有LST肉汤管均未产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则进一步作证实试验。 5.2 大肠菌群的证实试验 5.2.1 将所有产气管用直径为3mm的接种环移种到煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中。 5.2.2 置BGLB肉汤管于36±1℃的培养48±2h。 5.2.3 记录所有BGLB肉汤管的产气管数。 5.2.4 结果报告：按BGLB肉汤产气管数，查MPN表报告每克（毫升）样品中大肠菌群的MPN值。 6 粪大肠菌群测定 6.1 用接种环将所有48±2h内产气的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤管中。 6.2 将所有接种的EC肉汤管在30min内放入44.5±0.5℃水浴箱内，培养24±2h。水浴箱的水平面应高于肉汤培养基液面。应以已知为44.5℃产气阳性的大肠杆菌和44.5℃不产气的产气肠杆菌或其他大肠菌群细菌作阳性和阴性对照。 6.3 记录EC肉汤管的产气情况。产气管为粪大肠菌群试验阳性；不产气管为粪大肠菌群试验阴性。 6.4 结果报告：按产气管数，查MPN表报告每克（毫升）样品中粪大肠菌群的MPN值。 7 大肠杆菌测定 7.1 将6.3条中的EC肉汤管继续培养24h取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝（EMB）平板，36±1℃的培养24±2h。 7.2 检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。 7.3 如有典型菌落，则从每个平板上至少挑取2个典型菌落；如无典型菌落，则从每个平板上至少挑取2个可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位，移种到营养琼脂斜面上，36±1℃的培养18-24h。 7.4 将斜面培养物移种到下列培养基进行生化试验。 7.4.1 色氨酸肉汤：在36±1℃的培养24±2h后，加Kovacs氏试剂0.2-0.3ml，上层出现红色为靛基质阳性反应。 7.4.2 MR-VP培养基：在36±1℃的培养48±2h后。以无菌操作移取培养物1ml至13mm*100mm试管中，加5％α-萘酚乙醇溶液0.6ml，40％氢氧化钾溶液0.2ml和少许肌酸结晶，振摇试管后静置2h，如出现伊红色，为VP试验阳性。 　　将 MR-VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5滴甲基红溶液。如培养物变红色，为甲基红试验阳性，若变黄色则为阴性反应。 7.4.3 Korser氏枸掾酸盐肉汤：于36±1℃的培养96h记录有无生长。 7.4.4 LST肉汤：于36±1℃的培养48±2h，观察试管中是否产气。 7.4.5 革兰氏染色：取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色。大肠杆菌为革兰氏阴性。 7.4.6 大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下 靛基质 MR VP 枸掾酸盐 鉴定（型别） + - + + - - - - 典型大肠杆菌 非典型大肠杆菌 + - + + - - + + 典型中间型 非典型中间型 - + - - + + + + 典型产气肠杆菌 非典型产气肠杆菌 如出现上表以外的生化反应类型，表明培养物可能不纯，应重新划线分离，必要时做重复试验。 7.5 结果报告：大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌，发酵乳糖产酸产气，IMViC试验为++--或-+--，再根据LST肉汤阳性管数查MPN表，报告每克（毫升）样品中大肠杆菌MPN值。 注：本文参照SN0169-92《出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法》 （六）沙门氏菌检验 1 主题内容与适用范围 本文规定了食品中沙门氏菌的检验方法。 本文适用于航空食品的检验。 2 设备和材料 吸管（1ml、10ml）、恒温培养箱（36±1℃、42℃）、冰箱、均质器、振荡器、平皿、稀释瓶、天平、显微镜、接种棒等 3 培养基和试剂 缓冲蛋白胨水（BP）、氯化镁孔雀绿增菌液、四硫酸钠煌绿(TTB)增菌液、亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液、亚硫酸铋琼脂(BS)、DHL琼脂、HE琼脂、WS琼脂、SS琼脂、三糖铁琼脂、蛋白胨水、靛基质试剂、尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基、氨基酸脱羧酶试验培养基、糖发酵管、ONPG培养基、半固体琼脂、丙二酸钠培养基、沙门氏菌因子血清：按26种用于初步分型；57种用于进一步分型；163种用于详细分型。 4 检验程序 沙门氏菌检验程序如下： 　　　 36±1℃ 4h 　　　　　　　　　42℃ 18-24h　　　　　　36±1℃ 18-24h 36±1℃ 40-48h　　　　　　　　36±1℃ 18-24h 5 操作步骤 5.1 前增菌 取检样25g，加入225mL缓冲蛋白胨水于均质杯内。用均质器以8000～10000r/min打碎1min，于36±1℃培养4h(干蛋品培养18～24h)，移取10mL，转种于100mL氯化镁孔雀绿增菌液（MM）或四硫酸钠煌绿（TTB）增菌液内，于42℃培养18～24h。同时，另取10mL，转种于100mL亚硒酸盐肮氨酸（SC）增菌液内，于36±1℃培养18～24h。 5.2 分离 取增菌液1环，划线接种于一个亚硫酸铋琼脂平板和一个DHL琼脂平板。两种增菌液可同时划线接种在同一个平板上。于36±1℃分别培养18～24h(DHL)或40～48h(BS)，观察各个平板上生长的菌落，沙门氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和沙门氏菌Ⅲ在各个平板上的菌落特征见表1。 　　表1　沙门氏菌属各群在各种选择性琼脂平板上的菌落特征 选择性琼脂平板 沙门氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ 沙门氏菌Ⅲ（即亚利桑那菌） BS琼脂 产硫化氢菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株不产硫化氢，形成灰绿色的菌落周围培养基不变 黑色有金属光泽 DHL琼脂 无色半透明；产硫化氢菌落中心带黑色或几乎全黑色 乳糖迟缓阳性或阴性的菌株与沙门氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ相同；乳糖阳性的菌株为粉红色，中心带黑色 5.3 生化试验 5.3.1 自选择性琼脂平板上直接挑取数个可疑菌落，分别接种三糖铁琼脂。在三糖铁琼脂内，肠杆菌科常见属种的反应结果见表2。 表2　肠杆菌科各属在三糖铁琼脂内的反应结果 斜面 底层 产气 硫化氢 可能的菌属和种 - + +/- + 沙门氏菌属、弗劳地氏柠檬酸杆菌、变形杆菌属、缓慢爱德华氏菌 + + +/- + 沙门氏菌Ⅲ、弗劳地氏柠檬酸杆菌、普通变形杆菌 - + + - 沙门氏菌属、大肠埃希氏菌、蜂窝哈夫尼亚菌、摩根氏菌、普罗菲登斯菌属 - + - - 伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌、志贺氏菌属、大肠埃希氏菌、蜂窝哈夫尼亚菌、摩根氏菌、普罗菲登斯菌属 + + +/- - 大肠埃希氏菌、肠杆菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、弗劳地氏柠檬酸杆菌 说明：在三糖铁琼脂内只有斜面产酸并同时硫化氢(H2S)阴性的菌株可以排除，其他的反应结果均有沙门氏菌的可能，同时也均有不是沙门氏菌的可能。 5.3.2 在接种三糖铁琼脂的同时，再接种蛋白陈水(供做靛基质试验)、尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基和赖氨酸脱竣酶试验培养基及对照培养基各1管，于36±1℃培养18～24h，必要时可延长至48h，按表3判定结果。按反应序号分类，沙门氏菌属的结果应属于A1、A2和B1，其他5种反应结果均可以排除。 　　表3　肠杆菌科各属生化反应初步鉴别表 反应序号 硫化氢 靛基质 尿素 氰化钾 赖氨酸 判定菌属 A1 + - - - + 沙门氏菌属 A2 + + - - + 沙门氏菌属（少见）缓慢爱德华氏菌 A3 + - + + - 弗劳地氏柠檬酸杆菌、奇异变形杆菌 A4 + + + + - 普通变形杆菌 B1 - - - - - - - - + - 沙门氏菌属、大肠埃希氏菌、甲型伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌、志贺氏菌属 B2 - - + + - - - - + - 大肠埃希氏菌、志贺氏菌属 B3 - - - - +/- + + + + - 克雷伯氏菌族各属阴沟肠杆菌、弗劳地氏柠檬酸杆菌 B4 - + +/- + - 摩根氏菌、普罗菲登斯菌属 5.3.3 反应序号A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN和赖氨酸3项中有1项异常，按表4可判定为沙门氏菌。如有2项异常，则按A3判定为弗劳地氏柠檬酸杆菌。 　　表4 尿素 氰化钾 赖氨酸 判定结果 - - + - + - - + + 甲型副伤寒沙门氏菌（要求血清学鉴定结果） 沙门氏菌Ⅳ或Ⅴ（要求符合本群生化特性） 沙门氏菌个别变体（要求血清学鉴定结果） 5.3.4 反应序号A2：补做甘露醇和山梨醇试验，按表5判定结果。 表5 甘露醇 山梨醇 判定结果 + - + - 沙门氏菌靛基质阳性变体（要求血清学鉴定结果） 缓慢爱德华氏菌 5.3.5 反应序号B1：补做ONPG。ONPG十为大肠埃希氏菌，ONPG－为沙门氏菌。同时，沙门氏菌应为赖氨酸＋，但甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸－。 5.3.6 必要时按表6进行沙门氏菌生化群的鉴别。 表6沙门氏菌属各生化群的鉴别 项目 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ 卫矛醇 山梨醇 水杨苷 ONPG 丙二酸盐 KCN + + - - - - + + - - + - - + - + + - - + + - - + + + - + - + - - - - - - 5.4 血清学分型鉴定 具体内容见GB/T4789.4-2003《食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验》中6.4。 5.5 菌型的判定和结果报告 　　综合以上生化试验和血清学分型鉴定的结果，按照GB/T4789.4-2003《食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验》中表8或有关沙门氏菌属抗原表判定菌型，并报告结果。 注：本文参照GB/T4789.4-2003《食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验》 （七）金黄色葡萄球菌检验 1 主题内容与适用范围 本文规定了食品中金黄色葡萄球菌的检验方法。 本文适用于航空食品的检验。 2 设备和材料 吸管（1ml、10ml）、恒温培养箱（36±1℃）、冰箱、均质器、振荡器、平皿、稀释瓶、天平、显微镜、接种棒等 3 培养基和试剂 普通肉汤培养基、胰蛋白胨大豆肉汤、Baird－Prker琼脂平板、缓冲蛋白胨水（BP）、凝固酶试验冻干血浆 4 检验程序（非选择性增菌法） 金黄色葡萄球菌检验程序如下： 36±1℃ 2h 36±1℃ 24h 36±1℃ 48h 36±1℃ 24h 5 操作步骤 5.1 称取25g固体样品；吸取25mL液体样品，加入225mLBP胨水，固体样品研磨或置均质器中制成混悬液。 5.2 吸取10mL上述混悬液，接种于10mL双料胰蛋白胨大豆肉汤中，置36±1℃培养2h。 5.3 再加入20ml 含20％NaCl的单料胰蛋白胨大豆肉汤，置36±1℃培养24±2h。 5.4 划线转种2个表面干燥的Baird－Parker琼脂平板上，36±1℃培养46±2h。 5.5 挑取可疑菌落移种到肉汤培养基中，置36±1℃温箱培养24h。 5.6 取肉汤培养物0.3ml同0.5ml凝固酶试验冻干血浆于8mm*100mm试管内充分混合，置36±1℃培养，定时观察是否有凝块形成，至少观察6h，以内容物完全凝固，使试管倒置或倾斜时不流动为阳性。试验中需同时做已知阳性和阴性对照。对可疑结果，应进行革兰氏染色、镜检和其他辅助试验。 5.7 本菌为革兰氏阳性球菌，排列是葡萄球状，无芽胞，无荚膜，致病性葡萄球菌菌体较小，直径约为0.5～1μm。在Baird－Parker平板上为圆形、光滑凸起、湿润、直径为2～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落似有奶油树胶的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。 5.8 报告结果 如发现有凝固酶试验阳性的菌落，即报告1g(ml)食品中有金黄色葡萄球菌存在，否则为阴性。 注：本文参照SN0172-92《出口食品中金黄色葡萄球菌检验方法》 （八）霉菌计数 1 主题内容与适用范围 本文规定了食品和饮料霉菌计数的检验方法。 本文适用于航空食品和饮料中霉菌计数的检验。 2 设备和材料 温箱（25～28℃）、振荡器、天平、玻塞三角瓶（500mL）、平皿（直径9cm）、吸管（1mL及10mL）、酒精灯等。 3 培养基和试剂 高盐察氏培养基、灭菌蒸馏水、乙醇 4 操作步骤 4.1 无菌操作称取检样25g(或25mL)，放人含有225mL灭菌水的玻塞三角瓶中，振摇30min，即为1：10稀释液。 4.2 用灭菌吸管吸取1∶10稀释液10mL，注入试管中，另用带橡皮乳头的1mL灭菌吸管反复吹吸50次，使霉菌孢子充分散开。 4.3 取1mL1∶10稀释液注入含有9mL灭菌水的试管中，另换一支1mL灭菌吸管吹吸5次，此液为1∶100稀释液。 4.4 按上述操作顺序做10倍递增稀释液，每稀释一次，换用一支1mL灭菌吸管，根据对样品污染情况的估计，选择3个合适的稀释度，分别在做10倍稀释的同时，吸取1mL稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做2个平皿，然后将凉至45℃左右的培养基注入平皿中，待琼脂凝固后，倒置于25～28℃温箱中，3d后开始观察，共培养观察5d。 4.5 计算方法：通常选择菌落数在10～150之间的平皿进行计数，同稀释度的2个平皿的菌落平均数乘以稀释倍数，即为每克(或毫升)检样中所含霉菌数。 4.6 报告：每克(或毫升)食品所含霉菌以个/g(个/mL)表示。 注：本文参照GB/T4789.15-2003《食品微生物学检验霉菌和酵母计数》 （九）革兰氏染色 1 原理 革兰氏染色法是细菌学中重要的鉴别染色法，通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌和阴性菌两大类。其过程是：草酸铵结晶紫初染→路哥尔氏碘液媒染→95%乙醇脱色→蕃红花红复染。若细胞能保持结晶紫与碘所形成的复合物而不被乙醇脱色，则细菌呈紫色，称革兰氏阳性菌，若被乙醇脱色而被蕃红复染成红色，则称革兰氏阴性菌， 2 药品与材料 革兰氏染色液（草酸铵结晶紫液＋路哥尔氏碘液＋95%乙醇＋蕃红花红）、蒸馏水、菌落培养物（培养18~24小时）、二甲苯、香柏油 3 器具及其它 载玻片、盖玻片、酒精灯、废液缸、洗瓶、吸水纸、接种环、显微镜、镊子 4 操作程序 涂片→干燥→固定→草酸铵结晶紫初染→水洗→碘液媒染→95%酒精脱色20~30秒→水洗→蕃红花红液复染→水洗干燥→镜检 4.1 涂片：先滴一小滴蒸馏水于载玻片中央，然后用接种环取少量菌体轻轻混入水中，涂成一薄层并使细胞均匀分散。 4.2 干燥：在空气中令其自然干燥或在酒精灯火焰上端高处微微加温但勿靠近火焰。 4.3 固定：把涂有细菌的面朝上，在酒精灯火焰上通过三次，目的是杀死菌体细胞以及改变对染色剂的通透性，同时使涂片的菌体紧贴载玻片而不易被水冲洗脱落。 4.4 初染：用草酸铵结晶紫液初染1分钟，水洗、吸干。 4.5 媒染：加一滴路哥尔氏碘液媒染1分钟、水洗。（此时结晶紫与碘液成复合物） 4.6 脱色：斜置载玻片，用95%酒精冲洗约20~30秒种，立即水洗，吸干。 4.7 复染：用蕃红花红液复染1~2分种，水洗晾干或用吸水纸吸干。 4.8 镜检：在显微镜油浸镜下检查革兰氏阳性菌和阴性菌染色的差异，并观察菌体形态。 5 革兰氏染色成败的控制点 5.1 涂片厚度：涂片过厚，细胞重叠，无法较好地观察单个细菌细胞形态，涂片过薄，细胞数量少，不利于观察； 5.2 染色时间。染色时间过长,结晶紫与细胞结合，脱色不易，染色不够，结晶紫尚未与细胞结合。染色控制不好，易引起误判； 5.3 乙醇脱色的程度。如脱色过度，则阳性菌被误染为阴性菌；若脱色不够，则阴性菌被误染为阳性菌。 （十）空气中微生物的检验 1 目的 了解空气中微生物的状况，掌握空气中微生物的检验方法，分析引起食品中微生物的来源因素，及时控制餐食卫生质量。 2 原理 根据空气中微生物一般吸附在尘埃中，由于地心引力尘埃下沉到地面或物体表面原理制定的。 3 器材 培养皿、生化培养箱、营养琼脂 4 方法（沉降法） 4.1 以无菌操作将已融化并冷却至50℃的营养琼脂倒入培养皿中，放置凝固。 4.2 在不同地点将培养皿分别打开，在空气中暴露15分钟，立即将培养皿盖好，作上记号，并作一空白对照。 4.3 将培养皿放置37℃恒温培养48小时，取出观察其结果并计算出菌落数。 4.4 计算公式：每立方米空气中细菌数＝50000N/(A×t) N：为培养皿经培养后的菌落数 A：为所用平皿面积(cm2)，平皿直径(ø)9cm t：为平皿暴露于空气中的时间(t=15分钟) （这个公式根据：根据15分钟内在100 cm2面积上降落的细菌数约等于10升空气中的含菌数而估计的。） 注：本文参照GB15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》附录E （十一） 水中微生物的检验 1 基本原理 细菌总数是指水样在一定条件下培养后所得1ml水样所含菌落的总数。 总大肠菌群系指一群在37℃培养24h能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌群主要来源于人畜粪便，具有指示菌的一般特征，故以此作为粪便污染指标评价饮水的卫生质量。水中总大肠菌群数系以100ml水样中污染的总大肠菌群最可能数（MPN）表示。 按国家饮用水卫生标准规定，1毫升自来水中杂菌数不得超过100个，大肠菌群数1000毫升水中不得超过3个才算合格。 2 材料 营养琼脂、乳糖胆盐发酵培养基、酒精、棉签、培养皿、无菌广口瓶 3 方法 3.1 采样（自来水）：先将水龙头打开，放水1~2分钟后，关闭水龙头。用酒精棉球灼烧龙头三分钟灭菌，再开放水龙头使水流5分钟，用无菌瓶收集水样。 3.2 细菌总数检查： 3.2.1 用灭菌吸管吸取1ml水样，注入灭菌培养皿中，共做2个。 3.2.2 分别倾注约15ml已熔化冷却至45℃左右的营养琼脂，混匀后置37℃培养24小时进行菌落计数，同时应作一空白对照。两个培养皿的平均菌落数即为水样1ml中的细菌总数。 3.3 大肠菌群数检查：　　 乳糖发酵试验→分离培养→证实试验→报告 3.3.1 乳糖发酵试验： 自来水的接种方法：在2个装有50ml三倍料乳糖胆盐发酵液的三角瓶中，各加入100ml水样；在10支装有5ml同样发酵的试管中，各加入10ml水样，混匀。将上述各发酵管（瓶）置36±1℃温箱内，培养24±2小时，观察结果。如所有发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则按下列程序进行。 3.3.2 分离培养：将产气的发酵管用接种环分别以划线法转接于伊红美兰琼脂平板上，置36±1℃温箱内，培养18~24小时，取出观察菌落形态。 3.3.3 证实试验：在每个平板上，挑取可疑菌落(紫黑色或淡紫红色，有或略有或没有金属光泽的菌落)1~2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置36±1℃培养24±2小时进行复发酵试验，观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的芽孢杆菌即可报告为大肠菌群阳性。 4 报告 每毫升自来水所含菌落数以个/mL表示；根据证实为大肠菌群阳性的管数，查大肠菌群检索表，报告每升水样的大肠菌群的最可能数。 注：本文参照GB5750-85《生活饮用水标准检验方法》 （十二）食品接触面的微生物检验 1 原理 食品接触面分为人员手、设备、器具等食品直接接触，其表面存在有微生物，为更好控制微生物生长繁殖，以大肠菌群为主要检测指标，检测结果应基本呈阴性（其中人员手需做菌落总数检测）。 2 检验材料　 乳糖胆盐发酵培养基、EMB、乳糖复发酵培养基、大肠菌群检测纸片、无菌棉球、无菌水、酒精棉球、酒精灯、镊子　 3 检验方法 3.1 人员手检验（发酵法） 3.1.1 样品采集 被检人双手五指并拢，用一浸湿生理盐水的棉签在右手指曲面，从指尖到指端来回涂擦10次，然后剪去手接触部分棉棒，将棉签放入含10ml灭菌生理盐水的采样管内。 3.1.2 细菌菌落总数的检测 将已采集的样品在6h内送实验室，每支采样管充分混匀后取1ml样液，放入灭菌平皿内，倾注营养琼脂培养基，每个样品平行接种两块平皿，置36±1℃培养48小时，计数平板上细菌菌落数。 Y＝A*10（Y为工人手表面细菌菌落总数，cfu/只手；A为平板上平均细菌菌落数） 3.1.3 大肠菌群的检测 每支采样管充分混匀后取1ml样液，分别放入10ml乳糖胆盐发酵管中，每个样品平行接种3管，置36±1℃培养24小时。如所有发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则按下列程序进行。 3.1.4 分离培养：将产气的发酵管用接种环分别以划线法转接于伊红美兰琼脂平板上，置36±1℃温箱内，培养18~24小时，取出观察菌落形态。 3.1.5 证实试验：在每个平板上，挑取可疑菌落(紫黑色或淡紫红色，有或略有或没有金属光泽的菌落)1~2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置36±1℃培养24±2小时进行复发酵试验，观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的芽孢杆菌即可报告为大肠菌群阳性。 3.2 设备、器具等的检验（纸片法） 3.2.1 将面积为25cm2的大肠菌群检测纸片用无菌水浸湿后立即贴于被检物表面，每份检样贴2张，30s后取下，置于无菌塑料袋中。 3.2.2 将已采样的纸片置37℃培养16－18小时，观察纸片颜色变化情况。 3.2.3 若纸片保持蓝紫色不变为大肠菌群阴性，纸片变黄并在黄色背景上呈现红色斑点或片状红晕为阳性。 4 报告 人员手菌落总数为cfu/只手，大肠菌群为未检出或检出；设备、器具等大肠菌群为未检出或检出。 　 注：本文参照GB15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》附录E GB14934—94《食(饮)具消毒卫生标准》 H2S +　靛基质-尿素-　KCN-　赖氨酸+ 挑取可疑菌落 10ml匀液+SC100ml TSI（斜面、底层、产气、H2S），蛋白胨水（），尿素（PH7.2），KCN, 赖氨酸 10ml匀液+MM(或TTB)100ml 检样25g+225mlBP胨水 BS DHL H2S -　靛基质-尿素-　KCN-　赖氨酸+/- 非如左述的各种反应结果 H2S +　靛基质+尿素-　KCN-　赖氨酸+ 沙门氏菌 血清学试验 非沙门氏菌 甘露醇、山梨醇 沙门氏菌 血清学试验 ONPG 非沙门氏菌 报告 检样25g+225mlBP胨水 10ml匀液+10ml双料胰胨肉汤 上述混合液+20ml20％NaCl单料胰胨肉汤 挑可疑菌落，移种到肉汤培养基 B-P平板 观察溶血 涂片染色 凝固酶试验 报告