人参皂苷单体及其与其他中药单体联合应用对细菌生物膜抑制作用的研究（可编辑）

人参皂苷单体及其与其他中药单体联合应用对细菌生物膜抑制作用的研究（可编辑） 学校代号 10199学 号 20082701046硕士 学 位 论 文 人参皂苷单体及其与其他中药单体联合应用对细菌生物膜抑制作用的研究 panaxadiol saponins monomer and its combination with other herbs on the inhibition of bacterial biofilms 学位申请人 董春雷 导师姓名职称 高其品 教 授 专业名称 药物化学 研究方向 天然药物活性成分研究 培养方式 全日制 申请学位类型 科学学位 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 提交日期 2011年6月 分类号 密级 UDC 编号 硕士学位论文 人参皂苷单体及其与其他中药单体联合应用对细菌生物膜抑制作用的研究 Ginsenoside saponins monomer and its combination with other herbs on the inhibition of bacterial biofilms 董春雷 指导教师姓名:高其品 教授 (长春中医药大学) 申请学位级别:硕士 专业名称:药物化学 研究方向:天然药物活性成分研究 论文提交日期:2011年5月 论文答辩日期:2011年6月 学位授予单位: 长春中医药大学 提交确认:作者签名 导师签名: 长春中医药大学学位论文原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是个人在导师的指导下,独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经特别加以注明引用的内容外,本论文不含任何其他个人或集体已经发 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明并致谢。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名 年 月 日 关于学位论文成果归属权的声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师指导下自选课题或导师承担的国家立项资助的 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 课题的一部分,系本人在导师指导和资助下独立进行研究工作所取得的成果,归属权为长春中医药大学和本人导师所有。特此声明,本声明的一切法律责任由本人承担。 论文作者签名 指导教师签名 年 月 日 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解长春中医药大学有关保留使用学位论文的规定,同意学校保留并向中国科学技术信息研究所及中国学术期刊(光盘版)电子杂志社送交论文的复印件和电子版,允许被查阅和借阅。本人授权长春中医药大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入《中国学位论文全文数据库》及《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》进行检索,可以采用影印、缩印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。 (保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名指导教师签名 年 月 日 目 录 目 录 2 中文摘要 1 Abstract 2 英文缩略语 3 前 言 4 文献综述 5 一 细菌生物膜研究进展 5 1 细菌生物膜概念 5 2 细菌生物膜结构 5 3 细菌生物膜耐药机制 6 4 细菌生物膜相关疾病 6 5 细菌生物膜耐药性对抗策略 7 6 中药抗细菌生物膜 7 二 人参皂苷的研究进展 8 1 人参皂苷结构简介 8 2 人参皂苷理化性质 8 3 人参皂苷的药理作用研究 9 实验研究 11 第一章 细菌生物膜扫描电子显微镜与激光扫描共焦显微镜观察 11 材料与方法 11 1 材料 11 2 方法 11 结 果 12 1 不同培养时间大肠杆菌和金黄色葡萄球菌SEM结果观察 12 2 大肠杆菌和金黄色葡萄球菌CLSM结果观察 17 讨 论 21 第二章 具有抗菌作用的中药单体及人参皂苷对细菌及BBF抑制作用 22 材料与方法 22 1 材料 22 2 方法 23 结 果 24 1 大黄酸、和厚朴酚、黄芩素对细菌菌液的作用结果 24 2 大黄酸、和厚朴酚、黄芩素对BBF的作用结果 26 3 人参根总皂苷及人参茎叶皂苷对细菌菌液的作用结果 27 4 人参根总皂苷及人参茎叶皂苷对BBF的作用结果 27 5 大黄酸、和厚朴酚、黄芩素及人参总皂苷对细菌菌液及BBF抑制作用比较 28 讨 论 30 第三章人参各单体皂苷对细菌菌液及BBF的作用研究 31 材料与方法 31 1材料 31 2方法 31 结 果 31 1.人参各单体皂苷对大肠杆菌及BBF的作用结果 31 2.人参各单体皂苷对金黄色葡萄球菌细菌菌液及BBF的作用 34 讨 论 36 第四章 人参单体皂苷与其他中药单体联用应用对细菌及BBF的作用 38 材料与方法 38 1.材料 38 2方法 38 结 果 39 1人参皂苷Rb2与三种中药单体联合应用对大肠杆菌的理论抑菌指数分布 39 2人参皂苷Rb2与三种中药单体联合应用对大肠杆菌BBF的理论抑菌指数分 布 40 讨 论 40 结 论 42 致 谢 43 参考文献 44 中文摘要 目的:进一步完善大肠杆菌和金黄色葡萄球菌细菌生物膜模型,建立完善的细菌生物膜模型方法;考察具有抗菌作用的中药单体及人参总皂苷对细菌生物膜的作用;筛选出对细菌生物膜具有较强抑制作用的人参皂苷单体,并考察其与中药单体联合应用对细菌生物膜的影响。方法:利用扫描电子显微镜及激光共聚焦显微镜观察细菌生物膜的形成及形态;以大肠杆菌及金黄色葡萄球菌生物膜为筛选模型,将中药单体、人参总皂苷、各人参皂苷等物质与细菌及细菌生物膜共同培养,通过酶标仪读取的OD值来测定细菌及生物膜的生长能力,通过计算抑菌率来观察各样品对细菌及生物膜的抑制作用的大小;采用微量肉汤稀释法筛选与人参皂苷单体联合用药对细菌及生物膜产生影响的其他中药单体。结果:通过扫描电子显微镜(SEM)及激光共聚焦扫描电子显微镜(CLSM)镜下观察的结果,确定大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在培养24h时,形成生物膜;人参总皂苷对大肠杆菌抑制率最高达87.70%,对大肠杆菌BBF抑制率最高达69.65%,对大肠杆菌具有很强的抑制作用,对金黄色葡萄球菌及BBF有一定的抑制作用,但抑制作用较弱;人参单体皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc及Rd对大肠杆菌及BBF均有很强的抑制作用;其中Rc对大肠杆菌抑制率最高,可达86.68%;Rd对大肠杆菌BBF抑制率最高,可达60.59%;联合用药结果显示:Rb2与阿魏酸联合应用,对大肠杆菌及BBF产生一 定协同抑制作用。结论:通过SEM和CLSM实验,进一步完善了细菌生物膜模型; 通过中药单体对BBF的作用,进一步验证了细菌生物膜模型作为筛选慢性感染性 药物模型的可行性。筛选出对BBF具有较强抑制作用的人参皂苷单体;并与阿魏 酸联合应用对大肠杆菌BBF产生一定的协同抑制作用,这为下一步人参及人参与 其它药物联合应用,治疗慢性感染性疾病的深入开发研究,打下良好的基础,并提 供科学的依据。 关键词: 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 生物膜 人参皂苷Abstract Pμrpose: Improve bacterial biofilm model of E.coli and Staphylococcus aureus, and establish sophisticated method of bacterial biofilm model; To Investigate influoence of antibacterial activity Chinese medicine monomer and ginsenoside on bacterial biofilm. Screen ginsenoside monomers which inhibits bacterial biofilm. Observe combined affect of ginsenoside and Chinese medicine monomer on bacterial biofilm.Method: Observe formation and morphology of bacterial biofilm with SEM and LSCM. With E.coli and Staphylococcus aureus as screening model of bacterial biofilm, coculture of bacterial biofilm with Chinese medicine monomers, ginsenosides and single ginsenoside, and measure growth capacity of bacteria and biofilm based on OD from microplate reader. Observe inhibitory capacity of different samples on bacteria and biofilms through inhibition rate. Screen other Chinese medicine monomers which have combined effect on bacterial biofilm with ginsenoside by broth microdilution.Resμlt: With the application of SEM and CLSM, it is observed that biofilm of E.coli and Staphylococcus aureus bacterial biofilm formation after 24 hours’ Ginsenosides have strong inhibitory activity on E.coliu and biofilms, inhibition is 87.70% for E.coliu,and 69.65% for E.coliu biofilms, while they only inhibit Staphylococcus aureus and biofilms to some extent. Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd, which inhibit E.coliu and biofilms greatly, were obtained after screening of ginsenoside monomers Rc’s inhibition is 86.68% for E.coliu,and Rd’s inhibition is 60.59% for E.coliu biofilms Combined medication shows, combination of Rb2 and Ferulic acid have collaborative inhibition on E.coliu and biofilms.Conclμsion: With application of SEM and CLSM, bacterial biofilm model is further improved. Bacterial biofilm model as screening model of chronic infection drugs is furthrt confirmed through investigation of impact of Chinese medicine monomers on bacterial and BBF. Ginsensides which inhibit bacterial and BBF greatly were obtained. In addition, ginsenoside which have collaborative effect with Ferulic acid was also obtained, which lays good foundation for further combined medicate with ginseng and treatment of chronic infection disease. Keywords: colibacillus,Staphylococcus aureus,bacteria biofilms,ginsenoside 英文缩略语 英文缩写 英文全称 中文名词 BBF Bacterial biofilm 细菌生物膜 SEM Scanning electron microscope 扫描电子显微镜 MIC Minimal inhibitory concentration 最小抑菌浓度 FIC Fractional inhibitory concentration 联合抑菌浓度 NB Nutrient Broth Medium 营养肉汤培养基 PI Propidiμm Iodide 碘化丙啶 FITC Flμorescein isothiocyanate 异硫氰酸荧光素 CLSM Confocal laser scanning microscope 激光扫描共焦显微镜 PS Polystyrene 聚苯乙烯 CFΜ Colony forming μnit 菌落形成单位 PBS Phosphate bμffer solμtion 磷酸盐缓冲液 OD Optical density 光密度 前 言 临床数据表明,临床上一些患者,细菌感染后很难根除,即使实验室分离出致病菌,并找到敏感的抗生素应用于治疗仍起不到应有的疗效,经多年研究发现,这很多是由细菌生物膜Bacterial biofilm,BBF引起的[1]。现今,临床上常用的抗生素对BBF起不到很好的治疗作用。所以,认识BBF、筛选出对BBF具有抑制及破坏作用的药物十分必要。在我国,应用中医中药防病治病已有几千年的历史,特别是在治疗慢性及难治性感染疾病方面有着显著的疗效。在临床中它已成为治疗细菌感染性疾病的一种重要的治疗或辅助治疗方法。但不可否认的是,目前尚未筛选出可与抗生素活性相比的或与抗生素具有协同作用的成分。使得中 医药在此方面的临床应用和新药开发受到很大影响。 本研究采用细菌生物膜模型作为筛选方法,以微孔板技术为手段,人参总皂苷为研究对象,筛选抗菌作用较强的人参皂苷单体,评价其对BBF及膜内细菌的破坏、抑制作用;继续筛选其他中药单体,与人参皂苷单体联合应用,产生协同抑制BBF的作用。 本课题立题新颖,首先,采用了新的更加合理的抗菌模型,其次我们利用此模型研究人参皂苷在治疗慢性感染性疾病方面的新作用,既是临床治疗的需求,也是我国、我省人参产业发展的需求,因此开展此方面的工作,对于发现人参新作用、提高人参研究水平、开发科技含量高、市场前景好的产品是十分必要的,此项研究也为中药治疗慢性感染这一重大疾病和其临床疗效评价提供依据,为丰富中医药治疗慢性感染的理论和实践作出贡献。 文献综述 一 细菌生物膜研究进展 1 细菌生物膜概念 细菌生物膜(BBF)是细菌为适应自然环境,有利于生存而特有的生命现象,是指细菌吸附于惰性物体如生物医学材料或机体黏膜表面后,分泌多糖基质、纤维蛋白、脂蛋白等多糖蛋白复合物,使细菌相互粘连并将其自身克隆、聚集、缠绕其中形成的膜样物[2]。这类细菌群体耐药性极强,可以逃避宿主免疫作用,且感染部位难以彻底清除,是临床上难治性感染的重要原因之一。BBF在自然界中很常见,输水系统、食品加工、航运等领域都可见到细菌生物膜的影响。此外,BBF与多种人体相关性感染性疾病的关系也非常密切。当细菌以BBF形式存在时耐药性明显增强10~1000倍,抗生素应用不能有效清除BBF,还可诱导耐药性产生。目前生物膜引起的微生物耐药明显增加,约65%的人类感染与生物膜有关[3],更有学者认为超过80%的人类感染中有BBF的形成[4]。 2 细菌生物膜结构 BBF是细菌粘附物体表面,采取生活的生长方式,可由单一菌种构成,也可由多个菌种构成,其中有处于游离状态的游离菌(容易获得营养成分),代谢较快的表层菌和处于休眠或静止状态的深层菌。不同的生长环境、不同的细菌,形成的生物膜结构也有很大差距。Lee L Y等认为生物膜的结构是平面二维结构,并具有一定的厚度[5],如牙菌生物膜。而有的研究者提出生物膜是菌体借助众多胞外多糖聚集,镶嵌从而形成的结构模型。另外一种具有代表性的是“蘑菇模型”,即由类似蘑菇或郁金香形状的微菌落组成,膜底比膜顶窄,外形类似蘑菇或郁金香的结构,在这些微菌落之间围绕着输水通道,水溶液可在通道中不断的流动循环,从而运送养料、酶、代谢产物和排出废物等[6],李鸣宇等人在用激光共聚焦扫描显微镜观察链球菌生物膜时发现一种有通道贯穿、分层的三维结构,比较不 同层次的断面,发现生物膜的细菌分布是表层和基底较少,中间层较厚并较密,从水平断面观察其形状类似谷穗状结构[7]。本文通过激光共聚焦扫描显微镜观察对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌BBF进行观察,发现他们形成膜的形态和能力同样有很大差距。大肠杆菌相互交织,形成无规则的网状,分散较广,很容易形成BBF。金黄色葡萄球菌则相互聚集,互相粘连,形成一簇一簇的类似葡萄串的结构,相比大肠杆菌,金黄色葡萄球菌形成BBF的能力较弱。 3 细菌生物膜耐药机制 临床中选用传统的抗生素类药物用于治疗BBF引起的相关疾病往往起不到较好的作用[8],即便是效果明显也是反复发作,无法从根本上治愈[9、10]。这主要是由于抗生素抑制、杀灭细菌和对BBF的作用机制是不同的[11、12],而且BBF的耐药机制与浮游菌的完全不相同[13、14、15]。临床资料表明,在开始形成的最初72h内BBF对抗菌药物比较敏感[16],而BBF一旦成熟所能耐受的抗菌药物浓度就将大大高于浮游菌的MIC,甚至达到浮游菌MIC浓度的1000倍以上[17]。关于BBF对抗生素的耐药机制目前还不十分明确,本文对BBF几种可能耐药机制综述如下。 3.1 细菌生物膜的屏障作用[18] 大量研究表明BBF胞外大量脂多糖对多种抗菌药物具有屏蔽作用,它带有大量的阴离子,通过氢键、共价键、范德华力吸附带有阳离子的抗菌药物,从而阻止抗生素接触包裹于被膜内细菌,使渗入并接触到细菌生物膜的抗菌药物大大减少,达不到抑菌、杀菌的浓度,从而使药物失效。不同BBF阻止渗透作用也不同[19]。 3.2 营养成分的限制[20] 生物膜内的细菌由于营养供应不足,处于饥饿状态,生长速度慢,分裂不活跃。由于细菌的代谢率降低,抗生素通过作用于代谢环节去影响细菌活性的概率也降低,从而达不到治疗效果。Walters等[21]证实细菌代谢低,氧浓度低可参与BBF耐药的形成,同时伴有耐药性提高。 3.3 产生耐药表型 BBF表现出的抗药性可能是生物膜内某些细菌在特定的环境中获得了一种与浮游细菌不同的具有保护作用的生物膜表型,产生了包括抗药性在内的一系列生理功能改变,某些基因表达产物对生物膜的抗药性可能起着关键作用。Drenkard等[22]发现铜绿假单胞菌中存在一种调节蛋白PvrR,该蛋白控制铜绿假单胞菌对抗生素敏感和耐药的转化,该基因在BBF菌中转录活跃,抑制或激活PvrR对铜绿假单胞菌BBF耐药性意义重大。 以上几种说法并不能完全解释细菌生物膜的耐药机制,对细菌生物膜的耐药机制还有待以后继续研究。 4 细菌生物膜相关疾病 BBF导致的感染主要包括两个方面:l细菌生物被膜病。2生物材料相关感染。 4.1 细菌生物被膜病 日本小林教授在生物被膜的研究中,提出了生物被膜病的概念[23]。他把临床上与生物被膜有关的疾病总称为生物被膜病。致病机制在于细菌在病变组织表面形成生物膜并不断释放出游离菌,造成慢性持续性感染,同时藻酸盐导致的变态反应使周围组织损伤。常见疾病有肺囊性纤维化、慢性支气管炎合并感染, 弥漫性支气管炎,肺囊性纤维化合并感染,细菌性心内膜炎,慢性骨髓炎等。此类疾病由于生物膜的存在,生物膜内的细菌常常造成疾病的迁延不愈和急性发作,给临床治疗带来很大的困难。 4.2 生物材料相关感染 生物材料相关感染见于各种医疗插管及植入物表面,常见的有人工心脏瓣膜及动静脉插管、气管插管、导尿管、人工关节等,其相关感染发生率随插管时间的延长而增高。导尿管相关泌尿系统感染发生率为9.23%,中央静脉插管并发感染发生率在2%-37%之间,90%的机械通气患者气管插管处有细菌定植并反复发生感染[24];此外大静脉导管、伤口引流管、人工关节置入等相关感染的发生率亦较高[25]。 5 细菌生物膜耐药性对抗策略 5.1 现有修饰抗菌药物化学结构、改变药物电荷或联合促渗剂、多糖降解剂,增加抗菌药物对BBF渗透性。从BBF中鉴定新的抗生素物质,发展新型抗生素类药物[26]。 5.2 发展抗细菌粘附或聚集的生物材料。由于BBF易形成于留置性医疗装置的表面,所以应尽量减少使用或缩短使用时间,另外可使用经过特殊处理的抗感染材料。 5.3 在应用抗菌药物治疗的基础上寻找新的抗感染治疗方法。发展新型抗感染微生态制剂[27],可弥补传统抗生素易产生抗药性的缺陷;研发新型药物,使其可破坏BBF,暴露膜内细菌,从而可使抗生素直接接触细菌并将其清除,提高抗生素治疗效果。 5.4 寻找新的具有抗BBF的中药。有研究表明,中药对BBF有一定的抑制作 用。席清平等[28]发现了中药五倍子可抑制口腔抗菌斑生物膜的形成。五倍子所含的鞣酸,可沉淀、凝固蛋白,具有收敛、解毒、抗菌作用。 BBF的研究使微生物学的发展迈出了重要的一步,即认识到微生物可以以多细胞的生命形式存在,并引导人们去认识微生物是如何形成一个具有结构性、协调性和功能性的高度组织群体。但是,BBF内细菌的耐药机制目前还没有一个明确的解释,BBF形成机制、形成过程中所需的条件和信号、细菌群体的功能性分工都需要进一步研究。研究发现很多中药都具有抗菌作用,我们应该利用我们的便利条件,继续寻找新药,解决BBF这一难题。 6 中药抗细菌生物膜 前文论述了抗生素对BBF抑制作用的局限性,寻找新药是抗BBF的策略之一。我国具有丰富的中药资源,中药在防治慢性感染中显示了独特的优势。其药效长,来源广,价格低廉,毒副作用小,较少出现耐药,在细菌细胞内作用途径多样化,能产生多方面药理效应[29]。因此,中药在抗BBF方面将会有广阔的应用前景。 现今有关中药抗BBF的报道很多:黄晓敏等[30]探讨五倍子水提物对金黄色葡萄球菌生物膜的影响。陈一强等[31]研究发现,金银花水煎液能减弱铜绿假单胞菌对固体表面的黏附,一定浓度的金银花可以抑制和破坏早期及成熟生物膜,并增强头孢他啶对生物膜内铜绿假单胞菌的抗菌活性。孔晋亮等[32]研究了黄芩水煎液联合左氧氟沙星或头孢他啶对铜绿假单胞菌生物膜的作用。这些都为中药可以抗BBF提供了理论依据。 但是中药成分复杂性和作用多样性影响了药物在临床中的应用。中药在治疗感染性疾病时,无论是复方还是单方治疗,均由多种成分构成,产生多种作用,是 综合治疗的结果,而目前无论从成分还是从作用靶点方面,均无法全面阐明其有效作用成分及作用机理。 二 人参皂苷的研究进展 1 人参皂苷结构简介 现代药理学研究证实,人参皂苷是人参的主要药效物质。到目前为止,从人参中已分离出30余种人参皂苷[33]。总皂苷称为人参皂苷Rx,按硅胶薄层色谱Rf值的大小顺序由小到大将每一组分命名为Ro、Ra、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1、Rg2、Rg3、Rh1、Rh2和Rh3等。人参皂苷[34]按其化学性质可分为:人参皂苷二醇型A型,包括Rb1、Rb2、RC、Rd、Rh2等;人参皂苷三醇型B型,包括Re、Rf、Rg1、Rg2、Rhr等;齐墩果酸型C型如Ro,齐墩果酸型皂苷遍存在于含有三萜皂苷类的植物中,自然界并不乏见。一般人参中含原人参二醇类皂苷为45~60%,含原人参三醇类皂苷为12~20%,含齐墩果酸类皂苷为7~10%。二醇型和三醇型皂苷占人参皂苷的大多数,被认为是人参的最主要活性成分。 2 人参皂苷理化性质 人参皂苷为人参的主要有效成分,多数为白色、乳白色无定形粉末,或为无色针状结晶;味微甘苦,具有较强的吸湿性,能刺激粘膜而引起喷嚏,无明显的熔点。人参皂苷易溶于热水、热甲醇、热乙醇,水饱和的正丁醇,可溶于醋酸和醋酸乙脂,不溶于乙醚、苯等极性小的有机溶剂,因此常从水溶液中用正丁醇或戊醇提取,借以与糖、蛋白质等亲水性成分分开。此外,人参皂苷具有光学活性,在甲醇中多呈现右旋性[35],水溶液震荡产生强烈泡沫。人参皂苷一般对酸不稳定,弱酸下即可水解,但在水解后得不到真正的原形皂苷元。人参皂苷经酶或酸水解生成的皂苷元为结晶状物质,可溶于丙酮、乙醚、三氯甲烷等有机溶剂。原人参 二醇类皂苷和原人参三醇类皂苷在酸水解后产物分别为人参二醇和人参三醇。 3 人参皂苷的药理作用研究 人参具有多种功效,人参皂苷为人参的主要有效成分,具有延缓衰老、抗肿瘤、治疗心血管疾病、调节内分泌、增强体力提高免疫力、调节中枢神经系统和消化系统等作用。 3.1 抗衰老作用 在各种衰老理论中,自由基理论认为,自由基的毒性作用与衰老过程中的功能衰退有关,而抗氧化防卫系统功能的增强可减少自由基造成的损害,从而减缓衰老的进程。人参皂苷Rb1内含有能够清除自由基的抗氧化物质,不仅可以直接清除氧自由基,也可以通过增强肝细胞胞浆GSH-PX及CAT的活性间接地清除自由基[36]。人参茎叶总皂苷在一定剂量下对不同代龄人胚肺二倍体细胞的DNA合成皆有促进作用,对衰老现象有一定的延缓作用[37]。 3.2 对神经系统的作用 人参皂苷具有调节中枢神经系统的作用。体外实验研究结果表明,预先加入人参总皂苷或Rb2、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1、Rg2中的任一个,可抑制经卡巴胆碱刺激的皮层神经元中的肌醇磷酸酯的形成[38]。王莎莉等也证明了人参皂苷可以促进神经干细胞增殖和分化的作用[39]。人参皂苷Rb1有改善软脑膜微循环,直接增加脑血流量的作用,这有利于缺血时脑组织的存活,减少梗塞范围[40]。也有实验显示,人参皂苷Rd对吗啡诱导的小鼠条件性位置偏爱有拮抗作用,而Re对吗啡诱导的小鼠过度活动有增强作用,且能拮抗由Rb2、Rd、Rgl组成的复合物对吗啡作用的抑制[41]。 3.3 人参皂苷抗肿瘤作用 恶性肿瘤是危害人类健康的大敌,目前尚无有效的控制肿瘤转移的药物和治疗方法。上世纪70年代,一些学者就已经注意到人参对恶性肿瘤有一定的抑制作用。人参皂苷在体外能杀伤肿瘤细胞,在体内不仅能抑制肿瘤,而且与肿瘤坏死因子TNF有协同抗癌作用[42]。陈鲁[43]等通过对人参皂苷Rg3的研究发现Rg3对高转移人卵巢癌细胞系H0-8910PM有体外抑制作用。人参皂苷Rg3作为中药抗肿瘤药物具有抑制肿瘤生长、抗肿瘤转移和浸润的作用,同时,具有与化疗药物联合应用的减毒增效,提高机体免疫力等作用[44]。人参皂苷可以促进肺癌PG细胞诱导Jurkat细胞凋亡的作用,其机制可能与人参皂苷上调PG细胞FasL分子的表达有关[45]。 3.4 对心血管系统作用 近代研究证明,人参皂苷对心血管系统的多种疾病如缺血性心脏病、心律失常、心力衰竭等方面均有临床意义[46]。陆丰等[47]通过结扎犬左冠状动脉前降支LAD建立急性心肌梗死模型,研究发现人参Rb组皂苷对急性缺血心肌产生明显保护作用,作用机制可能与其纠正心肌缺血时游离脂肪酸代谢紊乱及对抗氧自由基引发的脂质过氧化反应,增强体内抗氧化酶活性等有关。金岩等[48、49]研究人参皂苷Rg1对急性心肌梗死后血管新生的影响及其作用机制。研究表明严重缺血急性期可刺激心肌组织产生大量的VEGF和HIF-1α,从而对缺血心肌起保护作用,人参皂苷Rg1可通过增加两者的表达而刺激心肌梗死区的血管生成和侧支循环建立。 三 本论文研究意义 人参为我国和我省主产的名贵中药材,对其新成分、新作用的研究和新产品的开发,是我国,特别是我省药学人员的重要职责。目前人参及其产品也有了大 量的研究和应用,但于国外相比我们还在某些方面具有一定的差距,所有的产品重复国外的多,相同相似的多,缺少创新程度高、科技含量高的产品。 细菌耐药性增强、感染难以治愈均与细菌形成的生物膜密切相关,抗生素治疗感染性疾病失败已成为一普遍的、极为严重的问题。依据上述情况,我们对建立BBF模型的方法进行了研究,并从多方面确定了BBF模型的合理和可靠。在建立BBF模型的基础上,对多种中药的提取物进行了活性筛选,发现许多具抗菌活性的中药提取物并无对大肠杆菌和金葡球菌BBF抑制作用,而人参皂苷却显示了明显的对BBF的抑制作用。这一新活性的发现,为人参治疗慢性感染性疾病提供了依据,同时也提示,对BBF具有抑制作用的成分其作用靶点、方式可能不同于传统意义的抗生素,有可能成为新型的抗感染药物。 综上所述,慢性感染性疾病已成为严重威胁人类健康的疾病,中医药治疗此类疾病具有丰富的理论和实践,人参皂苷在此方面显示了明显的活性,进行此方面的研究和开发新产品,既是临床治疗的需求,也是我省、我国人参产业发展的需求,因此开展此方面的工作,对于发现人参新作用、提高人参研究水平、开发科技含量高、市场前景好的产品是十分必要的。 实验研究 第一章 细菌生物膜扫描电子显微镜与激光扫描共焦显微镜观察 材料与方法 1 材料 1.1 实验菌株 大肠杆菌(1.1369):中国科学院微生物研究所;金黄色葡萄球菌1.0089:中国科学院微生物研究所。 1.2 培养基 营养肉汤培养基(NB):北京美坛公司;琼脂粉:北京鼎国生物技术有限责任公司。 1.3 试剂 FITC:北京鼎国生物技术有限责任公司;PI:北京鼎国生物技术有限责任公司; 1.4 仪器设备 二氧化碳培养箱:日本三洋电器有限公司;台式恒温振荡器(THZ-L):太仓市试验设备厂;双人净化工作台(SW-CJ-ZD)苏州净化设备有限公司;立式压力蒸汽灭菌器筒(01J2003-04)上海东亚压力容器制造有限公司;细菌浊度仪(WGZ-3-XJ):上海晰瑞仪器仪表有限公司;扫描电子显微镜(JSM-5500LV):日本;激光共聚焦扫描电子显微镜(Olympus FV1000):日本奥林巴斯公司。 2 方法 2.1 菌液的制备 将大肠杆菌活化后后,分别挑取3-4个菌斑各接种于含5mlNB液体培养基的试管中,37oC摇床震荡培养至对数中期,用细菌浊度计调大肠杆菌菌液浓度为0.5McF,稀释100倍,备用。同法制备金黄色葡萄球菌菌液。 2.2 生物膜动态形成实验 分别设定大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为A组和B组。每组各准备10个直径为3.5cm的培养皿。A组每个培养皿中分别加入2.1项下制备的大肠杆菌菌液500μl。B组每个培养皿中各加入2.1项下制备的金黄色葡萄球菌菌液500μl,置恒温培养箱中于37?培养。每组依次于6、12、18、24、48h取出2个培养皿, 一个用于扫描电子显微镜SEM观察,一个用于激光共聚焦扫描显微镜CLSM观察。 2.2.1 扫描电子显微镜标本制作 2.2项下的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的培养皿,用PBS反复冲洗。洗去未粘附细菌,剪成适度大小,用2.5%戊二醛浸泡1h固定,依次用50%~100%的乙醇浸泡,梯度脱水,每次5min,脱水后放入醋酸异戊酯液中浸泡15min,置换,在体积分数100%CO2气体中临界干燥,离子溅射表面固镀膜致材料表面成金黄色.用于SEM观测分析。 2.2.2 激光共聚焦显微镜标本制作 2.2项下的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的培养皿,PBS 反复冲洗,洗去未粘附细菌,吸水纸吸干多余水分。PBS洗片后,加入5mlFITC,于4?闭光染色30分钟;再次洗片后加入5mlPI闭光染色30min,PBS 冲洗后吸干多余水分,用于CLSM观察。 2.2.3 激光共聚焦显微镜荧光显色原理: 本研究采用荧光染料FITC和碘化丙啶(PI)分别标记多糖和细菌,FITC可与多糖结合发出绿色荧光,PI进细菌胞内与DNA结合使其发出红光。细菌在未形成BBF时,无多糖成分,CLSM观察不显示绿色荧光。根据荧光显色程度不同,判断不同培养时间细菌的数量多少及BBF是否形成。 结 果 1 不同培养时间大肠杆菌和金黄色葡萄球菌SEM结果观察 1.1 大肠杆菌SEM结果观察 图1-1:大肠杆菌培养6h SEM观察 图1-2:大肠杆菌培养12h SEM观察 图1-3:大肠杆菌培养18h SEM观察图片 图1-4:大肠杆菌培养24h SEM观察 图1-5:大肠杆菌培养48h SEM观察 SEM对大肠杆菌观察结果显示:随着培养时间的增加,大肠杆菌数目逐渐增多,当培养12h时,细菌仍旧完全处于游离状态,未形成生物膜。当培养至18h时,大肠杆菌开始互相聚集,粘连,初步形成生物膜,但是数量较小,当培养至24h时,大多数大肠杆菌聚集形成生物膜,当培养至48h时,生物膜的数量继续增加,但是细菌死亡数目也逐渐增多,从图中可清晰的看见死亡破碎的细菌。 1.2 金黄色葡萄球菌SEM结果观察 图1-6:金黄色葡萄球菌培养6h SEM观察 图1-7:金黄色葡萄球菌培养12h SEM观察 图1-8:金黄色葡萄球菌培养18h SEM观察 图1-9:金黄色葡萄球菌培养24h SEM观察 图1-10:金黄色葡萄球菌培养48h SEM观察 SEM对金黄色葡萄球菌结果观察可知:随着培养时间的增加,金黄色葡萄球菌数目逐渐增多,当培养至18小时后,可清楚的看见部分金黄色葡萄球菌开始互相聚集,粘连,但是依旧有很多游离细菌(图1-8)。当培养至24h,金黄色葡萄球菌互相聚集,粘连数目明显增多,已形成较成熟的生物膜(图1-9),整个SEM视野内均可见大部分细菌均聚集成团,形成生物膜。到达48h时,生物膜的数量继续增加,聚集成片,形成一簇一簇类似“葡萄串”形状的生物膜。 2 大肠杆菌和金黄色葡萄球菌CLSM结果观察 2.1 大肠杆菌不同培养时间CLSM结果观察 图1-11A 图1-11B 图1-11C 图1-12A 图1-12 B图1-12 C 图1-13 A 图1-13B图1-13C 图1-14A 图1-14B 图1-14C 图1-15A图1-15B 图1-15C 图1-11~图1-15:大肠杆菌培养6h,12h,18h,24h,48h时CLSM采集的图像(经FITC和PI双染后,每幅图A列为多糖成分发出绿色荧光,每幅图B列为细菌发出红色荧光,每幅图C列为图A与图B叠加后的图像)。 大肠杆菌CLSM结果如上述图所示。随着培养时间的增加,红色荧光不断增强,说明浮游细菌不断增多;培养至12h时,仍无绿色荧光(图1-12A),说明此时大肠杆菌没有形成BBF,当培养至18h时,开始出现微弱的绿色荧光(图1-13A),说明开始有微量的BBF生成。培养至24h时,绿色荧光最强。通过计算机分层扫描,比较大肠杆菌24h BBF(图1-14)不同层次的断面,发现生物膜内的细菌分布是中间层较厚并较致密,表层和基底则相对较少。提示此时BBF已分化成熟;培养至48h时,BBF体积继续增大,数量继续增多,分散更广(图1-15C)。 2.2 金黄色葡萄球菌不同培养时间CLSM结果观察 图1-16A图1-16B 图1-16C 图1-17A 图1-17B 图1-17C 图1-18A图1-18B 图1-18C 图1-19A 图1-19B图1-19C 图1-20A 图1-20B图1-20C 图1-16~图1-20依次为金黄色葡萄球菌培养6h,12h,18h,24h,48h时CLSM采集的图像(经FITC和PI双染后,每幅图A列为多糖成份发出绿色荧光,每幅图B列为细菌发出红色荧光,每幅图C列为图A与图B叠加后的图像)。 金黄色葡萄球菌CLSM结果如上述图所示。在接种后6h时,只有少量细菌粘附于培养皿表面(图1-16B),出现部分有几个细菌形成的小菌落,未见绿色荧光(图1-16A),表明无多糖成份形成;在培养12h后,大视野可观察到粘附细菌菌量开始增加,放大单个菌落后,仍看不到明显的绿色荧光(图1-17A),接种18h后的菌落可见绿色荧光(图18-A),BBF的多糖基质已开始逐步增多(图18-C);当培养至24h后,绿色荧光继续增强(图1-19A),提示此时生物膜已分化成熟;在培养48h时生物膜结构比较分散,且体积较小,除生物膜结构外,仅见少量粘附细菌(图1-E);而培养到了的48h,生物膜体积比24h大,绿光继续增强(图20-A)但是 总数量较24h少很多。 讨 论 1 临床上治疗BBF引起的相关感染时,常需反复观察药物对BBF的清除情况。在建立体外BBF模型时,也需要一定的辅助手段来 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 细菌是否成膜。目前应用的BBF的检测方法有染色法、荧光法、银染法、SEM和SCLM等方法。 2 染色法,荧光法作为传统的检测方法一直应用,该方法简便快捷,适用于试管及96孔板法造膜。Kaplan[50]等也曾用该法对在聚亚氨酯软管上的生物膜进行定量。但是其检测结果不稳定,干扰因素过多,判断结果存在一定误差。银染法与SEM和SCLM相比,具有操作简便,价格低廉等优点,可用于实验室常规操作。银染法准确度不如SEM和SCLM,并未得到推广。 3 本实验室采用96微孔板法造膜,传统的结晶紫法染色,通过肉眼观察及酶标仪测定OD值的结果判定是否成膜,这样判定方法简便可行,但是不能从微观上观察是否成膜,所以通过SEM与CLSM对BBF观察,弥补了这个不足。 4 扫描式电子显微镜的电子束不穿过样品,仅在样品表面扫描激发出次级电子而成像。图像有很强的立体感,在生物膜研究初期提供了直接形象的外观资料[51]。缺点是SEM需要在真空条件下进行,样品制备工艺复杂,过程需要脱水,很难观测到活的生物。本论文通过对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌SEM图像观察,可清晰看到细菌随着培养时间的增加,相互聚集,组建粘连,渐渐形成BBF。 5 CLSM采用激光作为光源,在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置,并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。通过激光扫描共聚焦显微镜,可以对观察样品进行断层扫描和成像,无损伤的观察和分析 样本 保单样本pdf木马病毒样本下载上虞风机样本下载直线导轨样本下载电脑病毒样本下载 的三维空间结构,同时,SCLM可对BBF内的多糖与细菌 进行分别标记,观测,进行分析,具有电镜和普通光镜无法比拟的优势[52]。本实验采用CLSM对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌进行分析,使用荧光染料FITC和碘化丙啶(PI)分别标记多糖和细菌,根据BBF形成可分泌多糖基质的原理,以多糖的形成及荧光显色判定BBF形成。直接观测到细菌在不同培养时间的是否形成BBF。 6 本实验通过对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌SEM及CLSM观察,确定了大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在24h即可形成BBF。为BBF的体外模型的完善提供了必要条件。完善了实验室建立的体外BBF模型,证实了微孔板法培养细菌形成BBF的可行性。 第二章 具有抗菌作用的中药单体及人参皂苷对细菌及BBF抑制作用 材料与方法 1 材料 1.1 菌株 大肠杆菌(1.1369):中国科学院微生物研究所;金黄色葡萄球菌1.0089:中国科学院微生物研究所; 1.2 药材与试剂 人参根总皂苷、人参茎叶皂苷:实验室提取;脱氧胆酸钠:北京鼎国生物技术有限责任公司;结晶紫:天津市华东试剂厂;大黄酸、和厚朴酚、黄芩素均购于中国药品生物制品检验所。 1.3 培养基 营养肉汤培养基:北京美坛公司;琼脂粉:北京鼎国生物技术有限责任公司。 1.4 仪器设备 二氧化碳培养箱:日本三洋电器有限公司;台式恒温振荡器(THZ-L):太仓市试验设备厂;双人净化工作台(SW-CJ-ZD):苏州净化设备有限公司;立式压力蒸汽灭菌器筒(01J2003-04):上海东亚压力容器制造有限公司;细菌浊度仪(WGZ-3-XJ):上海晰瑞仪器仪表有限公司;酶标仪(MK3):热电上海仪器有限公司;超低温冰箱:日本三洋电器有限公司;96孔细菌培养板:海门市天龙实验器材制造厂。 1.5 实验试剂及样品的配制 1.5.1 液体培养基的配制: 称取肉汤培养基8g,置1000ml量瓶中,加蒸馏水至刻度.,摇匀即得。 1.5.2 固体培养基的配制: 称取琼脂1.2g,置100ml的液体培养基中,100?水浴加热溶解。 1.5.3 结晶紫的配制: 称取结晶紫0.2g,加蒸馏水适量,制成浓度为0.2%的结晶紫溶液。 1.5.4 脱氧胆酸钠的配制: 称取脱氧胆酸钠1g,加蒸馏水适量,制成浓度为1%的脱氧胆酸钠溶液。 1.5.5 对照品的配制: 精密称取注射用头孢呋辛钠1mg,用灭菌蒸馏水定容至1ml,制成浓度为1mg/ml的阳性对照药品。 2 方法 2.1 菌液的制备及样品对细菌菌液的作用 2.1.1 菌液的制备 将大肠杆菌(金黄色葡萄球菌)活化,挑取3-4个菌斑接种于5mlNB液体培养基的试管中,37oC摇床震荡培养至对数中期,用细菌浊度计调大肠杆菌(金黄色葡萄球菌)菌悬液浓度为0.5McF,备用。 2.1.2 样品对细菌菌液的作用 将上述菌液用NB液体培养基稀释100倍,与样品及对照品按如下方法加入。设定96孔板1-4列为空白组,5-8列为样品组,9-12列为阳性对照组。1-4列每孔加入100μl菌液,5-8列每孔90μl菌液+10μl样品,A-H行样品浓度依次倍比稀释,浓度依次为1000μg/ml,500μg/ml,250μg/ml,125μg/ml,62.5μg/ml,31.25μg/ml,15.63μg/ml,7.82μg/ml。9-12列每孔90μl菌悬液+10μl头孢对照品,A-H行头孢浓度依次倍比稀释浓度分别为100μg/ml,50μg/ml,25μg/ml,12.5μg/ml,6.25μg/ml,3.125μg/ml,1.5625μg/ml,0.782μg/ml。将96孔板置于恒温培养箱培养24h,取出,倒出液体,蒸馏水反复清洗,置37?烘箱中烘干,每孔加入结晶紫150μl,染色30min,蒸馏水冲洗。加入脱氧胆酸钠150μl,脱色30min