【doc】孕早期人母—胎免疫耐受机制的研究

【doc】孕早期人母—胎免疫耐受机制的研究 孕早期人母—胎免疫耐受机制的研究 一 , . 200. 生殖免疫 . f 孕早期人母.胎免疫耐受机制的研究 蔡琳李大孙晓溪王明雁(上海医科大学妇产科医院生殖免疫室,上海2oco11) 中国图书分类号R371.34 摘要目的:探讨孕早期母胎免疫耐受调节机制.方法:应用流式细胞仪分析(FACS)蜕膜及孕妇外周血淋巴细胞亚 群;采用改进的乳酸脱氢酶释放试验测定蜕膜淋巴细胞对的自然杀伤活性;同时以滋养细胞与蜕膜淋巴细胞共同培养,研 究母体免疫系统对滋养细胞抗原免疫应答状态.结果:蜕膜组织中CD56NK细胞含量高于孕妇及对照组外周血CD56细胞 比例(P<0.05);蜕膜组织中NK细胞杀伤活性阴显低于孕妇及对照组外周血NK细胞杀伤活性(P<0o5);滋养细胞抑制母 方淋巴细胞增殖反应(P<0.05).结论:滋养细胞调低蜕膜淋巴细胞增殖反应,蜕膜CD56NK细胞自然杀伤活性受抑制,可 能是维持正常妊娠的重要机制. 关键词!呈塑婆董塑堕蛭蓝丝耐曼 Investigationofmaterno-fetalimmunotoleranceinhumanf'rrsttrimesterpregnancy CA/Lin,Da--Jin,SUNXiao-Xi"a1..lmmanology,lnstiuteofObs/C,yn,ShanghaiMedicalU ni— versity,S,200o11 Al~tractObjective:Toinvestigate咖把}0一曲im『rn1r町onm.c}l毗lismiILhuman 喊trimesterpmgnar~.Methods:ThesL出.出 ofdecldualIy.TyandPeIleIbloodlymphccytes(PBL)myedbyFACStestTheproliferativere ~cfionof?mixedcuhu~eof deciduallymphccytestottophocytesinvestigatedinanassayanalogousIool1ewayiliadlym phoc~tesreor-.Results:CD56ceils~'fimt ?州erdec/dualI1i曲erthantheseofPBLfomthepregnm~two?landtheI脚ltIlyfertilew0 ??瞰(P<005).1kNKcytotoxicit~of firstlrinl~te.rdeciduMislo~erthantheseofPBLfrompregllslltrrIanandcontrol(P<0.05). Tedtheprolif- etmic~ofdeclduM?p}归 (P<0.o5).Cot~OIlIItisduetotheimemelionbetweentrophoeytesandCU66NK-cdlsinde ciduMthat thematemo-fetaltmmunotderanceismaintained. KeywordsFirstU'JlII~~~2rpregnancyTrophoblastdeddualImmmaotolexanc~ 正常妊娠,母体对胚胎存在复杂的免疫应答和免 疫调节机制.滋养细胞侵袭蜕膜化的子宫内膜及其 血管形成胎儿胎盘单位,滋养层蜕膜局部的免疫学研 究倍受关注.本研究分析蜕膜淋巴细胞亚群分布及 自然杀伤活性,同时采用类似混合淋巴细胞培养的增 殖试验探讨母胎局部及系统免疫耐受调节机制. 1材料与方法 1.1材料8—12w龄正常妊娠人流绒毛,蜕膜组 织及外周血标本由本院门诊手术室提供. 1.2方法 1.2.1蜕膜淋巴细胞,滋养细胞的分离肉眼分离 新鲜蜕膜及绒毛组织,无菌操作,用PBS洗3次,剪 碎成直径1n一大小.用0.25%胰蛋白酶,15U/ml 作者茼介:桀琳.女,26岁,硕士.住院医师.现在上海市第六人民 匿院工作 通讯作者:李大金.43岁.教授,博士导师.主要从事生殖免疫等研究 DNase-137消化1h,离心后过100目筛,取细胞悬液 进行5%一75%~zeoll非连续密度梯度离心,收集界面 细胞(滋养细胞:35%,55%;蜕膜淋巴细胞:45%, 60%),离心洗涤配成1×1浓度,. 1.2.2外周血淋巴细胞的分离用肝素抗凝的人外周 血8—1O,以Hank'8液2:1稀释,加至淋巴细胞分离 液上,200d.fin离心20rain.收集界面细胞,洗涤离心 配成1×浓度. 1.2.3NK细胞杀伤活性测定采用LDH释放试验测 定杀伤效果.以细胞(上海细胞生物所提供)为 靶细胞,按效靶比例10:1加入蜕膜或外周血淋巴细胞, 在96孔培养顿E按常规进行,每组均做3复孔.培养 22h后加LDH基质液,显色,测定光吸收值(A). 实验组培养组靶细胞自效应细胞自 NK细胞杀一 ^值^值一然释放A值一然释放A值 伤活性{%)————]曩丽郾——甄丽.百一—— 太释放A值一然释放^值 1.2,4GD56,CD3细胞百分含量测定将蜕膜 4 或外周血淋巴细胞先与NK,CD3F1TC和抗小鼠tgG 的FITC37?孵育30min,洗涤后,用美国BECTON DICKINSON流式细胞仪分析,每个样品含40(30个 细胞…o 1.2.5类似混合淋巴细胞反应试验(MLR)滋养 细胞作为刺激细胞,蜕膜淋巴细胞,母方外周血淋巴 细胞为反应细胞,调节细胞浓度1x1旷,各取0.1ml 加入96孔培养板,每组3复孔(刺激细胞先经50 IIll丝裂霉素37.c处理30min),5%37.c温箱孵育 5d,培养结束前l8h加H-TdR0.6mu/孔.收集细 胞于净化滤纸片,加闪烁液,置0射线计数仪测定 CPM值. 1.3统计学处理测定数据采用均数?标准差( ?),组间比较采用f检验及配对f检测. 2结果 2.1流式细胞仪分析蜕膜及外周血淋巴细胞亚群 孕早期蜕膜组织中NK样细胞比例高于其外周血 及对照组外周血比例(P<0.05).早孕妇女与非孕 妇女外周血比较无显着性差异(见表1). 2.2NK细胞杀伤活性的测定孕早期蜕膜组织 . NK细胞杀伤活性明显低于其外周血及对照组外周 血NK细胞杀伤活性(P<O.05),孕妇外周血与非孕 妇女外周血无显着性差异(见表2). 2.3蜕膜淋巴细胞反应性滋养细胞及母方外周 血淋巴细胞不能刺激蜕膜淋巴细胞产生增殖反应 (P>O.05),父方外周血淋巴细胞能有效刺激蜕膜 淋巴细胞及母方外周血淋巴细胞的增殖(P< O.01);但对后者的刺激强度明显高于前者(见表 3). 2.4滋养细胞抗原刺激性滋养细胞不能有效刺 激父方淋巴细胞增殖反应(P>0.05),对母方外周 血淋巴细胞则抑制其增殖反应(P<0.05)(见表 4). 表1FAC$分析淋巴细胞亚群cx-?,%) Tab.1FACE?出0f珥h0哪e(?,%) ?e}1),2)cI耐withtheo~hcr咖哪p吕.P<O05 201 表2蜕膜淋巴细胞杀伤活性(i?s,%} Tab.2NKeyto~atyofdeeidual叫ocyc?.%) Note:1)?呷町dwtheodlernm椰.P<0. 表3蜕膜淋巴细胞反应性(?,%} Tab.3resptll~ofdeeiduall邶叩啪(?.%) Ne:日.stands[orr?.rstar,&for?lvecell9.PBLstandsh phe埘bloodl伸咖1),2)c邮u耐?吐Ldc~dunl[ympho一 州e9~ontr~.P<001 表4滋养细胞抗原刺激性(j?s,) Tab.4aId姆of0Ptcx?.%) Grotrp(1艘cPM Note:saand~f讲atimulatingc,r日rLdBf讲rveeell~. PBL.imands forp啊'ebloodIy口甲|L0yt髓i1).0pmam-oa]PBLcon一 .P<005 3讨论 3.1早孕蜕膜CD56NK样细胞自然活性本研究 采用FACS分析妊娠早期蜕膜局部和外周血CD3 和CD56'细胞亚群分布情况,结果与有关文献报道 基本一致:孕早期蜕膜局部淋巴细胞以CD56细胞 为主,而外周血以CD3'细胞为主.提示蜕膜局部 聚集的CD56NK细胞可能在母胎免疫调节中起重 要作用.蜕膜局部与外周血细胞自然杀伤性的比 较,前者明显低于后者,与King等人试验结果一致. 蜕膜局部自然杀伤活性被抑制,可能是维持正常母 胎界面免疫耐受的机制之一_6.. 3.2滋养细胞一蜕膜淋巴细胞混合淋巴细胞反应 本研究发现滋养细胞对蜕膜淋巴细胞和母方外周血 淋巴细胞体外实验不具抗原刺激性,因此,母体在全 身和蜕膜局部不存在针对滋养层细胞的经典免疫应 答,此与King等人研究一致J.滋养细胞抑制母 方外周血淋巴细胞的增殖反应,可能因为滋养细胞 提供了降调节信号,推钡4与滋养细胞表面表达的限 制性HLA—G有关.体外培养,母方外周血淋巴细 胞再度接触滋养细胞抗原产生对抗原不敏感状态; 而父方未接触过胚胎抗原,表现为滋养细胞不刺激 也不抑制其增殖反应. 蜕膜淋巴细胞对父方外周血淋巴细胞的反应性 远低于母方外周血淋巴细胞的增殖反应,此项结果 与Kingbj,I~lincheva和Deniz'等一致"".推测蜕膜 淋巴细胞类似其他粘膜上皮细胞,如小肠,同种抗原 信号不能刺激免疫活性细胞克隆增殖.其机制可能 是克隆无反应性或者抑制作用被活化.蜕膜淋巴细 胞低反应还可能与坩T细胞表面TCR/CD3复合物 低表达有关.滋养细胞与蜕膜淋巴细胞之间复 杂的相互作用,可能是胎儿免受母体免疫攻击的重 要机制. 4参考文献 1smm?ns"J'agels.ArI曲Ea/Itlt~rleukin-Imat髑p?- ul,gl~dinEpmdu~hyHunutnn呷h0bdh6?m~u-~tandthird一 T【幽J口inEndcerino?【丑b.1995;8o:1641 2Fled]PL,m?JR,mM#a//rtterleukin?1reeepWr蛐一 ni~t(IL-lra)produclionhybunumamni~.ehoff0玎,anddeeidLIa.AmJ ‰删Imnmnol,1~5;32:I 3称根林.胡延仪.罗丽萍^外周血天然杀伤细胞活性的测 定方法.中华劳动卫生职业病杂志.19919(3):173 (Ja接第189页) 况,可能与在该剂量时溶栓速度快,效率高有关.从 表中可知,早在溶栓的第l小时溶栓率已达61.8%, 第2小时83.9%,而我们检测纤维蛋白原浓度是在 溶栓开始后4h,血栓溶解后释放至血浆中被激活的 纤溶酶在此之前已开始降解纤维蛋白原,导致浓度 下降的缘故.由于本研究中,比较溶栓效率时采用 的活性单位较低,在溶栓4h检测纤维蛋白原浓度 时uPA各剂量点尚不足以大量地激活纤溶酶,因此 除了产生较低的溶栓率外,也未引起纤维蛋白原浓 度的下降.本研究将为抗体导向溶栓剂的进一步临 床研究提供了可靠的实验依据. 4参考文献 1wu』c.HeGR.WuGx.Rad珊棚nmng既嗍【a】 4陆卧RA,h.Pc,嗍wPQ如er州晰 肿口0f}IIl嗍TlF叩t墨帖r叫b【蛐inpep|咀 /o1oo5.PmcH.d^o-dSe;UsA.1980;7749l4 5KingA,G岫d船L,Yw.}nd叼懈.jonot砌 哲meinre~ometoe日由au0嘴n呷h出叫k目eneip}?cI|l ob出':JR卑l硼Il10I,1996;3~ff/ 6KingA,Bi岫C,LdYwF~'lyhum瞰deeid~odbe~.ibitNK?P w哼lIleK,屺.dllbatnotI时fimuim~er—d山t Ce吐ln?_1I?1.I989:118:337 7N~ekiS,sedeRF.曲】Ijkm叮(NK)oeu出0fIir订imeF hu咖n如dd恤.Ge?I衄r眦.1989;12:l66 8lx,keYw,^,1DB.Beclau~inhu嗍吐柚L_啪.Hurrlml Rph_?,1995;硼l2:15 9删L.dm0,Yal鸬CM.15mleeti~rL曲皿IblJ甘 edl-~eHL^?础.Sei~ee,1996; 274:792 lOMinch忸NL,H皿埘址曲舯S.H蛐曲叫b砌MLm叽d眺 l即l=0t船6砌yl:eegn~eycontainhi??nb啪帕】B盯d 】ec山叩0f婶.JImr仙,1992i149: 瑚 l1D口,izC,Cl】rj咖哪SE,BrRd.Ptb咄舯d|d呻loellu 1Brd蜘kIII1?c一blood 口懒.jb蜘I,l9;152:4255 l2KD.QRL.C1gSRd凸删出2椭0f嘧T 她mlIlem~-fetdinterface.Jr山『d,1992;l49:2g72 [收稿1991~-12-12侈回]999-06-]0] (编辑徐杰) a?制盯d?minl1edI?'0d_盹_ ?pll~te!et丑n1.MIdNedc0删.1993:14:l嘟 2杜鸨,余瑞荣,华子春d抗人活化血小】匮单克l蕾抗体与犀 激酶杂台分子的纤蒋作用.中国科学(B辑).1993:?(1):32 3刘征辉,万海英,王斌d.重组抗体—尿澈酶导向格栓剂的蓦 囡梅建及表选.生物化学与生物物理,19鳃:30I6):6o1 4nrPJ.SpeckLCPs~in盯d础呲r啮?tI-'- j呐e,1,3,4,6一hl3..db一,l】riI. p}嘲j出h血.功0ch如B咄pR器c0『硼瑚,l哪;80:849 5韩索文,余炜榴【.李秀珍d.培养细胞分泌的血纤维蛋白藩酶 原激活物的研究.军事医学科学院院刊,1987;10(2):l0l [收稿19'99-06-10修回1999-11.25】 (编辑张慧)