椰酵假单胞菌与唐菖蒲伯克霍尔德菌16S_23SrRNA基因间区序列的比较研究

椰酵假单胞菌与唐菖蒲伯克霍尔德菌16S_23SrRNA基因间区序列的比较研究 论著 椰酵假单胞菌与唐菖蒲伯克霍尔德菌 16S,23S rRNA 基因间区序列的比较研究 焦振泉 曹 玮 余东敏 刘秀梅 王晓英 ()中国疾病预防控制中心营养与食品安全所 , 北京 100050 摘 要 :目的 研究比较我国分离的椰酵假单胞菌与唐菖蒲伯克霍尔德菌不同致病型菌株的 16S,23S rRNA 基因 间区序列 ,分析不同菌株基因水平的差别 ,并阐述其系统发育关系 。方法 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 2 对伯克霍尔德菌属特异引物 ,扩 增 16S,23S rRNA 基因间区序列 。应用分子生物学软件 ,对 3 株分别代表唐菖蒲伯克霍尔德菌 3 种不同致病型的 (() ) 国际参考菌株 ATCC10248 、NCPPB 947 、NCPPB3580、1 株伯克霍尔德菌属 B . phenazinium 种代表株 LMG2247及 8 株 ( () () ) 从我国不同地域 、不同食物样品中分离的椰酵假单胞菌 HN2y 、Co14 、Co8 、Co36 、Sx8801 、90 - 3 、56 2、56 2的 16S ( ) ,23S rRNA 基因序列进行测定 ,并与核酸数据库 GenBank中相关菌株序列进行比较分析 。结果 通过不同菌株16S,23S rRNA 间区序列的分析比较 ,发现分离的椰酵假单胞菌米酵菌酸产毒株存在 2 个序列高可变区及特异基 因序列 ,阐述了我国椰酵假单胞菌与唐菖蒲伯克霍尔德菌的系统发育关系 ,将 DNA 测序结果在核酸数据库中注 册 ,并绘制了系统发育进化树 。结论 该研究结果为进一步鉴定椰酵假单胞菌米酵菌酸产毒株 ,从分子水平探讨 其产毒机制及系统发育关系提供了新的 、可靠的理论依据和技术支撑 。 关键词 :假单胞菌属 ; 伯克霍尔德杆菌 , 唐菖蒲 ; 基因 , rRNA ; 研究 ; 配对分析 Study on Comparison of 16S,23S r RNA Gene ISR Sequence of Pse udomonas cocove ne na ns subsp f a ri noferme nta ns Stra ins and B urkholderia gla dioli Stra ins J IAO Zhen2quan , CAO Wei , YU Dong2min , L IU Xiu2mei , WANG Xiao2ying ()National Institute for Nutrition and Food safety , Chinese CDC , Beijing 100050 , CHina Abstract : Objective To study and analyze the differences among the strains in the genus B urkholderia at gene levels by ( ) comparing 16S,23S rRNA gene intergenic spacer region ISRsequences of Pseudomonas cocovenenans subsp f arinofermentans strains isolated in Chinese foods and B urkholderia gladioli model strains. The phylogenetic relationships of them were expounded. Method Two pairs of specific primers for the genus B urkholderia were designed and 16S,23S rRNA gene ISR sequences were amplified for the strains. 16 - 23S rRNA gene ISR sequences of 3 international reference strains representative of the three different ( ) pathogenic strains of B urkholderia gladioli ATCC10248 , NCPPB 947 , NCPPB3580, and 1 strain of B . phenazinium () ( LMG2247and 8 strains of Pseudomonas cocovenenans subsp f arinofermentans isolates HN2y 、Co14 、Co8 、Co36 、Sx8801 、 ( ) ( ) ) 90 - 3 、56 2、56 2from the different samples of food2poisoning in China were determined. The total sequences were compared and analyzed with the relative strain sequences in the GenBank by the molecular biological analyzing software . Results Two highly variable ISR regions and the DNA specific sequences associated with isolate strains produced the Bongkrekic acid were found. The results of the DNA sequences were submitted to the GenBank. The phylogenetic tree of the isolates and the B urkholderi gladioli were illustrated. Conclusion New and reliable theory and technology supports were provided for the further study of the identification of Pseudomonas cocovenenans subsp f arinofermentans isolates produced Bongkrekic acid , research into their mechanisms in molecular levels and their phylogenetic relationships. Key word : Pseudomonas ; Burkholderia gladioli ; Genes , rRNA ; Research ; Metched2Pair Analysis ( ,平均死亡 银耳 、酵米面 、醋凉粉及马铃薯粉等食物 椰 毒 假 单 胞 菌 酵 米 面 亚 种 Pseudomonas ) cocovenenans subsp f arinofermentans 简 称 椰 酵 假 单 胞 率高达 41180 % , 是迄今我国病死率极高的一种微 菌 ,是我国学者发现的一种食物中毒菌 ,主要污染鲜 生物性食物中毒 。经研究证实 ,该菌产生的毒素米 () 酵菌酸 Bongkrekic Acid , BA是引起食物中毒和死 亡的主要毒性代谢产物 。肝 、脑 、肾等脏器是该毒素 ()基金项目 :教育部回国启动基金和国家自然科学基金 30571575 作用的靶器官 。米酵菌酸是一种不饱和脂肪酸 ,有 作者简介 :焦振泉 男 博士 副研究员 关他的致病机制还不是很清楚 。在对全国酵米面 、 通讯作者 :王晓英 女 研究员 银耳等食品进行的椰酵假单胞菌及其毒素污染调查 ,设计属特异引物 ,利用 PCR 、扩增产物测序分析 础 中发 现 , 在 鲜 银 耳 中 , 椰 酵 假 单 胞 菌 的 检 出 率等技术 ,对椰酵假单胞菌分离株及唐菖蒲伯克霍尔 4104 % ,而检出毒素的阳性率为 8121 % ,这 说明 关于失联党员情况说明岗位说明总经理岗位说明书会计岗位说明书行政主管岗位说明书 并非 德菌不同致病型菌株 DNA 序列进行比较分析 ,以鉴 所有椰酵假单胞菌都能产生米酵菌酸 。1999 年有 定对人致病的产毒株 ,并绘制系统发育进化树 。 学者根据细菌的系统分类将其划归为唐菖蒲伯克霍 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 和方法尔德菌的一个病原型 。 唐菖蒲伯克霍尔德菌是一 种植物病原菌 ,常常 111 材料 导致谷类等腐烂 。唐菖蒲伯克霍尔德菌包括 3 个不 11111 菌株及生长条件 选用不同食物来源的椰 酵同的致病型菌株 ,分别来源于腐烂的树叶 、洋葱和蘑 假单胞菌分离株 、唐菖蒲伯克霍尔德菌 3 个不同 致菇 。已经有研究发现其与人类的肺部感染有关 ,如 病型菌株 、椰毒伯克霍尔德菌模式株 、伯克霍尔德 慢性肉芽肿和胆囊纤维化等 。在我们的研究中发 菌属其他菌及阴性对照菌 ,共计 16 株 。唐菖蒲伯克 ( ) 现 ,椰酵假单胞菌和唐菖蒲伯克霍尔德菌致病型菌 霍尔德菌 B . gladioli pv gladioli 模式株 10248 和椰 株的典型株在生化特征上差异极微 。在产毒培养和 毒伯克霍尔德菌模式株 9450 分别来源于美国菌种 () 急性动物实验中发现 ,前者产生的米酵菌酸能够使 保藏中心 American Type Culture Collection , ATCC和 ( 小鼠致死 ,而后者则不能 。目前已知椰酵假单胞菌 英 国 工 业 菌 种 保 藏 中 心 National Collection of ) 能产生米酵菌酸 Industrial Bacterial ,NCIB,,但唐菖蒲伯克霍尔德菌不同致病 唐菖蒲伯克霍尔德菌另 2 ( 型菌株是否产生米酵菌酸还没有确定 。 种 致 病 型 B 1 gladioli pv alliicola 和 B 1 gladioli pv ) agaricicola参考菌株 947 和 3580 皆来源于英国植物 利 用 细 菌 16S , 23S rRNA 基 因 间 区 序 列 ( ) Intergenic Spacer Region , ISR来鉴别遗传关系上相 ( 病原 菌 菌 种 保 藏 中 心 National Collection of Plant1 近的菌株是目前的国际研究热点,可利用其对唐 ) Pathogenic Bacteria ,NCPPB,伯克霍尔德菌属中其他 菖蒲伯克霍尔德菌不同致病型菌株进行鉴定 ,特别 种 B phenazinium 代表株 LMG2247 来源于日本岐阜 是对于米酵菌酸产毒株和不产毒株的鉴别 。有关这 大学 ,阴性对照菌株大肠杆菌 52922 来源于中国医种细菌不同致病性菌株鉴定方面的研究国内外尚未 ( ) 学菌株保藏中心 CTCC,10 株椰酵假单胞菌分离菌见报道 。所以很有必要对唐菖蒲伯克霍尔德菌不同 株分别来源于国内各类中毒食物及正常食物样品 。 致病型菌株的产毒性能进行研究 。考虑到米酵菌酸 所有菌株来源及特性详见表 1 。除大肠杆菌用营养 的毒性极强 ,所以对不同致病型菌株的鉴别就显得 琼脂培 养 外 , 其 余 菌 株 均 生 长 于 土 豆 培 养 基 琼 脂非常迫切和重要 。 ( ) PDA斜面 ,于37 ?培养 18,24 h ,置4 ?保存 。 本研究将以 16S,23S rRNA 基因间区序列为基 表 1 实验菌株的来源及特性 ( )产毒特性 米酵菌酸 菌株 序号 菌株号 来源 样本来源 a1 美国 Leaf ATCC 10248 参考菌株 ( ) 不产毒 或弱产毒 a洋葱 英国 英( ) 不产毒 或弱产毒 2 NCPPB 947 国 英国 蘑菇 a( ) 不产毒 或弱产毒 3 NCPPB 3580 河南 黑发酵椰子 正常鲜银a + 4 NCIB 9450 龙江 辽耳 酵米面中毒样品 a + 国内分离 5 HN2y 宁 吉林 酵米面中毒样品 酵 a 的椰酵假 + 河北 6 Co14 米面中毒样品 变质 单胞菌 a + 银耳中毒样品 酵米7 Co8 面中毒样品 凉粉中a + 8 Co36 毒样品 正常酵米面 a + 9 1A 正常酵米面 正常酵 a + 10 90 - 3 米面 a + 陕西 11 Sx8801 土壤 a ( ) 不产毒 或弱产毒()12 1 2 a ( ) 不产毒 或弱产毒()河北 13 56 2 a( ) 不产毒 或弱产毒 河北 () 14 56 5b - 日本 其他 LMG 2247 15 b - CTCC 16 大肠杆菌 52922 ( ) 根据菌株背景 资料 新概念英语资料下载李居明饿命改运学pdf成本会计期末资料社会工作导论资料工程结算所需资料清单 。CTCC :中国医学菌株保藏中心 。 ; b 注 :米酵菌酸测定 a 薄层层析 TCL法及动物实验 ,见参考文献2 ,3 ,43 11112 主要试剂和仪器 10 ×PCR 缓冲液 、Taq 酶 、 MS2 为德国 IKA 公司产品 。 涡混合器 dNTPs 、DNA 分子量 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 品和细菌染色体 DNA 提取 11113 DNAman 510 及 TreView32 分子生物学分析 试剂盒购于美国 Promega 公司 ; 琼脂糖和溴化乙锭 软件均为美国 Lynnon Biosoft 生物软件公司产品 。 ( ) 112 方法EB 购 于 美 国 Sigma 公 司 ; 测 序 反 应 试 剂 AB I R? TM PRISMBigDyeTerminator Cycle Sequencing Ready 11211 PCR 引物设计 以伯克霍尔德菌属及相近 R? Reastion kit with Amplitaq DNA polymerase FS 购于美 菌属的 16S 和 23S rDNA 基因及其间区序列为基础 , 国 PERKIN ELMER 公司 ; 测序引物分别为 Pgla 2 - 应用 DNAman 软件检索基因数据库 ,比较数据库中16S 和 Pgla 1 - 23S ,序列见表 2 ; PCR 扩增仪为德国 相关株菌的 16S,23S rRNA 基因核苷酸序列 ,根据 Whatman Biometra 公司产品 ;自动凝胶成像系统为美 引物设计原则 ,设计并筛选出 2 对伯克霍尔德菌属 国 Bio - Rad 公司产品 ;恒温振荡培养箱 THZ - 82 江 特异性引物 Pgla 1 - 16SΠPgla 2 - 23S 和 Pgla 2 - 16SΠ TM 苏太仓医疗器械厂产品 ; 测序仪 AB I PRISM377XL Pgla 1 - 23S , 引 物 序 列 见 表 2 , 分 别 扩 增 745 bp 和 DNA sequencer 为美国 PERKIN ELMER 公司产品 ; 恒 699 bp的 DNA 片段 。 温恒流电泳仪 DYY - III - 5 型 北京六一厂产品 ; 旋 表 2 引物的名称 、来源及核苷酸序列 引物名称 来源 方向 引物序列 Pgla 1 - 16S 16S rDNA 正向 5’> ATC AGC ATG CCG CGG TGA AT < 3’ 5’> CGT CAC ACC ATG GGA GT < 3’ 正向 Pgla 2 - 16S 16S rDNA 反向 5’> TCC ACC ACA TGC ACT TGT TC < 3’ Pgla 1 - 23S 23S rDNA 反向 5’> CCA CAT GCA CTT GTT CGC TT < 3’ Pgla 2 - 23S 23S rDNA 11212 模板 DNA 的提取 用无菌吸管取011 ml 冻 件 DNAman , 分 析 所 测 菌 株 的 输 出 序 列 , 并 与 - 80 ?的 菌 液 于 PDA 斜 面 , 置 35 ?培 养 24 , Genbank 中 伯 克 霍 尔 德 菌 相 关 的 序 列 进 行 比 较 分 存于 48 h ,用接种环刮取少量培养物于无菌水中制成菌 析 ,应用 DNA Star 及 Treview 分子生物学软件 ,绘制 悬液 ,采用商品化的细菌染色体 DNA 提取试剂盒 , 系统进化树 。 μ提取 DNA 。取1 l作为 PCR 扩增模板 。 (μμ) 11213 PCR 的扩增 PCR 反应体积 50 l: 5l 102 结果 μμ ×PCR 缓 冲 液 、1l 25 mmolΠL 氯 化 镁 、012l Taq 211 PCR 反应的特异性μμ 酶 、1l 10 mmolΠL dNTPs 、1l 10 mmolΠL 引 物 对 、 分别应用 2 对引物 Pgla 1 - 16SΠPgla2 - 23S 和μμ1l 模板 DNA 和 4018l 无菌水 ,设无 DNA 的阴性 Pgla 2 - 16SΠPgla 1 - 23S ,以大肠埃希菌参考株 25922对照 。PCR 扩增条件 : 94 ?变性5 min ; 接着 33 个循 为阴性对照 ,应用唐菖蒲伯克霍尔德菌模式株 ATCC环 :94 ?变性30 s ,55 ?复性30 s ,72 ?延伸1 min , 最 10248 及 其 他 2 个 不 同 致 病 型 菌 株 NCPPB 947 和 终72 ?延伸10 min 。NCPPB 3580 、3 株从我国中毒食物样品分离的产米 11214 琼脂糖凝胶电池 取 PCR 扩增产物进行电 酵菌酸菌株 HN2y 、Co14 和 Sx8801 , 进行 PCR 扩增 , μ泳 ,每孔载样10同时以100 bp DNA Ladder 作为分子 ,筛选适合引物 ,并验证 PCR 方法的特异性 。结果表 l 量对照 。琼脂糖凝胶 、EB 染色液及电泳缓冲液的配制 明 ,所有引物对除阴性对照外 , 都可扩增出相应片 () 段 ,具有较好的特异性 。引物对 Pgla 2 - 16SΠPgla 1见文献10 。电泳条件为75 V 5 VΠcm电泳2 h , EB 染 (μ) - 23S 的敏感性好于其他引物对 ,见图 1 ,同等反应 色 015gΠml,在波长为258 nm的紫外光下 ,用自动凝 条件下 ,Pgla 2 - 16SΠPgla 1 - 23S 对菌株 Co14 可扩 胶成像系统观察 、扫描并储存电泳结果 。 PCR 产物的纯化 11215 PCR 产物的纯化和测序 增出较清晰的条带 。 和测序 , 由大连宝生物公司完成 。采用 Chromas 软 212 参考菌株和椰酵假单胞菌分离菌株的 PCR 扩 件校 对 并 输 出 PCR 产 物 序 列 。以 上 游 引 物 所 测增结果 通过比较分析 , 选择引物对 Pgla 2 - 16SΠPgla 1PCR 产物序列为正链 ,根据与下游引物所测序列逆 向互补链的重叠部分 ,以 DNAman 软件拼接出完整 - 23S ,对所有参考菌株和椰酵假单胞菌分离菌株进 的产物 DNA 序列 。 行 PCR 扩增 ,获得菌株的 16S,23S rRNA 基因间区 11216 测序结果分析 应用 Chromas 软件校对并输 DNA 片段 ,部分菌株的 PCR 扩增结果见图 2 。 出测序结果 ,在 Genbank 中注册 。应用序列分析软 213 菌株 16S,23S rRNA 基因间区序列测定及注册 菌 16S,23S rDNA 间区序列的比较 用从我国食物 样品中分离的椰酵假单胞菌与基因库中唐菖蒲伯克 霍尔德菌进行 16S,23S rDNA 间区序列比较 ,所有 菌株的 DNA 序列同源性为 89187 % ,有 2 个高可变 区序列差异较大 ,见图 3 的 a 和 b 。两个高可变区分 别在 466,485 bp 和 609,676 bp 位置 。米酵菌酸产 M : DNA marker ,100 bp ladder ; 1 、2 、3 、4 、5 、6 、7 依次为菌株 ATCC10248 、 毒株 HN2y 、Sx8801 、Co14 、Co36 在第 1 可变区存在特 HN2y 、Co14 、Sx8801 、NCPPB 947 、NCPPB 3580 和阴性对照大肠杆菌 25922 。 异序列 - TGATGAGTACACAAGTGTATT - ,另外产毒 图 1 伯克霍尔德菌 PCR 反应的特异性 株 HN2y 、Co8 和 90 - 3 在421 bp位置较其他菌株多 1 个碱基 A 的突变 ; 强产毒株 Sx8801 和 Co14 在第 2 可变 区 存 在 特 异 的 插 入 序 列 - GTAACTACTCCC TTCGGGAGTGGGACCAGAGTAAGCGCTAAAGCGCTAA CTCTGGCCGACATCAAT - 。通 过 分 析 确 证 了 椰 酵 假单胞菌米酵菌酸产毒株与唐菖蒲伯克霍尔德菌模 式株 ATCC 10248 的 DNA 序列同源性为 9213 % ,属 () () () 高度同源 ;不产毒 或弱产毒株 56 2和 56 5的序 M 为 DNA marker ,100 bp ladder ; 1 、2 和 10 分别为国际参考菌株 ATCC 10248 、NCIB 9450 和 LMG 2247 ;3 、4 、5 、6 、7 、8 和 9 依次为分 列与唐菖蒲伯克霍尔德菌模式株 ATCC 10248 的同 () ( ) ( ) 离菌株 Co8 、Co36 、Co14 、56 2、HN2y 、56 5和 1 2; 11 为阴性对 源性为 99186 % 。图中 glad 、alli 、agri 分别代表所测 照大肠杆菌 25922 。 图 2 参考菌株和部分分离菌株的 PCR 扩增结果 的菌株 ATCC 10248 、NCPPB 947 、NCPPB 3580 的 16S ,23S rRNA 基因间区序列 ,L28156 和 L28157 为 基 因数据库中唐菖蒲伯克霍尔德菌的序列 。选择有代表性的参考菌株 ATCC 10248 、NCPPB 21412 椰酵假单胞菌分离株与伯克霍尔德菌属细 947 、NCPPB 3580 、LMG 2247 和椰酵假单胞菌分离菌 菌 16S,23S rDNA 间区序列的比较 比对基因数据 ( ) ( ) 株 Sx8801 、HN2y 、56 2 、56 5 、90 - 3 、Co8 、Co14 、 ( ) 库 GenBank中存在的及我们测定的伯克霍尔德菌 Co36 的 PCR 扩增产物 , 送交生物公司进行 DNA 测 属中 14 个相关菌株和 8 个椰酵假单胞菌分离菌株 ( ) 序 。并将测序结果提交核酸数据库 GenBank进行 的 16S,23S rRNA 基因间区序列的结果表明 ,这些 注册 ,详细结果见表 3 。注册网址为 :菌株的 DNA 碱基序列同源性为 71167 % ,具有许多 http :ΠΠwww. ncbi . nlm. nih. govΠBankItΠnph2bankit . cgi 高度保 守 序 列 , 几 乎 所 有 菌 株 都 具 有 这 样 相 同 的 表 3 12 株参考菌株及分离菌株 16S,23S rRNA DNA 序列 ;另外还存在同属细菌不同种间各异的插 基因间区序列注册结果 入序列 ,插入序列的不同区域分别见图 4 中 a 、b 、c 、 基因数据库 序列长度 d 、e 。与其他种菌株相比 ,所有椰酵假单胞菌分离株 菌株名称 ( ) bp 序列号 与唐菖蒲伯克霍尔德菌序列基本一致 ,仅部分产毒 EF 552059 Sx8801 773 () 株与不产毒 或弱产毒株序列间有所不同 。尤其在 EF 552060 HN2y 681 405, 494 bp 位置 , 与伯克霍尔德菌属其他菌株相 ()EF 552061 56 2 716 比 ,椰酵假单胞菌分离株和唐菖蒲伯克霍尔德菌缺 ()EF 552062 56 5 716 失相同部分的插入序列 ,在 460,485 bp 位置的共有 EF 552063 90 - 3 687 序列仅存在 1,2 个碱基差别 ,且与同属其他种菌株 EF 552064 Co8 717 完全不同 。 EF 552065 Co14 770 215 系统进化树的绘制 为研究我国椰酵假单胞菌EF 552066 Co36 725 )( EF 552067 LMG 2247 B1 phenazinium 692 分离株的产毒株与人 ( ) EF 552068 715 NCPPB 3580 B1 gladioli pv agaricicola 类致病的唐菖蒲伯克霍尔德菌株的系统进化关系 , ( )EF 552069 NCPPB 947 B1 gladioli pv alliicola 724 通过 DNA Star 及 Treview 32 分子生物学软件 ,比较 ( ) EF 552070 ATCC 10248 B 1 gladioli pv gladioli 715 了不同食物中毒样品中分离的菌株和伯克霍尔德菌 属中相关菌株的 16S,23S rRNA 基因间区序列 ,计 214 不同菌株 16S,23S rRNA 基因间区 DNA 序列 算不同菌株之间的遗传距离 ,并绘制系统发育进化 比较分析树 ,见图 5 。 21411 椰酵假单胞菌分离株与唐菖蒲伯克霍尔德 a 为 410,419 bp和 466,485 bp位置插入序列比较 ; b 为 609,676 bp位置插入序列比较 图 3 椰酵假单胞菌分离株 16S - 23S rDNA 间区高可变区序列比较 ATCC 10248 为美国菌种保藏中心保藏的唐菖 ,他们之间的不同使其在细 目 、大小和序列已经得到 蒲伯克霍尔德菌模式株 ; agri 、alli 、glad 、phen 分别代 菌系统发育学 ,特别是相近菌种和菌株的区分和鉴 表 NCPPB 3580 、NCPPB 947 、ATCC 10248 和 LMG 定方面占据了一席之地 。细菌包含 16S rRNA 、23S 5 2247 ;L28151,L28165 分 别 为 GenBank 中 相 关 菌 株 rRNA 和 5S rRNA 基因及其 ISR。细菌不同菌株之 的 16S,23S rRNA 基因间区序列 ; 其余为我国分离 间 16S , 23S rRNA ISR 长 度 是 不 同 的 , 而 所 包 含 tRNA 的数量和类型也有所不同 ,大多数革兰阴性菌 的椰酵假单胞菌 。 Ala Ile 从进化树可以看出 ,分离菌株与本属的相关菌 的 16S,23S rRNA ISR 都含有 tRNA和 tRNA, 但 Glu 株在进化过程中主要形成 3 个分支 ,分离菌株与唐 一些其他菌只含有 tRNA。 菖蒲伯克霍尔德菌不同致病型菌株处于第 I 分支 。 1987 年孟昭赫等对以 Co8 、Co14 为代表的我国 产毒株 Co36 、HN2y 、Co14 、Sx8801 与唐菖蒲伯克霍尔 椰酵假单胞菌分离菌株进行了大量的研究工作 ,并 德菌致病型菌株 NCPPB 947 亲缘关系最近 ,产毒株 以从印尼可可豆食品中分离的中毒菌椰毒假单胞菌 ( () Co8 和 90 - 3 与之亲缘关系较近 。不产毒 或弱产 NCIB 9450 椰毒伯克霍尔德菌、铜绿假单胞菌 、洋 ) () ( ) ( ) 毒株 56 2、56 5与唐菖蒲伯克霍尔德菌模式株 葱假单胞菌 洋葱伯克霍尔德菌等为对照 ,从生理 ATCC 10248 亲缘关系较近 。 生化 、血清学 、分子杂交 、毒素的化学测定等方面进 4 行了实验。结果表明 ,这些分离菌株与椰毒假单 3 讨论胞菌一致 ,只是对侧金盏花醇的分解结果不同 ,前者 随着细菌系统分类学的发展 ,16S rRNA 序列分 能分解 ,而后者则不能分解 。1989 年刘秀梅在美国 析已经成为细菌种属分类和鉴定的标准方法 。但随 ATCC 的研究发现 , 椰酵假单胞菌在生物学性状上 着遗传进化距离的不断缩小 ,16S rRNA 已没有足够 与唐菖蒲伯克霍尔德菌 ATCC 10248 比与椰毒假单 6 ,7 的碱基差异来对特定的菌种或菌株 ,特别是相近的 胞菌更为相近 ; 邱茂锋等利用 rDNA 指纹图对椰 酵假单胞菌 、椰毒假单胞菌和唐菖蒲伯克霍尔德菌 菌种或同一菌种的不同菌株进行鉴定 。所以 16S, 2 ,8 ,9 23S rRNA 基因 ISR 以其无特定功能和进化速率比进行了研究 ,也得出相同的结论 ;焦振泉等研究 16S rRNA 大 10 倍 而 成 为 细 菌 分 类 和 鉴 定 的 新 热比较 16S rRNA 基因序列 ,对椰酵假单胞菌进行了系 1 。一 些 细 菌 的 16S, 23S rRNA 基 因 ISR 的 数 点统分类学研究 ,也得到类似结论 。 a 、b 、c 、d 、e 分别为 137,207 bp 、295,403 bp 、401,501 bp 、525,633 bp 和 679,785 bp 区间的序列比较 图 4 椰酵假单胞菌分离株与伯克霍尔德菌属细菌 16S,23S rDNA 间区部分序列比较 ) 菌酸的报道 ,本研究及本科室对我国食物中毒样品 2 - 4 ,6 - 9 分离的米酵菌酸产毒株的系列研究,为分析 探讨我国分离菌株的分类学地位 、产毒机制及其存 在的特异 16S,23S rRNA 基因间区插入序列与产毒 性的关系等 ,提供了可靠的支持 。 参考文献 1 SIMON L J , STUBBS L , JON , et al . PCR targeted to the 16S - 23S rRNA gene intergenic spacer region of clostridium difficile and construction of a library consisting of 116 different PCR ribotypes J . () Journal of Clinical Microbiology , 1999 , 37 2: 4612463 . 2 焦振泉. 椰毒假单胞菌酵米面亚种系统分类学研究 D . 博士 学位论文 ,1999 . 王静. 椰酵假单胞菌基因组及糖分与产毒性能关系的初步研究 3 D . 博士学位论文 ,1995 . 孟昭赫. 食品卫生检验方法注解微生物学部分 M . 北京 : 人 4 民卫生出版社 ,1988 : 3842395 . PAUL W , WHITB YL , LAUREN C , et al . Species2Specific PCR as a 5 Tool for the Identification of Burkholderia gladioli J . Journal of () Clinical Microbiology , 2000 , 38 1:2822285 . 邱茂峰 ,刘秀梅 ,杨瑞馥. 椰酵假单胞菌 rDNA 指纹图分析方法 () 的建立J . 中华预防医学杂志 , 1996 , 30 4: 2312233 . 6 邱茂峰 ,刘秀梅 ,杨瑞馥. 用 rDNA 指纹图分析我国部分椰酵假 图 5 椰酵假单胞菌系统发育进化树 ( ) 单胞菌的分子流行病学特征 J . 卫生研究 , 1998 , 27 1: 572 7 60 . 我 们 根 据 对 椰 酵 假 单 胞 菌 分 离 株 16S , 23S 焦振泉 ,刘秀梅. 椰毒假单胞菌酵米面亚种的 16s rDNA 序列的 () 测定和分析J . 卫生研究 ,1999 ,28 4:2322235 . rRNA 基因间区 DNA 序列的比较分析 , 进一步支持 8 J IAO Z , KAWAMURA Y , MISHIMA N , et al . Need to differentiate 了椰酵假单胞菌与唐菖蒲伯克霍尔德菌更为近缘这 lethal toxin2producing strains of Burkholderia gladioli , which cause 一结论 。同时揭示大部分分离的椰酵假单胞菌米酵 9 severe food poisoning : description of B. gladioli pathovar cocovenenans 菌酸产毒株存在特异的插入序列 ,为鉴定米酵菌酸 and an emended description of B. gladioli J . Microbiol Immunol . 产毒株提供了可靠的科学理论依据 。根据我们的研 () 2003 , 47 12:9152925 . 王晓英 ,刘秀梅. 串珠镰刀菌伏马菌素产毒株 PCR 检测方法 究结果 ,建议划分椰酵假单胞菌米酵菌酸产毒株及 () 的研究J . 卫生研究 ,2003 ,32 3:2282231 . 不产毒株为唐菖蒲伯克霍尔德菌的一个或几个生物 10 [ 收稿日期 :2008 - 03 - 02变种或新的生物型 。 国际上尚未见唐菖蒲伯克霍 ( 尔德菌产毒 米酵 文献标识码 :A() 中图分类号 : R15 ; R379 ; Q949132 文章编号 :1004 - 8456 200803 - 0197 - 07 ()二 消息 科学家们的统计结果表明 ,幽门螺旋杆菌在许多情况下会引起胃粘膜慢性发炎 ,并导致胃炎和溃疡的 发生 ,而他生活在大约地球上 50 %居民的胃里 。导致动脉粥状硬化因素之一的肺炎衣原体 ,可以在 10 %, 50 %的居民机体内发现 。根据 WHO 的资料显示 ,超过 90 %的居民都不同程度地患有牙周疾病 。如果这些 疾病不进行治疗的话 ,可能会导致牙齿周围及其支持组织被破坏 。最新的研究资料发现 ,口腔有害菌要对 成人 75 %的牙齿脱落负责 ,甚至还被怀疑在许多情况下会引起其他疾病 ,如动脉粥样硬化 、糖尿病恶化 ,或 者是孕妇感染后的早产 。