还原糖和总糖的测定方法
还原糖和总糖的测定——3,5-二硝基水杨酸比色法 一、材料、主要仪器和试剂
1、材料 小麦面粉;精密pH试纸。
2、主要仪器
(1)具塞玻璃刻度试管:20mL×11 (2)大离心管:50mL×2 (3)烧杯:100mL×1 (4)三角瓶:100mL×1 (5)容量瓶:100mL×3 (6)刻度吸管:1mL×1;2mL×2;10mL×1 (7)恒温水浴锅 (8)沸水浴
(9)离心机 (10)分光光度计
3、试剂
(1)1mg/mL葡萄糖
标准
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液
准确称取80?烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4?冰箱中保存备用。 (2)3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂
将6.3gDNS和262mL2MNaOH溶液，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用。
(3)碘-碘化钾溶液:称取5g碘和10g碘化钾，溶于100mL蒸馏水中。 (4)酚酞指示剂:称取0.1g酚酞，溶于250mL70%乙醇中。
(5)6MHCl和6MNaOH各100mL。
二、操作步骤
1(制作葡萄糖标准曲线
取7支20mL具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。
表1葡萄糖标准曲线制作
管号 1mg/mL 葡萄糖标准液 蒸馏水 DNS 葡萄糖含量 光密度值
(mL) (mL) (mL) (mg) (OD540nm) 0 0 2 1.5 0 1 0.2 1.8 1.5 0.2 2 0.4 1.6 1.5 0.4 3 0.6 1.4 1.5 0.6 4 0.8 1.2 1.5 0.8 5 1.0 1.0 1.5 1.0 6 1.2 0.8 1.5 1.2
将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min，取出，冷却至室温，用蒸馏水定容至20mL，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。调波长540nm，用0号管调零点，测出1~6
号管的光密度值。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量(mg)为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。
2(样品中还原糖和总糖的测定
(1)还原糖的提取
准确称取3.00g食用面粉，放入100mL烧杯中，先用少量蒸馏水调成糊状，然后加入50mL蒸馏水，搅匀，置于50?恒温水浴中保温20min，使还原糖浸出。将浸出液(含沉淀)转移到50mL离心管中，于4000r/min下离心5min，沉淀可用20mL蒸馏水洗一次，再离心，将二次离心的上清液收集在100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，作为还原糖待测液。
(2)总糖的水解和提取
准确称取1.00g食用面粉，放入100mL三角瓶中，加15mL蒸馏水及10mL6MHCl，置沸水浴中加热水解30min(水解是否完全可用碘-碘化钾溶液检查)。待三角瓶中的水解液冷却后，加入1滴酚酞指示剂，用6mol/LNaOH中和至微红色，用蒸馏水定容在100mL容量瓶中，混匀。将定容后的水解液过滤，取滤液10mL，移入另一100mL容量瓶中定容，混匀，作为总糖待测液。
(3)显色和比色
取4支20mL具塞刻度试管，编号，按表2所示分别加入待测液和显色剂，空白调零可使用制作标准曲线的0号管。加热、定容和比色等其余操作与制作标准曲线相同。
表2样品还原糖测定
管号 还原糖待测液 蒸馏水 DNS 光密度值 总糖待测液 查曲线葡萄糖量
(mL) (mL)(mL) (mL) (OD540nm) (mg)7 0.5 1.5 1.5 8 0.5 1.5 1.5 9 1 1 1.5
1 1 10
三、结果与计算:
计算出7、8号管光密度值的平均值和9、10管光密度值的平均值，在标准曲线上分别查出相应的还原糖毫克数，按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量。
浙公网安备 33021202002483