VIGS小知识总结

VIGS小知识总结1. TRV1和TRV2共注射时,选择植株下部的叶子(lower leaves); 2. 一般注射后过2周左右时,发生基因沉默,这个时候进行表型分析; 3. 用反转录定量PCR检测目的基因在VIGS植株中的表达量,一般TRV-VIGS能使目的基因的表达水平大约下调80%; 4. 为了确保侯选siRNA 序列只沉默单一的靶基因, 侯选siRNA 序列应在美国NCBI (National Center for Biotechnology Information) 的EST 或Unigene 数据库进行 B...

1. TRV1和TRV2共注射时,选择植株下部的叶子(lower leaves); 2. 一般注射后过2周左右时,发生基因沉默,这个时候进行表型分析; 3. 用反转录定量PCR检测目的基因在VIGS植株中的表达量,一般TRV-VIGS能使目的基因的表达水平大约下调80%; 4. 为了确保侯选siRNA 序列只沉默单一的靶基因, 侯选siRNA 序列应在美国NCBI (National Center for Biotechnology Information) 的EST 或Unigene 数据库进行 BLAST 同源性比对。当siRNA 序列只同源于靶基因时,才可以用于下一步的基因功能研究。 5. 为确保对靶mRNA的有效抑制,针对每一个靶基因应该设计4条以上siRNA序列,进行化学合成后,通过实验筛选出沉默效率最高的siRNA 序列进行下一步的基因功能研究。 6. 烟草(Nicotiana benthamiana)植株中八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase)基因PDS GGCACTCAACTTTATAAACCCTGACGAGCTTTCGATGCAGTGCATTTTGATTGCT TTGAACAGATTTCTTCAGGAGAAACATGGTTCAAAAATGGCCTTTTTAGATGGTA ACCCTCCTGAGAGACTTTGCATGCCGATTGTGGAACATATTGAGTCAAAAGGTGG CCAAGTCAGACTAAACTCACGAATAAAAAAGATCGAGCTGAATGAGGATGGAA GTGTCAAATGTTTTATACTGAATAATGGCAGTACAATTAAAGGAGATGCTTTTGT GTTTGCCACTCCAGTGGATATCTTGAAGCTTCTTTTGCCTGAAGACTGGAAAGAG ATCCCATATTTCCAAAAGTTGGAGAAGCTAGTGGGAGTTCCTGTGATAAATGTCC ATATATGGTTTGACAGAAAACTGAAG 7. VIGS 载体中对插入片段的方向并无要求 ,正义链方向及反义链方向的序列均可高效诱导基因沉默(Alkinson et al., 1998; Bruun-Rasmussen et al., 2007),但是对片段长度和序列特异性有一定的要求。Both sense and antisense orientations of the insert in the TRV2 vector have been shown to invoke similar VIGS. 8. 用于VIGS的同源序列需要有较高的特异性,这样可以尽可能降低实验中的“脱靶”效应。“脱靶”是指siRNA 和非目的基因结合,导致非靶标基因沉默。 9. 植物基因组中有大量的基因家族,家族间的基因序列相似性非常高,如果需要特异性地沉默家族中的某个基因,则构建载体的同源片段必须适当的缩短长度以保持沉默的特异性。 10. siRNA设计原则 RNAi发挥作用的核心在于siRNA的序列结构,因此不同的siRNA导致的沉默效果差异非常巨大。影响siRNA功能因素主要包括siRNA序列结构特点、靶向mRNA的空间结构、RISC与siRNA的相互作用、以及siRNA与mRNA错配。目前siRNA设计的原则有两种方式: (1) 统计不同siRNA对靶序列抑制程度得到siRNA设计原则。这个原则就是统计目前已有的siRNA序列,根据序列特点和序列沉默效果分析得到。 a. GC含量在30%-52% b. 有义链15-19位至少有3个A或者U c. 避免出现倒置重复,以防形成发卡结构 d. 有义链的第3位核苷酸为A e. 有义链的第10位核苷酸为U f. 有义链的第19位核苷酸为A g. 有义链的第19位核苷酸不能为G或C h. 有义链的第13位核苷酸不能为G (2) 以siRNA序列上的能量为依据,筛选有效序列。 a. 总的siRNA双联能量<> b. 反义链5'端的结合能<> c. 有义链的5'端结合能在5-9 e. GC含量在36%-53% f. 中间7-12位的结合能<> g. 反义链5’端与正义链5'端的能量差最好在-1~0 11. 根据VIGS的作用机制,理论上引起目的基因沉默的最小插入片段为23bp,但是在实际操作中,23bp的核苷酸长度常常不能有效的启动目的基因沉默的发生,所以需要选择数倍于23nt的目的基因片段,但也不能过长。为了使目的基因能够有效地沉默,通过实验表明200-500bp插入片段的沉默效果最佳。当然,也可能存在其他影响沉默效果的因素,如目标基因序列的核苷酸组成、siRNA及目标序列的碱基对的热力学特性等。

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