木聚糖酶活力的二硝基水杨酸（DNS）测定法

木聚糖酶活力的二硝基水杨酸（DNS）测定法 木聚糖酶活力的二硝基水杨酸(DNS)测定 法 印染(2011No.2) ...’..... 6测敢与 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 2 .o.o.<>.<>... 木聚糖酶活力的二硝基水杨酸(DNS)测定法 沈诚,李戎,胡婷莉,阎克路 (东华大学国家染整工程技术研究中心,上海201620) 摘要:采用DNS法研究不同稀释倍数,底物用量,pH值和反应温度对木聚糖酶活力的影响.结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明:木 聚糖酶的活力随酶稀释倍数,底物木聚糖量的提高而增加,但应控制好酶的稀释倍数和底物用量,否则会引 起测定误差.酶处理反应的较佳工艺为:时间20min,pH值6,反应温度6o.木聚糖酶在6o?恒温稳定0 — 4h,相对酶活都在85%以上,稳定性较好.其它前处理用酶制剂对木聚糖酶活力的影响不明显,不同类型 的化学助剂对木聚糖酶的影响不同. 关键词:测试;木聚糖酶;活性 中图分类号:TS197文献标识码:C文章编 号:1000—4017(20110)02—0035—05 DeterminationofxylanaseactivitywithDNSmethod SHENCheng,LIRong.HUTing一1i,YANKe—lu (NationalEngineeringResearchCenterforDyeingandFinishingofTextiles,DonghuaUniversity-Shanghai201620,China) Abstract:Thearticlestudiestheeffectofdifferentdilutiontimes.themassofsubstrate,pHvalueandreactiontemperatureon xylanaseactivity.Theresultsshowthat.xylanaseactivityincreasedwiththeincreaseindilutiontimesandthemassofSUb- strate.However,theincreaseofdilutiontimesandthemassofsubstrateshouldbecontrolledproperly:otherwiseitwilllead tomeasurementerror.TheoptimumreactiveprocessispHvalue6.0.reactingat60oCfor20min.Thexylanaseisplacedat 6o? for4h.withover85%ofthexylanaseactivitymaintained.andhasgoodstability.Theeffectofotherenzymepretreat- mentonxylanaseactivityisnotobvious.Theinfluenceofdifferentchemicalagentsonxylanaseisdistinguished. Keywords:testing;xylanase:activity O前言 生物酶精练工艺作为节能降耗,无污染的印染清 洁生产工艺?,近年来受到国内外的普遍关注.它作 用条件温和,耗水量和排放废水COD值低,对棉纤维 损伤小,是目前公认的碱煮练的理想替代工艺,显示出 很好的应用前景.然而,酶精练工艺对棉织物中的非 纤维素杂质,如蜡质和果胶质,尤其是棉籽壳的去除效 果较差,限制了其工业化应用l3J. 木聚糖是植物半纤维素的主要成分,为自然界中 广泛存在,含量仅次于纤维素的可再生多糖资源,占细 胞干重的7%一35%t4].木聚糖酶是一类可将木聚糖 降解成低聚糖和木糖的复合酶系.它以内切方式降解 木聚糖主链架的13—1,4一木糖苷键,其水解产物主要是 木二糖和木寡糖,少量的木糖和阿拉伯糖.木聚糖酶 对棉籽壳的主要组分半纤维素有专一的降解作用.因 此,提高木聚糖酶对棉籽壳的降解作用,能够最 收稿日期:2010—08—16 基金项目:国家科技支撑项目(2009BAE88B02),中央高校基本科研业 务费专项资金资助. 作者简介:沈诚(1987一),男,硕士研究生,主要研究方向为棉织物的 生物酶前处理. 通讯作者:李戊,e—mail:lirong@dhu.edu.an. 大程度地提高复合酶对棉籽壳的降解效果. 酶活是衡量酶生物活性的重要指标,但目前尚无 木聚糖酶酶活测定的标准方法.常用的DNS(3,5-二 硝基水杨酸)法l,J,采用比色法测定还原糖的生成量, 从而获得木聚糖酶的活力J.木聚糖酶水解木聚糖底 物生成的还原性糖,可在煮沸条件下与DNS显色剂生 成棕红色的氨基化合物.在一定范围内,还原糖的生 成量与反应液的颜色强度成正比.该法操作简便,显 色稳定,重现性好,且无需特殊的仪器设备,是众多科 研单位公认的木聚糖酶检测方法. 1试验 1.1仪器设备 电子天平(精度0.0001g),pH计,可见分光光度 计,恒温振荡水浴锅,秒表,刻度试管,移液管,容量瓶, 烧杯. 1.2材料 木聚糖(Sigma公司),D(+)一木糖(国药集团化学 试剂有限公司),木聚糖酶,淀粉酶,纤维素酶,果胶酶, 脂肪酶(诺维信公司),3,5一二硝基水杨酸(DNS),酒石 酸钾钠,苯酚,偏重亚硫酸钠,磷酸氢二钠,磷酸二氢 钾,醋酸,醋酸钠,氢氧化钠,十二烷基磺酸钠,十二烷 35 印染(21111No.2)WWW.c~Ifn.C011”1.Cll 基苯磺酸钠,平平加0,EDTA,JFC,阳离子助剂,硫酸 铝,硫酸亚铁,硫酸锰. 1.3试剂与溶液的配制 (1)DNS试剂 取3,5一二硝基水杨酸7.5g,充分溶解于500mL 蒸馏水(蒸馏水先沸煮10rain后,冷却近室温)中,逐 步加入14gNaOH.随后,分别依次加入216g酒石酸 钾钠,5.5mL苯酚(50?水浴溶解),6g偏重亚硫酸 钠(溶解过程中可加入适量蒸馏水).待其充分溶解 后,定容至looomL,放人棕色瓶中静置1,5d,待用. 溶液每月配制一次,平时使用时可倒少量于小瓶中,其 余放人冰箱中静置. (2)o.25g/LD(+)一木糖 用电子天平准确称取0.025g木糖,充分溶解后, 定容至100mL. (3)pH值缓冲溶液 分别取不同量的磷酸氢二钠和磷酸二氢钾,用pH 计配制pH值为5,6,7和8.8的缓冲溶液. 同理,pH值为4的缓冲液采用醋酸缓冲液配制, pH值为l0的缓冲液采用碱性缓冲液配制. (4)木聚糖底物 采用相应的pH缓冲液配制. 1.4I)NS法酶活测定 1.4.1D一(+)一木糖标准曲线的绘制 在刻度试管中加入2.0,2.5,3.0,3.5,4.5和 5.5mL的0.25g/LD一木糖溶液,再分别加入DNS试剂 5.0mL,加蒸馏水分别定容至12mL.加热至沸,保持 8rain,充分显色,冷却后定容至25mL.在另一容量瓶 中加入5.0mLDNS试剂,定容至25mL,作为参比溶 液.在540nm处,测定各溶液的吸光度,并以D.木糖 质量浓度C为横坐标,以吸光度为纵坐标,绘制标准 曲线. A=m?C+n(1) 式中:A——溶液吸光度 m——绘制的标准曲线的斜率 C——D.木糖质量浓度 n——绘制的标准曲线的截距 1.4.2木聚糖酶酶活测定 试验中,1mL酶在一定温度和pH值条件下,1h 分解木聚糖产生1mgD(+)一木糖,视为一个酶活力单 位. 取1mL经稀释的酶液,加入5mL缓冲溶液,沸煮 10min(灭活木聚糖酶)后加人底物木聚糖溶液.处理 一 定时间后,加入DNS显色8min,得到参比液. 另取木聚糖溶液1mL于刻度试管中,加人不同 pH值的缓冲溶液5mL,在一定温度的水浴中平衡 5rain.加人稀释后的木聚糖酶溶液1mL,摇匀并开始 计时.酶处理t时间后,迅速加入DNS试剂5mL,并 将刻度试管放人沸水浴中显色8rain,冷却,定容至 25mL.以参比液为空白,采用分光光度计在540nm下 测定溶液吸光度.如果吸光度过大,可以进行适当稀 释后测试.按式(3)计算酶活. c:(A—n)/m(2) U=(c×0.025L)/(t×1mL)(3) 式中:C——生成木糖的质量浓度(mg/L) —— 溶液吸光度 —— 木聚糖酶酶活 0.025L——显色后定容体积 ,——酶反应时间(h) 1mL——木聚糖酶体积 2结果与 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 2.1酶稀释倍数的影响 将1mL木聚糖酶分别以蒸馏水稀释100,10000 倍,并于缓冲溶液pH值8,反应温度60?,反应时间 30rain条件下测定酶活,见图1. 700o0 60000 50000 嚣40000樊30000 20000 10000 0 酶的稀释倍数 图1木聚糖酶稀释倍数与酶活的关系 理论上,酶的活力与其稀释倍数无关,即不同稀释 倍数下测得的酶活为定值??.但图1中,酶的稀释倍 数不同,测得的酶活也不相同.这可能是由于底物木 聚糖的浓度与酶的浓度不适应引起的.由于木聚糖的 浓度相对很低,酶的稀释倍数在10000以内时,酶的 浓度仍然相对太大,底物木聚糖可全部被水解.这种 情况下,酶的稀释倍数越大,酶活越高.但需要强调的 是,稀释倍数很大,会导致较大的滴定误差.所以,本 试验中稀释10000倍后不再继续稀释. 2.2底物用量的影响 取l,2,3,4,5和6mL10.00g/L木聚糖溶液于6 个刻度试管中,然后依次向各试管中加人5,4,3,2,1 和0mLpH值为8的缓冲溶液.在60?水浴中平衡 木聚糖酶活力的二硝基水杨酸(DNS)渊定法印染(2011No.2) 5min,加入稀释5000倍和10000倍的木聚糖酶溶液 1mL,反应30min,其余操作参照酶活测定方法.结果 如图2所示. 200000 180000 16O000 鉴140000露 120000 冀100000 80000 长60000 40000 20000 加入木聚糖的量/mL 图2木聚糖加入量与酶活的关系 由图2可以看出,木聚糖酶酶活与底物用量呈线 性关系,底物用量越多,酶活越大.加人同量的木聚糖 底物,酶溶液稀释10000倍时所测得酶活比稀释5O00 倍高一倍.但是,由于底物本身并非为澄清溶液,底物 用量增加会影响其吸光度的测量.因此,底物的加入 量不宜过多. 2.3木聚糖酶处理时间 取1Og/L木聚糖2mL(酶稀释10000倍和5000 倍)或4mL(酶稀释10000倍),水浴温度60?,缓冲 溶液pH值8,酶处理时间2,40min.测试不同处理 时间下的木糖生成量和酶活,结果见图3和图4.’ \ 烬 罐 留 冀 长 3 \ bo \ 例 爨 长 木聚糖酶处理时间/min 图3酶处理时间与酶活的关系 木聚糖酶处理时间/min 图4酶处理时间与木糖生成量的关系 从图3可以看出,木聚糖酶处理时间越短,计算得 到的酶活越大.酶稀释10000倍,木聚糖加入量为 2mL时,酶处理2min,酶活计算值可达1.1×10.;酶处 理时间为5min时,酶活计算值为1.7X10,变化明 显.酶处理时间为2,15min,酶活计算值差异较大; 酶处理时间超过15min,酶活的计算值变化逐渐减小. 在底物分解速率呈线性条件下选择酶处理时间比 较适宜.图4中,酶处理时间0,20min,木糖的生成 速率大致在线性范围内;酶处理时间为20,30min,木 糖浓度增加趋缓.综上,选择酶处理时间为20min. 2.4木聚糖酶pH值 木聚糖酶用量1mL(稀释倍数5ooo),5g/L木聚 糖1mL,酶处理温度6O?,酶处理时间20min.调节 酶溶液pH值为4,5,6,8,8.8和10,考察pH值对木聚 糖酶酶活的影响,见图5. \ 癌 落 嚣 ?受冲j积cpH 图5缓冲液pH值与酶活的关系 由图5可以看出,木聚糖酶pH值为6时,其活性 最高;pH值为5,7和8.8时,木聚糖酶也都保持较高 的活力;pH为4和lO时,木聚糖酶处理木聚糖的活力 降低,说明酸性或碱性过强都会影响酶的活力.木聚 糖酶较佳pH值为6. 2.5木聚糖酶最佳反应温度 木聚糖酶用量1mL(稀释倍数5000),5g/L木聚 糖1mL,酶处理时间20min,缓冲溶液pH值8.分别 在温度50,60,7O,80和9O?下考察木聚糖酶的活力, 见图6. 26000 24000 22000 20000 龌18000 墓16000藤14000 长12000 10000 8000 酶处理温度/~C 图6处理温度与木聚糖酶酶活的关系 由图6可见,木聚糖酶的较佳反应温度为6O?; 处理温度为50和70?时,木聚糖酶也保持有较高的 活力;但温度为80和90?时,酶的活力降低比较明 印染【2011No.2)WWWoedfn.C0111.CII 显.因此,木聚糖酶的处理温度以50—70?为佳. 2.6木聚糖酶恒温稳定性 各取1mL木聚糖酶液(稀释5000倍)于刻度试 管中,分别加入5mLpH值为6的磷酸缓冲液和pH值 为8(NaCO和自来水调节)的缓冲溶液,于6O?水 浴中恒温稳定1,6h;随后加人5L木聚糖溶液 1mL,酶处理20min,加入DNS显色测定酶活.结果 如图7和图8所示,以恒温稳定0h得到的酶活为 100%. 烬 谣 靛 粤 图7pH值6时木聚糖酶酶活稳定性 由图7可知,pH值为6时,木聚糖酶在60?恒温 0-4h,相对酶活都在85%以上,稳定性较好;恒温保 持6h,相对酶活<7O%,酶活下降明显. \ 烬 锰 靛 皿 图8pH值8时木聚糖酶酶活稳定性 图8中,pH值为8时,随着恒温时间的增加.木聚 糖酶的相对酶活下降明显,3,6h内其相对酶活降至 50%以下.因而,在纺织印染前处理应用中,需充分注 意木聚糖酶的稳定时间,尽量在酶加入的1—2h就予 以使用.否则,木聚糖酶的活力会降低. 2.7其它前处理用酶制剂的影响 在纺织品生物酶处理中,根据前处理工艺的需要, 常出现不同种类的酶剂共存的情况.这时,不同酶种 对木聚糖酶活力的影响程度,将直接影响到酶种选择 及前处理效果.针对这一问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 ,选择用于棉织物前处 理的脂肪酶,纤维素酶,果胶酶和淀粉酶等5种生物酶 进行研究.结果见表1和表2. 表1单种酶对木聚糖酶酶活的影响 酶种相对酶活/% 木聚糖酶1oo.oo 脂肪酶+木聚糖酶95.57 纤维素酶十木聚糖酶97.95 果胶酶+木聚糖酶102.12 淀粉酶+木聚糖酶l0o.44 表2混合酶对木聚酶活力的影响 混合酶种相对酶活/% 木聚糖酶10o.oo 淀粉酶+果胶酶+纤维素酶+脂肪酶+木聚糖酶95.97 淀粉酶+果胶酶十纤维素酶+木聚糖酶91.08 果胶酶+纤维素酶+脂肪酶+木聚糖酶95.75 淀粉酶+果胶酶+脂肪酶+木聚糖酶91.38 淀粉酶+纤维素酶+脂肪酶+木聚糖酶97.49 由表1和表2可以看出,淀粉酶,果胶酶,纤维素 酶,脂肪酶及其混合酶对木聚糖酶的活力没有太大的 影响.各混合酶的相对活力都在90%以上.因而,在 印染前处理中,木聚糖酶与淀粉酶,果胶酶,纤维素酶 和脂肪酶都能共存. 2.8化学助剂的影响 生物酶前处理中,除了不同种类酶制剂相互混合 外,还需加人渗透剂等表面活性剂.为了提高酶活力, 减少原酶用量,研究了表面活性剂以及金属离子对木 聚糖酶活力的影响,结果见表3和表4. 表3助剂对木聚糖酶酶的影响 助剂相对酶活/% 空白1o0.0o 十二烷基磺酸钠33.58 十二烷基苯磺酸钠19.12 平平加0125.61 EDTA85.41 JFC109.68 阳离子助剂104.78 由表3可知,阴离子表面活性剂十二烷基磺酸钠 和十二烷基苯磺酸钠对木聚糖酶的活力起抑制作用, 可将相对酶活分别降低到33.58%和19.12%.非离 子表面活性剂平平加O和JFC则对木聚糖酶的活力有 很好的促进作用.另外,阳离子助剂对木聚糖酶的活 力也有促进作用;EDTA会降低木聚糖酶的活力,但降 低程度有限. 表4金属离子对木聚糖酶活性的影响 金属盐类相对酶活/% 空白100.0o 硫酸铝80.55 硫酸亚铁28.12 硫酸锰42.7l 从表4可以看出,本试验选取的金属离子对木聚 糖酶的活力均有抑制作用.亚铁离子对木聚糖酶的活 ???加??们5; ??????? 木聚糖酶活力的二硝基水杨酸(DNS)测定法印染(2011No.2) 力影响最大,其次为锰离子,铝离子的抑制作用较小. 2.9参比液的影响 采用DNS法测试木聚糖酶酶活的过程中,会根据 木聚糖酶作用条件的变化选择不同的参比液,虽然各 参比液之间的差别并不是很明显.为减少试验中制作 参比液的工作量,对木聚糖酶不同作用条件下参比液 的吸光度进行比较. 制作参比液时,向1mL灭活的木聚糖酶酶液(稀 释倍数5ooo)中加入5L缓冲液5mL以及1mL木 聚糖底物,在一定温度下反应20min后,加人5mL DNS试剂,沸煮8min,使其充分显色. 选取不同类型的参比液,以蒸馏水作空白,测量其 在540nm波长下的吸光度,见表5和表6. 表5缓冲溶液pH值对参比液吸光度的影响 I鏖I:I:望I:!I:垫l:箜!I:!I:!!I 表6反应温度对参比液吸光度的影响 0035003700350031I吸光度I.1.I.『.1 注:参比液pH值为6. 由表5和表6可以看出,不同pH值缓冲溶液,反 应温度参比液的吸光度均为0.03,0.04,在测量误差 范围内,说明参比液没有太大的影响.因而,在测定过 程中,可以适当地用一个pH值的缓冲溶液,同一个反 应温度作为参比液,无需每个pH值和反应温度都制 备参比液. 3结论 (1)木聚糖酶的活力随着酶稀释倍数和底物木聚 糖加人量的提高而增加,但二者不能无限增加,否则会 引起测量误差.本试验最终选取酶的稀释倍数为 5000,5g/L底物木聚糖溶液用量1mL;酶处理反应时 间20min,pH值6,反应温度60?. (2)木聚糖酶在pH=6磷酸缓冲体系60?恒温 保持0,4h,其相对酶活在85%以上,稳定性很好;时 间超过6h,酶活下降明显.在pH=8(NaCO+自来 水调节)条件下,3,6h内,相对酶活会下降至50%以 下,相对酶活下降明显. (3)淀粉酶,果胶酶,纤维素酶和脂肪酶等对木聚 糖酶的活力影响均不明显. (4)对于木聚糖酶的活力,阴离子表面活性剂十 二烷基磺酸钠和十二烷基苯磺酸钠起抑制作用;非离 子表面活性剂平平加0,JFC则起到了很好的促进作 用;阳离子助剂也有促进作用;EDTA起抑制作用,但 效果不明显. (5)金属离子中,亚铁离子对木聚糖酶的酶活影 响最大,锰离子次之,铝离子的抑制作用较小. (6)不同pH值缓冲溶液和不同反应温度的参比 液,其吸光度差别不大.因而,为减少操作量,试验中, 参比液可以选取同一种缓冲溶液和同一个反应温度. ? 参考文献: [1]靳贺玲,范雪荣,王强.响应面分析法优化棉针织物的国产碱 性果胶酶精练工艺[J].江南大学(自然科学版),2006,4: 229-231. [2]阎贺静,华兆哲,堵国成,等.碱性木聚糖酶降解棉籽壳的热动 力学[J].印染,2009,35(19):1-4. [3]Csisz6rE,SzakOcsG,KoezkaB.Biopreparatlonofcottonfabricwith enzymesproducedbysolid—statefermentation[J].En~meMierob. Techno1.,2007(4o):1765—1771. [4]CollinsGerdayC,FellerG.Xylanases,xylanasesfamiliesandex- tremophilicxylanases[j].FEMSMicrobiolRev,2005,29(1):3— 23. [5]李彩霞,房桂干,刘 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 钗.木聚糖酶酶活的具体测定方法[J].林 产化工通讯,2001,35(1):20-23. [6]罗长才,李莲,刘亚力,等.琼脂扩散法测定加酶饲料中微量 纤维素酶活力的研究[J].饲料工业,2003,24(1O):39-41. 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