基因编辑技术

基因编辑技术产生背景定义及原理分类及比较CRISPR的优点及在植物育种上的应用CRISPR基因编辑技术的一般操作程序全基因组测序技术的不断发展和完善大型基因组注释项目的实现基因革命（基础科学与个性化医疗之间进行转化）将大量数据转化为功能和临床相关知识解决这个问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 最核心的是需要有高效、可靠的方法使研究者能够知道基因型如何影响表型利用同源重组机制对基因进行定向失活是为基因功能评估提供信息的有力手段。但是这一技术的应用有几个限制因素，包括遗传工程组件插入目标位点的效率低、筛选过程费时费力、有可能产生不利的突变效应等。RNAi基因靶向敲除技术给研究者提供了快捷、廉价而且可以开展高通量研究的新方法，但是，RNAi的基因敲除效果还不够彻底，每次试验以及每个实验室的试验结果都会有差异，另外还存在不可预知的脱靶情况，所以只能够用于需要暂时抑制基因功能的试验当中。基因编辑技术（近十年出现）:可以帮助科研人员对各种细胞和各种生物体内的几乎任意基因进行人工操作《ZFN,TALEN,andCRISPR/Cas-basedmethodsforgenomeengineering》一、基因编辑技术的产生背景2014年3月12日，宾夕法尼亚大学PabloTebas教授团队在新英格兰医学杂志撰文称，他们利用SangamoBioSciences开发的ZFNs基因编辑技术，显著提高了艾滋病患者对艾滋病毒的抵抗能力。　1、在不同人种之间，自由“切换”基因编辑技术首次应用于临床。目前SangamoBioSciences基于ZFNs技术治疗艾滋病的方法已经进入临床II期试验。免疫细胞表面的CCR5蛋白是HIV进入免疫细胞的“入口”。而少数北欧人由于CCR5基因“变异”（来源于原始高加索人），具备天然的HIV抵抗力。“要不把患者的CCR5基因都改成高加索人种那种类型吧”！之所以能够使用基因编辑技术治疗艾滋病，是因为发现免疫细胞表面的CCR5蛋白是HIV进入免疫细胞的“入口”。而少数北欧人由于CCR5基因“变异”，具备天然的HIV抵抗力。这个“变异”对于艾滋病患者来说真的很重要，因此研究人员做了很多的研究。有研究表明，北欧人体内的CCR5基因“变异”不是CCR5基因突变的结果，而是在自然界中伴随着原始高加索人种的出现而出现的，这种“变异”所表现出来的性状因适应自然环境而保留了下来。自此，我不得不佩服大自然的神奇。也许在世界的任何一个角落里，造物主都会安放着一个保护人类的重要基因，避免人类因一种疾病的爆发而灭绝。有了造物主释放的重要信息，研究人员就动脑子了，“要不把患者的CCR5基因都改成高加索人种那种类型吧”！Tebas团队做的就是这件事。在体外（exvivo）利用ZFNs基因编辑技术定点改造免疫细胞的CCR5基因。让我们静候Sangamo临床II期的好消息。*2、“关闭”一个基因，打开生命之门2015年11月5日，WaseemQasim对外宣布，他们利用Cellectis公司经TALENs基因编辑技术改造的UCART19细胞株，成功缓解了Layla的不治之症--急性淋巴细胞性白血病（ALL），造就了世界首例婴儿白血病治疗奇迹，是基因编辑技术有史以来第二次被运用在人体上技术。修改捐赠细胞使其抗癌：蕾拉的生命获救得益于基因工程修改过的血液细胞。捐赠的血液细胞来自美国，科学家总共对其进行了三次修改。科学家们首先在捐赠的血液细胞中添加抗白血病基因，这些基因可编码靶向并杀死癌细胞的蛋白质，其次科学家使用TALENs技术关闭两个基因，关闭第一个基因是为了确保捐赠的细胞不被蕾拉的身体排斥，关闭第二个基因是为了确保捐赠细胞不被治疗药物杀死。http://opinion.haiwainet.cn/n/2015/1113/c345416-29353992.htmlhttp://www.jiemian.com/article/435551.html据英媒11月5日报道，英国伦敦一名患白血病的1岁大女婴生命进入最后几个月倒数。面对传统疗法（化疗及骨髓移植）失效，医生尝试将基因编辑过的血液细胞注入她体内，成功消灭癌魔，开创全球首例。今年6月份医生将1ml编辑过的健康细胞注入到蕾拉体内。多亏了注入的5000万个基因工程编辑过的细胞，使得蕾拉体内的癌细胞被捕杀且病情开始消退。在治疗初期还看不到明显的效果，但几周后蕾拉开始出现复苏的迹象，医生紧跟着对蕾拉进行了骨髓移植以确保根除疾病，如今检测结果发现蕾拉身上的癌细胞已完全消除。我们使用这种方法治疗了一个很坚强的小女孩，这种方法是否适合所有孩子还需谨慎。但这对新生物工程技术来说具有里程碑意义，对孩子的影响也是惊人的。如果这种方法具有可重复性，那么将是白血病治疗的一个巨大进步，同时也有助于开创囊性纤维化和其他遗传疾病治疗的新方法。——蕾拉的主治医生瓦萨姆·卡西姆教授实验疗法：化疗及骨髓移植细胞大战这种疗法的基本思想是去除病人身体内的免疫细胞，用基因工程来改造它们，好让它们具备攻击癌细胞的能力，再把它们放回病人的身体内。世界上已经在进行类似的人体实验。一些实验是加入一种称为CAR19的受体的基因，它位于T细胞外面。经过基因改造后，T细胞能够搜寻和杀死表面携带有CD19蛋白的所有细胞——CD19位于导致急性淋巴细胞白血病的细胞上。但是改造每位病人的T细胞并不便宜。而莱拉体内的T细胞已经所剩无几。于是，Qasim的团队为她开发了一种「现成」疗法，改造健康捐赠者体内的T细胞，以输入给上百位病人。为了防止捐赠者的T细胞被受赠者体内的细胞识别为外来细胞而引起排异反应，Qasim的团队采用基因编辑的方法，关闭了捐赠者细胞上的一个基因，使得受赠者无法识别出它们是外来细胞。但是，还有一个困难需要克服。受赠者的免疫系统还会把不符合的T细胞识别为外来细胞并攻击它们。在白血病的病人中，这并不是一个问题，因为他们接受了很多药物来破坏免疫系统。但是，其中一种药物（一种抗体）也会破坏捐赠者的T细胞。所以Qasim的团队还关闭了捐赠T细胞上的另一个基因，让它们对那种抗体隐形。莱拉的医生与Qasim联系上时，他与纽约生物科技公司Cellectis共同编辑的T细胞（称为UCART19）只在老鼠身上进行过实验。但莱拉的父母还是坚持接受了这个治疗。很幸运，几周内，治疗就开始起效。这是基因编辑技术有史以来第二次被运用在人体上。第一个实验是用来改造HIV病人的T细胞，好增强它们抵抗病毒的能力。不过这些病人与莱拉不同，他们并没有面临即刻的死亡风险。变化无常分子剪刀有时候会剪切掉错误的基因，因此，这种方法有一定的风险，有可能会将普通细胞变成癌细胞。3个月后，莱拉又接受了第二次骨髓移植，以恢复免疫系统。这些健康的免疫细胞识别出了UCART19细胞并消灭了它们，因此莱拉体内不再含有任何经过基因改造的细胞。莱拉将继续接受常规测试，以确保癌症已治愈。*3、“恢复”受损基因，才能重见光明　2015年11月3日，KatrineBosley在剑桥大学召开的EmTech大会上宣布，实验室数据表明，CRISPR基因编辑技术可以用于治疗Lebercongenitalamaurosis（LCA；利伯先天性黑朦病，一种遗传性视力衰退疾病），Editas将在2017年开展CRISPR基因编辑人体实验。Editas宣布的2017年人体实验激动人心之处在于，这有可能是首次体内（invivo）基因编辑试验。这项研究成功的意义在于，将CRISPR基因编辑“工具”装载到病毒体内，再把病毒注射到患处，CRISPR可以自行对患病部位进行基因改造。那么以后治疗Layla那样的白血病，不用分离T细胞了，直接将改造好的病毒注射到骨髓，就直接将基因异常的骨髓修复了，或者是直接整合目标基因加强其战斗力。这样一来，很多大手术就会变成微创手术，带来的好处是难以估量的。Editas的CEOKatrineBosleyLCA是一种罕见遗传病，研究表明有20多种基因变异会导致LCA，例如RPE65和CEP290等。传统的基因治疗十分热衷于研究LCA，因为这些变异与LCA关系明确，直接通过病毒载体导入正常基因（比如正常的RPE65）即可。但是，一旦遇到跟病毒载体一样大的基因（比如CEP290）缺陷，传统的基因治疗就束手无策了。　　在所有的LCA病例中，CEP290基因缺陷导致的LCA大概占20%，Editas采用的方法是，利用CRISPR基因编辑技术，直接删除CEP290基因变异位点左右共1000个碱基。Editas实验室的研究表明，删除CEP290基因的那1000个碱基之后，CEP290基因的表达恢复正常。CEP290基因变异的患者视力可能恢复正常。*二、什么是基因组编辑技术 所谓基因编辑技术，是指对DNA核苷酸序列进行删除和插入等操作，换句话说，基因编辑技术使得人们可以依靠自己的意愿改写DNA这本由脱氧核苷酸 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 写而成的生命之书。基因编辑技术的原理 构建一个人工内切酶，在预定的基因组位置切断DNA，切断的DNA在被细胞内的DNA修复系统修复过程中会产生突变，从而达到定点改造基因组的目的。 DNA修复系统主要通过两种途径修复DNA双链断裂（double-strandbreak,DSB）,即非同源末端连接（Nonhomologousendjoining,NHEJ）和同源重组（homologousrecombination,HR）。通过这两种修复途径，基因组编辑技术可以实现三种基因组改造的目的，即基因敲除，特异突变的引入和定点转基因1）基因敲除：如果想使某个基因的功能丧失，可以在这个基因上产生DSB，NHEJ修复的过程中往往会产生DNA的插入或删除（indel），造成移码突变，从而实现基因敲除。2）特异突变引入：如果想把某个特异的突变引入到基因组上，需要通过同源重组来实现，这时候要提供一个含有特异突变同源模版。正常情况下同源重组效率非常低，而在这个位点产生DSB会极大的提高重组效率，从而实现特异突变的引入。3）定点转基因：与特异突变引入的原理一样，在同源模版中间加入一个转基因，这个转基因在DSB修复过程中会被拷贝到基因组中，从而实现定点转基因。如通过定点转基因的方法可以把基因插入到人的基因组AAVS1位点，这个位点是一个开放位点，支持转基因长期稳定的表达，破坏这个位点对细胞没有不良影响，因此被广泛利用。*三、基因编辑技术的分类 第一代人工核酸内切酶：锌指核酸内切酶（zincfingerendonuclease,ZFN)，锌指是一类能够结合DNA的蛋白质，人类细胞的转录因子中大约有一半含有锌指结构，ZFN是将锌指蛋白与核酸内切酶FokI融合形成的核酸内切酶，利用它可以在各种复杂基因组的特定位置制造DNA的双链切口。 第二代人工核酸内切酶：类转录激活因子效应物核酸酶（transcriptionactivator-likeeffectornuclease,TALEN)的出现在很大程度上替代了ZFN。TALEN可以和ZFN一样对复杂的基因组进行精细的修饰，同时其构建较为简单，特异性更高，因此受到了科研工作者的青睐。2012年，TALEN被《科学》杂志评为十大科学突破之一。 第三代人工核酸内切酶：规律间隔成簇短回文重复序列-Cas蛋白（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9)，主要是基于细菌的一种获得性免疫系统改造而成，其特点是制作简单、成本低、作用高效。*图B：锌指核酸酶二聚体与 DNA结合示意图。锌指核酸酶的靶序列含有两个锌指蛋白结合位点，不过这两个位点之间还有一段5~7bp的间隔序列，锌指核酸酶里的Fok I酶切结构域就能够切割这段间隔序列。当然，我们也可以 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 出只能够识别左侧或者右侧结合位点的锌指蛋白。ZFN：Cys2–His2锌指蛋白 图A：一个锌指大约由30个氨基酸组成，形成了一种保守的ββɑ结构。在锌指ɑ螺旋结构表面的那几个氨基酸能够与DNA大沟上的3个碱基结合，不过这种结合的选择性会有所差异。因为有了高度保守的链接序列，我们就可以设计出能够识别9~18个碱基长度的DNA序列。在一段 680亿个碱基组成的DNA序列里，18个碱基组成的序列就足以成为一段特异性的序列，所以如果能够设计出含有3种以上的锌指蛋白DNA识别结构域的蛋白，那么就意味着科学家们能够利用锌指蛋白识别出人类基因组里的任意一段DNA序列。Cys2–His2锌指结构域是在真核生物中最常见的一种DNA结合基序，在人类基因组中也是编码频次排名第2的蛋白结构域。模块化组装（modular assembly） 策略就是其中的一种，这种策略就是以预先 选择好的锌指蛋白模块文库（这种预选的文 库是通过对多个大型文库进行筛选，或者人 工设计出来的）为基础，从中挑选出合适的 模块组装出所需要的锌指蛋白。由于目前开 发的锌指结构域几乎已经可以识别所有64 种三联核苷酸组合（密码子），所以我们完 全可以将这些锌指模块串联起来，识别特定 的DNA序列。基于选择的策略（selection-based approach），比如 寡聚体化序列设计策略（oligomerized pool engineering，OPEN）就可以从任意的文库 （这些文库会考虑相邻锌指之间与序列有关的 相互作用）中选择出新的锌指结构域。还有人将前面介绍的这些方法结合起来开发出了 新的策略，比如先预先选择出与序列有关的 （context-dependency）锌指模块，然后将 这些模块组合在一起形成更长的锌指组合。*TALE蛋白中的DNA结合结构域是由一连串33~35个氨基酸组成的重复结构域组成的，其中每一个结构域都能够识别一对碱基。TALE核酸酶的DNA结合特异性主要由两个高度可变的氨基酸决定，科学家们将这两个关键的氨基酸称作重复可变双氨基酸残基位点（repeat-variable di-residues, RVD）。与锌指结构域一样，这种TALE重复模块也能够串联起来，识别一长串的DNA序列。TALEN分子比ZFN大得多，因此很难高效导入，科学家们也想出了不少的办法，如金门分子克隆技术（‘Golden Gate’molecular cloning）。TALENTALEN蛋白是一种源自植物致病菌——黄单包杆菌（Xanthomonas）的天然蛋白，其中也含有DNA结合结构域（图1B）。与锌指结构域一样，这种TALE重复模块也能够串联起来，识别一长串的DNA序列。不过与锌指蛋白不同的是，针对基因组中的某个位点，在连接 TALE蛋白的DNA识别模块时，接头没有太多的改造空间。经过前人对锌指蛋白开展的近 20年的科研工作，科学家们已经发现了大量的效应因子结构域（effector domain），比如核酸酶（nuclease）结构域、转录激活因子（transcriptional activator）结构域、位点特异性的重组酶（site-specific recombinase）结构域等，这些效应因子结构域都可以与 TALE蛋白DNA序列识别结构域搭配，对基因组中的目标位点进行各种遗传修饰。虽然TALEN蛋白DNA序列识别结构域能够识别单个碱基对的特性要比锌指蛋白的3碱基识别更富灵活性，在设计的时候可变性更强，但是克隆这么一大段TALE蛋白DNA序列识别结构域的重复编码序列也是一个不小的挑战。为了解决这个问题，科学家们也想出了不少的办法，现在就已经有好几种 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能够让科研人员快速地组装出任意搭配的TALE蛋白 DNA序列识别结构域。金门分子克隆技术（‘Golden Gate’molecular cloning）就是其中的一种解决方案，这是一种高通量的固态组装技术（solid-phase assembly），而且是一种不需要进行连接的克隆技术（ligation-independent cloning techniques）。有多个使用了各种组装策略的大规模的、系统性研究项目表明，TALE重复识别模块可以组装在一起，识别任何DNA序列。根据文献的报道，TALE蛋白在识别DNA序列方面存在的唯一限制就是它所识别的位点必须以T开始。最近有项研究指出，已经有人构建了一个 TALEN文库，能够靶向结合18740个人类编码基因，这说明构建TALEN蛋白并不是那么困难。这项“浩大的”工程不仅能够促进科研人员利用核酸酶开展更多的研究，同时也有利于鼓励大家开展类似的、更大规模的工作。目前也出现了商业化的人工TALE文库，比如法国巴黎的Cellectis Bioresearch公司、美国的Transposagen Biopharmaceuticals公司（Lexington, KY, USA）和生命科技公司（Life Technologies, Grand Island,NY, USA）都提供这类服务。 *CRISPR/Cas系统CRISPR/Cas系统的作用特性与限制性核酸内切酶相似，它对序列的特异性切割主要依赖于crRNA与Cas蛋白形成的核糖核蛋白复合物识别靶序列上的PAM以及protospacer．根据CRISPR/Cas系统这一特性，将其用于设计人工的核酸内切酶(engineeredendonuclease，EEN)，用来对我们感兴趣的基因位点进行修饰．三类CRISPR/Cas系统中TypeⅡ型系统的核糖核蛋白复合物相对简单，除crRNA和tracrRNA外，只有Cas9一个蛋白．目前，产脓链球菌(StreptococcuspyogenesSF370)的TypeⅡ型系统是被改造的最为成功的人工核酸内切酶。其基因座结构可分为三部分：5‘端为tracrRNA基因，中间为一系列Cas蛋白编码基因，包括Cas9、Cas1、Cas2和Csn2，3’端为CRISPR基因座，由启动子区域和众多的间隔序列(spacers)和重复序列(directrepeats)顺序排列组成。CRISPR/Cas的基因座结构CRISPR/Cas的作用机理（分为三个阶段来理解）：PhaseⅠPhaseⅡPhaseⅢ噬菌体或是质粒上与间隔序列对应的序列被称为protospacer，通常protospacer的5‘或是3’端延伸几个碱基序列很保守，被称为PAM(protospaceradjacentmotifs)，它的长度一般为2～5碱基，一般与protospacer相隔1～4碱基．新间隔序列的获得可能分为三步：首先识别入侵的核酸和扫描外源DNA潜在的PAM，将临近PAM的序列作为候选protospacer；然后在CRISPR基因座的5‘端合成重复序列；最后新的间隔序列整合到两个重复序列之间(图2)。目前只有第一个步骤被证实。第一，CRISPR的高度可变间隔区的获得* 第二，CRIPSR基因座的表达（包括转录和转录后的成熟加工）：多个研究表明CRISPR基因座首先被转录成前体CRISPRRNA(pre-crRNA)，然后在Cas蛋白或是核酸内切酶的作用下被剪切成一些小的RNA单元，这些小RNA即为成熟crRNA，由一个间隔序列和部分重复序列组成，TypeⅡ型CRISPR/Cas系统crRNA的成熟除了需要Cas9和RNaseⅢ参与以外，还需要tracrRNA的指导；第三，是CRISPR/Cas系统活性的发挥或者是对外源遗传物质的干扰：成熟的crRNA与特异的Cas蛋白形成核糖核蛋白复合物，再与外源DNA结合并扫描到外源DNA，寻找其上的靶序列，crRNA的间隔序列与靶序列互补配对，外源DNA在配对的特定位置被核糖核蛋白复合物切割．早期研究认为crRNA的间隔序列(spacer)与外源DNA的靶位点完全互补配对对于切割是必需的，但是后来的研究证明spacer与protospacer部分互补配对时切割也可以发生。2013年Thomas Gaj, Charles A. Gersbach, Carlos F. Barbas. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-basedmethodsfor genome engineering.Trends in Biotechnology, 09 May 2013; DOI: 10.1016/j.tibtech.2013.04.004CRISPR/Cas9、ZFNs、TALENs的比较 功能结构：ZFNs、TALENs人工核酸酶的原理是一样的，都是由DNA结合蛋白与核酸内切酶FokI融合而成，以二聚体形式发挥功能且只需要蛋白质元件。序列特异性由每条多肽的DNA结合域决定，剪切由FokI酶结构域决定。而CRISPR/Cas9系统由一个单体蛋白和一个嵌合的RNA构成，序列特异性由gRNA中20个碱基序列决定，剪切由Cas9蛋白执行。 设计难度：由于锌指蛋白与DNA互作的复杂性以及序列特异性的进一步限制，一般认为ZFNs的设计比较困难，成本昂贵，而且其专利被少数几家商业公司控制。商业化的ZFNs较使用公共资源设计的ZFNs效果好，但是贵得多(比如美国的Sangamo Biosciences（Richmond, CA, USA）公司和美国Sigma–Aldrich（St. Louis, MO, USA）公司合作，开发出的一套名为CompoZr的锌指蛋白构建系统）。TALENs要更容易设计一些，因为在蛋白质重复与DNA序列间有一对一的识别规则，而且高效的DNA组装技术，如GoldenGate克隆，简化了TALENs元件的组装，然而TALENs基于的高度重复序列会促使体内发生同源重组。目前也出现了商业化的人工TALEN文库，比如法国巴黎的Cellectis Bioresearch公司（一个未经验证的定制TALEN的价格是3360美元，验证过的是5000美元）、美国的Transposagen Biopharmaceuticals公司（Lexington, KY, USA）和生命科技公司（Life Technologies, Grand Island,NY, USA）都提供这类服务。相较而言，gRNA引导的剪切只依赖于与目标DNA序列进行简单的Watson-Crick碱基配对，因此不需要对每个目标位点进行复杂的蛋白质工程改造，而仅需修改gRNA中20个碱基序列来识别不同的目标位点。ZFNsandTALENsfunctionasdimersandonlyproteincomponentsarerequired.SequencespecificityisconferredbytheDNA-bindingdomainofeachpolypeptideandcleavageiscarriedoutbytheFokInucleasedomain.Incontrast,theCRISPR/Cas9systemconsistsofasinglemonomericproteinandachimericRNA.Sequencespecificityisconferredbya20-ntsequenceinthegRNAandcleavageismediatedbytheCas9protein.ThedesignofZFNsisconsidereddifficultduetothecomplexnatureoftheinteractionbetweenzincfingersandDNAandfurtherlimitationsimposedbycontext-dependentspecificity(Sanderetal.,2011).CommerciallyavailableZFNsgenerallyperformbetterthanthosedesignedusingpubliclyavailableresourcesbuttheyaremuchmoreexpensive(Ramirezetal.,2008).TALENsareeasiertodesignbecausethereareone-to-onerecognitionrulesbetweenproteinrepeatsandnucleotidesequences,andtheirconstructionhasbeensimplifiedbyefficientDNAassemblytechniquessuchasGoldenGatecloning(Engleretal.,2008).However,TALENsarebasedonhighlyrepetitivesequenceswhichcanpromotehomologousrecombinationinvivo(Holkersetal.,2013).Incomparison,gRNA-basedcleavagereliesonasimpleWatson–CrickbasepairingwiththetargetDNAsequence,sosophisticatedproteinengineeringforeachtargetisunnecessary,andonly20ntinthegRNAneedtobemodifiedtorecognizeadifferenttarget.* 靶标：ZFNs理论上可以靶定任何序列，但实际上，目标的选择受限于模块的可行性（基于序列依赖的组装平台合成）。利用公共数据库，基因组DNA序列上平均每100bp就可制备1个功能性ZFNs。TALENs靶标受限于需要第一个碱基是胸腺嘧啶，另外，不是所有的TALENs都能在体外有效工作，而且一些还不能产生预期的突变，这就意味着每个TALEN对都需要进行实验验证。比较而言，CRISPR/Cas9系统理论上仅需在目标位点上游含有NGG（或NAG）PAM模体，但是，不能完好匹配的间隔序列可能会引起脱靶剪切，因此gRNA的序列必须仔细设计，以避免脱靶发生，因此实际上能剪切的目标位点会有所减少。Xieetal.利用哺乳动物的CRISPR/Cas9系统进行计算机模拟 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 表明，在8个代表性植物（拟南芥、蒺藜状苜蓿、大豆、番茄、短柄草、水稻、高粱、玉米）的基因组中，每100bp可鉴定到5-12个NGG-PAM，PAMs的数量与基因组大小相关，相同基因组大小的单子叶植物较双子叶植物含有更多的特异gRNA。除玉米外，可以设计特异gRNA编辑85%-99%的已注释转录单元，其中68%-96%的转录单元含有至少10个不同的可定位NGG-PAM位点；玉米是8个物种中基因组最大、被注释的基因数最多的物种，仅30%的转录单元可以设计特异的gRNA进行编辑，这与基因组的复杂性和序列结构相关。可以预测，小麦、大麦等基因组比玉米更大的物种可能会面临相同的问题。但是，将来通过使用与有不同PAM要求的Cas9同源蛋白，可以拓展CRISPR/Cas系统在植物基因组中的应用范围。CRISPR/Cas9、ZFNs、TALENs的比较ZFNscantheoreticallytargetanysequencebutinpracticethechoiceoftargetsislimitedbytheavailabilityofmodulesbasedonthecontextdependentassemblyplatform(Sanderetal.,2011).AfunctionalZFNpaircanbepreparedforevery~100bpofDNAsequenceonaverageusingpubliclyavailablelibraries(Kimetal.,2009).TALENtargetsarelimitedbytheneedforathymidineresidueatthefirstposition(Doyleetal.,2012),butnotallTALENsworkefficientlyinvivoandsomepairsthereforefailtogeneratetheanticipatedmutations,whichmeansthateachTALENpairmustbeexperimentallyvalidated(Hwangetal.,2013).Incontrast,theonlytheoreticalrequirementoftheS.pyogenesCRISPR/Cas9systemisthepresenceoftheNGG(orNAG)PAMmotifdownstreamofthetargetsequence.However,imperfectlymatchedspacersequencescanresultincleavageatoff-targetpositions,whichmeansthatgRNAsequencesmustbechosencarefullytoavoidsuchartifactsthusreducingthenumberoftargetsthatcanbeusedinpractice.Anextensiveinsilicoanalysisofnucleargenomesequencesfromeightrepresentativeplantspecies(Arabidopsis,Medicagotruncatula,soybean,tomato,Brachypodiumdistachyon,rice,sorghumandmaize)hasbeenusedtopredictspecificgRNAspacerswithminimaloff-targetcleavageusingdatafrommammaliansystems(Xieetal.,2014).Thisidentified5–12NGG-PAMsforevery100bpofgenomicDNA.ThetotalnumberofPAMscorrelatedwithgenomesize,butagreaternumberofspecificgRNAswaspredictedinmonocotgenomescomparedtodicotgenomeswhendifferencesingenomesizeweretakenintoaccount.Forallspeciesexceptmaize,itwaspossibletodesignspecificgRNAstotarget85–99%ofcurrentlyannotatedtranscriptunits,with68–96%ofthesetranscriptionunitscontainingatleast10differenttargetableNGG-PAMsites.Inmaize,whichhasthelargestgenomeandgreatestnumberofannotatedgenesamongtheeightspeciesthatwereanalyzed,only30%ofthetranscriptionunitscouldbetargetedbyspecificgRNAs.ThelackofspecificgRNAsforsomanymaizegenesprobablyreflectsthegenomecomplexity(duplicationevents)andgenomicsequencecontext.Itisthereforeanticipatedthatwheatandbarley,withevenlargergenomesthanmaize,maypresentsimilarchallengesforCRISPR/Cas9-mediatedgenomeediting(Xieetal.,2014).Inthefuture,therangeofplantgenomicsequencesamenabletotheCRISPR/CassystemcouldbeexpandedbyusingCas9homologswithdifferentPAMrequirements.* 剪切特点：ZFNs和TALENs均携带限制性内切酶FokI的活性域，能够产生带有粘性末端的一个DSB，其依据连接子和间隔子的差异而有不同的长度。Cas9有两个剪切域RuvC和HNH，在目标DNA序列PAM上游3个碱基处进行剪切，产生平齐末端（在体外，Cas9偶尔也能产生1-2个碱基的粘性末端）。特定的粘性末端对于DNA分子的精细插入十分有益，它由NHEJ介导相容末端连接完成。利用好双切口酶方法，CRISPR/Cas9系统也能产生这样的结构。 效率：CRISPR/Cas9系统在植物中可实现高突变率，效率与ZFNs和TALENs相当或更高。突变的效率受目标序列差异、gRNA的序列或结构、Cas9的版本（不同物种的密码子优化）和gRNA的表达策略等影响。而且报道的突变率与分析方法的灵敏性有关，所以并不奇怪对于相同物种不同人报道的突变率差异较大。CRISPR/Cas9、ZFNs、TALENs的比较ZFNsandTALENsbothcarrythecatalyticdomainoftherestrictionendonucleaseFokI,whichgeneratesaDSBwithcohesiveoverhangsvaryinginlengthdependingonthelinkerandspacer.Cas9hastwocleavagedomainsknownasRuvCandHNH(Fig.2),whichcleavethetargetDNAthreenucleotidesupstreamofthePAMleavingbluntends(Jineketal.,2012).Occasionally,Cas9producesoverhangsof1–2ntinvitro(Gasiunasetal.,2012;Jineketal.,2012).DefinedoverhangsareusefulforthepreciseinsertionofDNAmoleculeswithcompatibleoverhangs,whichoccursbyNHEJ-mediatedligation(Cristeaetal.,2013;Marescaetal.,2013).Asdiscussedbelow(Section6),theCRISPR/Cas9systemcanalsobeusedtocreatesuchstructuresusingthedouble-nickaseapproach(Ranetal.,2013).Asinmammals,theCRISPR/Cas9systemhasbeenshowntoachievehighmutationratesinplants,matchingorexceedingthoseobtainedwithZFNsandTALENs(Lozano-JusteandCutler,2014).However,itshouldbenotedthatthemutationratecanbeinfluencedbydifferencesinthetargetsequences,thegRNAstructure/sequence,theversionofCas9(codon-optimizedfordifferentspecies)andthegRNAexpressionstrategy.Furthermore,thereportedmutationratecandependonthesensitivityoftheanalyticalmethod(e.g.,T7endonucleaseIorSurveyorassay,PCR/restrictionanalysisorPCR/directsequencing).Therefore,itisnotsurprisingthatreportedmutationratesvaryevenwithinthesamespecies.*四、CRISPR/Cas9系统的优势 简单（Simplicity）、易获取Accessibility低成本（Cost）、用途广（versatility） 区别于ZFNs和TALENs，不需要蛋白质工程，因此针对每个目标基因可检测多个gRNA，更加直接；不需要克隆，针对不同的目标特异性仅需改变gRNA的20个碱基；任意数量的gRNA都可以通过体外转录法，利用两条互补的退火寡核苷酸链制备而成；大型gRNA库的组装因此并不昂贵，从而使CRISPR/Cas9系统能够应用于高通量功能基因组学研究，而且任何分子生物学实验室都承担得起基因组编辑的预算费用。Unlikeitspredecessors,theCRISPR/Cas9systemdoesnotrequireanyproteinengineeringsteps,makingitmuchmorestraightforwardtotestmultiplegRNAsforeachtargetgene.Furthermore,only20ntinthegRNAsequenceneedtobechangedtoconferadifferenttargetspecificity,whichmeansthatcloningisalsounnecessary.AnynumberofgRNAscanbeproducedbyinvitrotranscriptionusingtwocomplementaryannealedoligonucleotides(Choetal.,2013).ThisallowstheinexpensiveassemblyoflargegRNAlibrariessothattheCRISPR/Cas9systemcanbeusedforhigh-throughputfunctionalgenomicsapplications,bringinggenomeeditingwithinthebudgetofanymolecularbiologylaboratory.* 区别于ZFNs和TALENs，CRISPR/Cas9系统能剪切人类细胞中的甲基化DNA，从而进行遗传修饰，这是其它核酸酶无法实现的。 植物中，这一方面还没有进行专门研究，但是有理由相信剪切甲基化DNA是CRISPR/Cas9系统所特有的，并且与目标基因组无关。 植物中大约70%的CpG/CpNpG都是甲基化的，尤其是在启动子区及第一个外显子区的CpG岛。因此，总体来说，CRISPR/Cas9系统对于植物的基因组编辑更具通用性，尤其适合于GC含量高的单子叶植物基因组，如水稻。CRISPR/Cas9系统的优势UnlikeZFNsandTALENs,theCRISPR/Cas9systemcancleavemethylatedDNAinhumancells(Hsuetal.,2013),allowinggenomicmodificationsthatarebeyondthereachoftheothernucleases(Dingetal.,2013).Althoughthisaspecthasnotbeenspecificallyexploredinplants,itisreasonabletoassumethattheabilitytocleavemethylatedDNAisintrinsictotheCRISPR/Cas9systemandnotdependentonthetargetgenome.Approximately70%ofCpG/CpNpGsitesaremethylatedinplants,particularlytheCpGislandsfoundinpromotersandproximalexons(VanyushinandAshapkin,2011).TheCRISPR/Cas9technologyisthereforemoreversatileforgenomeeditinginplantsgenerallybutparticularlysuitableformonocotswithhighgenomicGCcontentsuchasrice(Miaoetal.,2013).ConventionalTALENscannotcleaveDNAcontaining5-methylcytosinebutmethylatedcytosineisindistinguishablefromthymidineinthemajorgroove.Therefore,therepeatthatrecognizescytosinecanbereplacedwitharepeatwhichrecognizesthymidine,generatingTALENsthatcancleavemethylatedDNAalbeitattheexpenseoftargetspecificity(Dengetal.,2012;Valtonetal.,2012* CRISPR/Cas9系统较ZFNs和TALENs，最主要的应用优势是易于多位点编辑，即同时在多个位点引入DSBs，从而同时编辑多个基因。尤其有利于对冗余基因或代谢路径进行敲除。 相同的策略还可用于在同一染色体的两个相距较远的剪切位点间引入大片段缺失或遗传转换。 利用CRISPR/Cas9系统进行多位点编辑仅需要单个Cas9蛋白和多个不同序列特异性的gRNA，相反，使用ZFNs或TALENs进行多位点编辑需要针对每个位点特异性的不同二聚体蛋白。CRISPR/Cas9系统的优势ThemainpracticaladvantageofCRISPR/Cas9comparedtoZFNsandTALENsistheeaseofmultiplexing.ThesimultaneousintroductionofDSBsatmultiplesitescanbeusedtoeditseveralgenesatthesametime(Lietal.,2013;Maoetal.,2013)andcanbeparticularlyusefultoknockoutredundantgenesorparallelpathways.Thesamestrategycanalsobeusedtoengineerlargegenomicdeletionsorinversionsbytargetingtwowidelyspacedcleavagesitesonthesamechromosome(Lietal.,2013;Upadhyayetal.,2013;Zhouetal.,2014).MultiplexeditingwiththeCRISPR/Cas9systemsimplyrequiresthemonomericCas9proteinandanynumberofdifferentsequence-specificgRNAs.Incontrast,multiplexeditingwithZFNsorTALENsrequiresseparatedimericproteinsspecificforeachtargetsite.* CRISPR研究界实施的开放获取政策也促进了这一技术的快速传播和应用。与ZFN平台的所有权性质不同，CRISPR研究界提供开放性的质粒、网络工具（用于筛选gRNA序列以及预测特异性），同时主持活跃的讨论组。这些设施机构鼓励更多人利用这一技术，进而促进了对其更深的了解与应用。CRISPR/Cas9系统的优势Finally,theopenaccesspolicyoftheCRISPRresearchcommunityhaspromotedthewidespreaduptakeanduseofthistechnologyincontrast,forexample,totheproprietarynatureoftheZFNplatform.Thecommunityprovidesaccesstoplasmids(e.g.,viathenon-profitrepositoryAddgene),webtoolsforselectinggRNAsequencesandpredictingspecificity(e.g.,forplantgenomes:http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR;ttp://www.genome.arizona.edu/crispr/;andhttp://www.rgenome.net/cas-offinder,http://www.e-crisp.org/E-CRISP/index.html)andhostsactivediscussiongroups(e.g.:https://groups.google.com/forum/#!forum/crispr).Thesefacilitieshaveencouragednewcomerstoadoptthetechnologyandcontributedtotherapidprogressinourunderstandingofthesystemanditspracticalapplications.*CRISPR/Cas9的特异性（relaxedspecificity） CRISPR/Cas9系统存在的一个争议是早期报道的相对较高的脱靶突变，随后研发出了一些策略来减少脱靶编辑发生 最重要的是谨慎设计gRNA（gRNA的脱靶效应可以快速、便宜的检测出来） 优化核酸酶的表达（高浓度的Cas9和gRNA可以提高脱靶效应） 采用突变的Cas9蛋白版本，将其转化为切口酶，使用两个Cas9切口酶可以引入偏移的单链缺口，产生一个交错的DSB，这个策略提高了识别碱基的特异性 失活的Cas9与FOKI融合 改变gRNA的长度 脱靶效应在相同物种的不同细胞类型中差异较大**CRISPR-Cas9基因编辑技术的研究及应用历史 1987年，发现串联间隔重复序列（CRISPR） 2005年，推测CRISPR的生物功能（与细菌抵抗外源遗传物质入侵的免疫系统有关） 2007年，证实CRISPR序列与Cas基因结合抵抗病毒入侵，由此揭开了