微生物发酵法生产大豆肽的研究

微生物发酵法生产大豆肽的研究 专业名称:生物技术 指导老师:学生姓名: 论文提交时间:2008.6.1 毕业学校:安徽科技学院 摘要：大豆肽是以大豆蛋白为主要原料，用酶解法或微生物发酵法生产的，主要成分为 肽，相对分子质量分布在10000Da以下的蛋白类产品。与大豆蛋白相比大豆肽具有良好的理化性质和生理活性。水解大豆蛋白生产大豆肽己成为大豆深加工的一个重要方面。 通过对培养基组成、pH值、接种时间、接种量、发酵时间等因素的研究,优化了发酵法 制备大豆多肽的生产工艺。结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明:在葡萄糖含量为2%,豆粕含量为12%,初始pH值为 7.0,接入4%的菌龄为15 h的液体种子,发酵时间为48 h的条件下,豆粕蛋白的多肽增量达 35%。 关键词：大豆肽;多肽增量;豆粕 Abstract: The soybean peptide is take the soy protein as the primary data, with the enzymolysis law or the microorganism zymotechnics production, the principal constituent is the peptide, the relative molecular mass distributes in the 10000Da following protein class product. Compares the soybean peptide with the soy protein to have the good physics and chemistry nature and the biological activity. Hydrolisis soy protein production soybean peptide oneself becomes the soybean intensive processing an important aspect. Through to factor and so on culture medium composition, pH value, vaccination time, vaccination quantity, fermentation time research, optimized the zymotechnics preparation soybean multi-peptide technique of production. The result indicated: In the glucose content is 2%, the bean cake content is 12%, the initial pH value is 7.0, turns on 4% cell ages is 15 h liquid seeds, the fermentation time is under 48 h conditions, the bean cake protein's degree of hydrolysis - 1 - reaches 35%. key word: soybean peptide; Degree of hydrolysis; Bean cake 目录 1.引言 1.1大豆肽的定义 1.2大豆肽的理化性质 1.3大豆肽生理功能及应用 1.4大豆多肽的生产制备方法 2.材料与方法 2.1主要材料 2.2主要仪器设备 2.3试验药品 2.4培养基 2.5发酵液中蛋白酶活的测定 2.6 考马斯亮蓝显色法测定大豆水解的多肽增量 3.结果与讨论 3.1不同碳源对蛋白多肽增量的影响 3.2不同碳源浓度对蛋白多肽增量的影响 3.3不同氮源浓度对蛋白多肽增量的影响 3.4初始pH值对蛋白多肽增量的影响 3.5接种量对蛋白多肽增量的影响 3.6发酵时间对蛋白多肽增量的影响 3.7小结 - 2 - 4.结论与展望 参考文献 致谢 附录 引言 大豆是一种优良的植物蛋白资源,经过加工制成的豆粕必需氨基酸丰富,是动物日粮中常用的植物蛋白质原料。目前,大豆肽已广泛地应用于饲料行业,其促进饲养动物生长和增强动物免疫力的功能已得到验证[1-4]。 大豆肽的生产方法有直接酶解法和发酵法。直接酶解法由于使用高价格的酶而提高 了大豆肽的生产成本,因而限制了其在饲料行业中的应用;发酵法由于把蛋白酶的发酵生产和大豆肽的酶解生产结合在一起,降低了大豆肽的生产成本,应用前景较好。本文用高产蛋白酶的枯草芽孢杆菌进行发酵法生产大豆肽的研究,旨在为大豆肽的发酵法生产提供参考。 1.1大豆肽的定义 已经通过国家发展和改革委员会批准，于2005年1月1日起正式实施的大豆肽粉行业标准(QB/T2653一2004)，是我国第一个大豆肽类配料的全国性行业标准。标准中 将大豆肽粉定义为“以大豆蛋白为主要原料，用酶解法或微生物发酵法生产的，主要成 分为肽，且相对分子质量分布在10000Da以下的粉末状产品”。主要成分为分子链不等 的各级肽类，还包括一些游离氨基酸、少量糖类、水分、灰分等[4]。 1.2大豆肽的理化性质 大豆多肽的蛋白质含量在80%以上，氨基酸组成几乎与大豆蛋白质完全一样，必需 氨基酸的平衡良好，含量也丰富。大豆多肽平均肽链长度较短，以低分子肽为主。由于 相对分子质量低，水溶性高，因此具有低粘度和水溶性高的特点。大豆蛋白的粘度随浓 度的增高而急剧上升，而大豆多肽的粘度随浓度升高，加大的程度却很有限，即使50% - 3 - 的高浓度下也仍具有很好的流动性。且大豆多肽的溶解性好于大豆蛋白，大豆蛋白在等 电点pH.45附近将形成沉淀，而大豆多肽在较宽pH范围内仍保持溶解状态，并且具有抑制蛋白质形成凝胶、调整蛋白质硬度、易消化吸收等特性。大豆多肽溶液的渗透压处 于蛋白质与氨基酸同一组成的氨基酸混合物之间，不会引起腹泻等不良反应。 1.3大豆肽生理功能及应用，，，，，，，[45789111314] 大豆蛋白经蛋白酶水解或微生物作用后形成的大豆多肽与蛋白质和氨基酸相比，更 易被人体消化、吸收，而且具有多种生理功能:?低过敏性;?促进脂肪代谢和抗肥胖;? 降血压;?降血脂和胆固醇;?增强运动员肌肉和消除疲劳;?促进矿物质吸收的等作用。可以说大豆多肽是比大豆蛋白更优质的蛋白质。目前对大豆多肽生理活性的研究中以其 降血压功能研究的最多。 1.4大豆多肽的生产制备方法 1.4.1酶法大豆肽的制备方法及研究进展 大豆蛋白水解研究起始于20世纪60年代，当时采用酸、碱化学试剂在一定温度下 促使蛋白质分子的肽链断裂形成小分子物质，即多肽。由于酸、碱水解法存在许多不足 之处，如营养成分损失，水解无特异性，副反应多，水解产物感官性能差等，因此这方 面的研究进展缓慢。20世纪80年代酶化学迅猛发展，美国、日本对大豆蛋白的酶解工 艺和酶解过程的研究取得了较大的进展。蛋白酶水解因其反应温和、对氨基酸破坏性效 等优势，成为当前最主要的多肽制备方法。 1.4.2发酵法大豆肽的制备方法及研究进展 采用发酵法生产大豆蛋白多肽代替传统的酶法水解蛋白的方法，不仅在营养价值上 具有较大的潜能，而且降低了成本，同时通过微生物作用对某些苦味肽基团进行修饰和 重组，使小肽之间、小肽与氨基酸之间发生移接、重排，制得的大豆蛋白肽具有溶解性 好，无苦味和异味，口感好等优点[15，19，20，21]。 1.4.3原料的选择 大豆、大豆分离蛋白及豆粕粉在市场上价格相差很大，表1-1是中国大豆网提供的部分地区市场销售价格。 表1-1国产二级大豆、大豆分离蛋白、豆粕粉市场销售价格比较(元/千克) - 4 - 从成本价格的角度和养分含量考虑，大豆及豆粕粉有绝对的优势，因此，实验采用 大豆和豆粕作为生产大豆多肽的原料。 - 5 - 2 材料与方法 2.1主要材料 枯草芽孢杆菌由本实验室自行选育;豆粕为附近养殖场购买,粉碎后过60目筛。 2.2主要仪器设备 仪器 生产厂家 超净工作台 上海博讯实业有限公司 控温摇床 上海博讯实业有限公司 三角烧瓶250ml 泰兴台兴玻璃制品有限公司 TD5台式离心机 湖南湘仪科学仪器设备有限公司 722型分光光度计 上海分析仪器厂 移液枪1000μL 上海精密仪器仪表有限公司 2.3试验药品 药品 生产厂家 葡萄糖 上海国药集团 氯化钠 上海国药集团 蛋白胨 上海国药集团 牛肉膏 上海国药集团 琼脂 上海国药集团 钨酸钠 上海国药集团 钼酸钠 上海国药集团 85%磷酸 上海国药集团 浓盐酸 上海国药集团 硫酸锂 上海国药集团 碳酸钠 上海国药集团 三氯乙酸 上海国药集团 氢氧化钠 上海国药集团 干酪素 2.4培养基 - 6 - 种子液培养基：20g葡萄糖，15g蛋白胨，5g氯化钠，0.5g牛肉膏，20g琼脂，加蒸馏水至1000mL，PH7.0，经0.1MPa高压蒸汽灭菌30min，37?恒温摇床120rpm24小时。 种子液菌体生长曲线测定：从活化后的菌种保藏斜面中以无菌操作挑取两环接种于种子 培养基中，37?，120rpm，每隔2小时取一次样(5mL)，高速离心沉淀菌体(1600rpm，20min)，去除上清液后，菌体沉淀以无菌蒸馏水悬浮，混匀定容至10mL，于600nm处测定吸光度。 2.5发酵液中蛋白酶活的测定 以酪蛋白(2%)为底物，采用Folin一酚法测定[14]，一个蛋白酶活力单位(U)定义 为每分钟释放出1μg酪氨酸所需的酶量。 2.5.1 试验试剂 1.福林试剂的制备 于2000mL磨口回流装置中加入钨酸钠（Na WO?2HO）100g、钼酸钠242 （NaMoO?2HO）25g、水700mL、85%磷酸50mL、浓盐酸100mL，小火沸腾回流242 10h，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂（LiSO）50g、水50mL和数滴浓溴水24 （99%），再微沸15min，以除去多余的溴（冷后仍有绿色需再加溴水，再煮沸除去过量 的溴），冷却，加水定容至1 000mL。混匀，过滤。制得的试剂应呈金黄色，贮存于棕 色瓶内。 使用溶液：1份福林试剂与2份水混合，摇匀。 2. 碳酸钠溶液c（NaCO）=0.4mol／L 23 称取无水碳酸钠42.4g，用水溶解并定容至1 000mL。 3. 三氯乙酸c（CCl ?COOH）＝0.4mol／L 3 称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1 000mL。 4. 氢氧化钠溶液c（NaOH）＝0.5mol／L 按GB601配制。 5. 盐酸溶液c（HCl）＝lmol／L及0.lmol／L 按GB601配制。 6. 硼酸缓冲溶液（pH10.5） 甲液称取硼酸钠（硼砂）19.08g，加水溶解并定容至1 000mL。 乙液称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1 000mL。 - 7 - 使用溶液：取甲液500mL、乙液400mL混匀，用水稀释至1 000mL。 上述各种缓冲溶液，均需用pH计校正。 7. 10g／L酪素溶液 称取酪素1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol／L氢氧化钠溶液湿润后，加入适量的各种适宜pH值的缓冲溶液约80mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解， 冷却后，转入100mL容量瓶中，用适宜的pH值缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内 贮存，有效期为3天。 注：酪素采用上海化学试剂采购供应站经销的试剂。 8. 100μg／mL L-酪氨酸标准溶液 （1）称取预先于105?干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g，精确至0.0002g，用1mol／L盐酸60mL溶解后定容至100mL，即为1mg／mL酪氨酸标准溶液。 注：L-酪氨酸采用上海长江生化制药厂产品。 （2）吸取1mg／mL酪氨酸标准溶液10.00mL，用0.1mol／L盐酸定容至l00mL，即得到100μg／mL L-酪氨酸标准溶液。 2.5.2实验仪器 1. 恒温水浴（40+0.2）?。 2. 分光光度计应符合GB 9721的规定。 2.5.3 试验步骤 （一）标准曲线的绘制 1. L-酪氨酸标准溶液 管号 酪氨酸标准溶液的浓取100μg／mL 酪氨酸标准取水的体积 V/mL 度c/(μg／mL) 溶液的体积V/mL 0 0 0 10 1 10 1 9 2 20 2 8 3 30 3 7 4 40 4 6 5 50 5 5 2. 分别取上述溶液各100mL（需做平行试验），各加0.4mol／L碳酸钠溶液5.00mL、 - 8 - 福林试剂使用溶液l.00mL，置于（40?0.2）?水浴中显色20min，取出，用分光光度计于波长680nm，10mm比色皿，以不含酪氨酸的0管为空白，分别测定其吸光度，以吸 光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线（此线应通过零点）。 根据作图或用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常数K值。其K值应在95-100范围内。 吸取液体酶1.00mL，用少量该酶的缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，然后将上清液 小心倾入容量瓶中，沉渣中再添加少量上述缓冲液如此溶解、捣研3-4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，摇匀。用4层纱布过滤，滤液根据酶活力再一次用 缓冲液稀释至适当浓度，供测试用（稀释至被测试液吸光值在0.25-0.40范围内）。 2. 测定 （1）先将酪素溶液放入（40?0.2）?恒温水浴中，预热5min。 （2）按下列程序操作： 试管A（空白） 试管B（酶试样，需做3个平行试样） ? ? 加酶液1.00mL 加酶液1.00mL ?（40?0.2）?，2min ?（40?0.2）?，2min 加三氯乙酸2 .00mL（摇匀） 加酪素1.00mL（摇匀） ?（40?0.2）?，10min ?（40?0.2）?，10min 加酪素1.00mL（摇匀） 加三氯乙酸2 .00mL（摇匀） ? ? 取出静置10min，过滤 取出静置10min，过滤 ? ? 取1.00mL滤液 取1.00mL滤液 ? ? 加碳酸钠溶液5.0mL 加碳酸钠溶液5.0mL ? ? 加福林试剂使用液1.00 mL 加福林试剂使用液1.00mL ?（40?0.2）?，显色20min ?（40?0.2）?，显色20min 于680nm波长，用10mm比色皿， 于680nm波长，用10mm比色皿， - 9 - 测其吸光度 测其吸光度 2.5.4试验数据整理 X＝A×K×4／10×n=2／5×A×K×n 式中：X—种子液的酶活力（IU／g或IU／mL） A—样品平行试验的平均吸光度 K—吸光常数 4—反应试剂的总体积（mL） 10—反应时间 n—稀释倍数 所得结果表示至整数，平行实验相对误差不得超过3%最后测得枯草芽孢杆菌种子液的酶活力为376.02U/mg。 2.6 考马斯亮蓝显色法测定大豆水解的多肽增量 2.6.1 考马斯亮蓝G-250的配制 100mg考马氏亮蓝G250溶于somL95%乙醇中，加入100mL85%磷酸，最后用蒸馏水稀释至100mL。 2.6.2考马斯亮蓝测定蛋白含量原理 考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝在游离状态 下呈红色，最大光吸收在488nm；当他与蛋白质结合后变为清色，蛋白质-色素结合物在595 nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白含量成正比，因此可用于蛋白质含 量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，实际配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白含量，测定蛋白质浓度范围为0~1000μg/mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。 - 10 - 3 结果与讨论 3.1发酵菌株的生长曲线 Bacillus .subtilis生长繁殖速度非常快，在适宜条件下，20-30min就可以分裂一次。从图3-1可以看到，在发酵的开始阶段，菌体数目增加并不多(0-10h)，一定时间后，菌体数目增长很快(12-28h)，继而菌体数目增长保持稳定(30-40h)，最后菌体数目开始负增长(40~48h)。因此，12-28h是本菌株的对数期，由于对数期的微生物细胞生长平衡，菌 体内酶系活跃，代谢旺盛，群体的形态与生理特征最一致，并且抗不良环境的能力强， 所以在本实验中，均以培养24h左右的菌株为种子液。 发酵菌株生长曲线 3-1 3.2 发酵液中菌体浓度及pH变化 发酵液在整个发酵进程中pH的变化是先下降后增加的（如图3-2），可能是因为发酵培养基的碳源是葡萄糖，为一种速效碳源，而氮源主要是豆粕来体提供，是长效的氮 源。因此在发酵初期，菌体迅速利用分解葡萄糖的结果使得产酸大于产碱，导致pH下 降;随着发酵得继续进行，豆粕中得大豆蛋白开始被利用分解，菌体代谢中产生更多的是 碱性类氮源分解物(如氨等)，从而导致pH上升。从菌体浓度上看，在24-48h菌体生长达到旺盛期，相对应的此时pH也迅速开始上升。发酵液中pH的变化是由菌体生长代谢造成的，反过来pH又会最终影响到菌体的生长，产酶和所产酶类的水解活性。到发 酵液中碱性过强时，便抑制了菌体的生长，成为发酵后期(48~64h)菌体浓度下降的一个 - 11 - 重要因素。 3-2 pH (pH.) 3.3不同碳源对蛋白多肽增量的影响 分别以2%的葡萄糖、蔗糖、淀粉为碳源,以10%豆粕为氮源,进行发酵试验,48 h后测定豆粕蛋白多肽增量(见图3-3) 蔗糖 葡萄糖 淀粉 OD0.195 0.201 0.198 水解前 0.220 0.246 0.222 OD 水解后 12.8% 22.4% 12.1% 多肽增量 - 12 - 25 20 15 10 多肽增量（%） 5 0 蔗糖 葡萄糖 淀粉 图3-3 不同碳源对蛋白多肽增量的影响 由图3-3可知,在相同的发酵时间和温度条件下，不同的碳源对豆粕蛋白的多肽增量 影响较大。为了找到合适的碳源，对不同碳源的豆粕发酵液用考马斯亮蓝G-250染色并 在595nm测定其吸光度，比较不同碳源的多肽增量，可明显看出葡萄糖的效果最好，因 此选择葡萄糖作为发酵液的碳源。 3.4不同碳源浓度对蛋白多肽增量的影响 分别以1%、2%、3%、4%的葡萄糖为碳源,以10%的豆粕为氮源,进行发酵试验,48 h 后测定豆粕蛋白的多肽增量。结果见图3-4. 1%G 2%G 3%G 4%G OD 0.241 0.246 0.257 0.295 水解前 0.260 0.285 0.282 0.311 OD 水解后 7.9% 15.8% 9.7% 5.4% 多肽增量 - 13 - 18 16 14 12 10 8 6多肽增量（%）4 2 0 1%G 2%G 3%G 4%G 图3-4 不同碳源浓度对蛋白多肽增量的影响 由图3-4结果可知,在选取碳源的基础上，在相同的发酵时间和温度条件下，葡萄糖 的含量对蛋白多肽增量影响较大,为了确定最佳碳源浓度，对不同碳源浓度的豆粕发酵液 用考马斯亮蓝G-250染色并在595nm测定其吸光度，比较不同碳源的多肽增量，明显 看出以含量为2%的葡萄糖水解效果最好，因此以豆粕发酵液以2%的葡萄糖作为其培养基含量。 3.5不同氮源浓度对豆粕蛋白多肽增量的影响 在以2%的葡萄糖为碳源的基础上,分别添加8%、9%、10%、11%、12%、13%的豆 粕进行发酵试验,48 h后测定豆粕蛋白多肽增量。结果见图3-5 8%N 9%N 10%N 11%N 12%N 13%N 0.181 0.181 0.190 0.201 0.206 0.213 OD水解前 0.214 0.217 0.228 0.243 0.254 0.261 OD水解后 18.2% 19.9% 20.0% 20.9% 23.3% 22.5% 多肽增量 - 14 - 25 20 15 10 多肽增量（%）5 0 8%N 9%N 10%N 11%N 12%N 13%N 图3-5 不同氮源浓度对豆粕蛋白多肽增量的影响 由图3-5结果可知:在确定了碳源和碳源浓度的情况下，不同氮源浓度对蛋白多肽增 量影响较大。在相同的发酵时间和温度条件下，对不同氮源浓度的豆粕发酵液用考马斯 亮蓝G-250染色并在595nm测定其吸光度，比较不同碳源的多肽增量，当豆粕含量为 12%时,豆粕蛋白水解效果最好，因此以豆粕发酵液以12%的豆粕作为其培养基含量。 3.6初始pH值对豆粕蛋白多肽增量的影响 分别在pH值为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的条件下进行发酵试验,48 h后测定豆 粕蛋白多肽增量。结果见表3-7。 PH6.0 PH6.5 PH7.0 PH7.5 PH8.0 PH8.5 0.214 0.228 0.231 0.266 0.284 0.290 OD水解前 0.264 0.290 0.305 0.340 0.348 0.340 OD水解后 23.4% 27.2% 32.0% 27.8% 22.5% 17.2% 多肽增量 - 15 - 4035353030 2525 2020 1515多肽增量（%）1010多肽增量（%）550 01% 2% 3% 4% 5% 6% PH6.0 PH6.5 PH7.0 PH7.5 PH8.0 PH8.5 图3-6 初始pH值对蛋白多肽增量的影响 由图3-6结果可知: 在确定了碳源、碳源浓度和氮源的情况下，初始pH值对蛋白 多肽增量的影响较大，不同初始pH值的豆粕发酵液其595nm吸光度变化也很大，比较 不同初始PH的多肽增量，可见当发酵培养基初始pH值为7.0时,豆粕蛋白水解效果最 好。 3.7接种量对豆粕蛋白多肽增量的影响 将接种量为1%、2%、3%、4%、5%、6%的菌龄为15 h的液体种子接入到上面优 化的培养基上进行发酵试验,48 h后测定豆粕蛋白的多肽增量。结果图3-7。 1% 2% 3% 4% 5% 6% 0.227 0.227 0.227 0.227 0.227 0.227 OD水解前 0. 287 0. 296 0.305 0.313 0.309 0.302 OD水解后 22.2% 30.4% 34.4% 37.9% 36.1% 33.0% 多肽增量 图3-7 接种量对豆粕蛋白多肽增量的影响 由图3-7结果可知:在上述优化的条件下，接种量对蛋白多肽增量的影响较大，比较 不同接种量其发酵液595nmOD值，当接种量为4%时,豆粕蛋白水解效果最好。 3.8发酵时间对蛋白多肽增量的影响 在上面优化的发酵条件下,进行发酵试验。分别于28、32、36、40、44、48、52、56 - 16 - h时测定豆粕蛋白的多肽增量。结果见图3-8。 28h 32h 36h 40h 44h 48h 52h 56h 0.223 0.223 0.223 0.223 0.223 0.223 0.223 0.223 OD 水解前 0.292 0.294 0.298 0.303 0.308 0.313 0. 315 0.316 OD 水解后 30.9% 31.8% 33.6% 35.9% 38.1% 40.4% 41.2% 41.7% 多肽增量 45 40 35 30 25 20 15多肽增量（%）10 5 0 28h 32h 36h 40h 44h 48h 52h 56h 图3-8 发酵时间对蛋白多肽增量的影响 根据图3-8结果可知,在确定了碳源、碳源浓度、氮源、初始PH和接种量的情况下，发酵时间对豆粕蛋白的多肽增量的影响较大。28h后测定豆粕发酵液的多肽增量，以后 每隔4h测定一次，共测8次，可见随发酵时间的延长,多肽增量明显增加,当48 h后多肽增量增加幅度不大,综合考虑,最佳发酵时间为48 h。 3.9小结 本文就发酵法制备大豆肽的工艺进行了摇瓶发酵试验,研究了培养基的组成、菌龄、接种量、发酵时间等因素对大豆蛋白多肽增量的影响;并且在最终优化的发酵条件下,豆 粕蛋白的多肽增量达60%。本文运用枯草芽孢杆菌进行发酵法制备大豆肽具有生产成本 低、多肽增量高的特点,表明发酵法在工业化生产大豆肽上是很有潜力的方法。 - 17 - 结论 由本实验室所筛选保藏B. subtilis，能在以豆粕为主的液体培养基上良好生长，并 在生长代谢过程中分泌胞外蛋白酶和梭肽酶，在发酵过程中将原料中的大豆蛋白水解成 短链肽，切除肽链末端疏水性氨基酸。控制好发酵的进程，便可得到具有特定链长和相 应功能的无苦味大豆多肽。本文所建立的多肽含量测定法，操作简单，快速。不仅适用 于本研究中微生物发酵水解法水解大豆蛋白产多肽这一工艺中发酵液多肽增量的在线 适时测定和控制，还可推广至其它工艺蛋白水解液多肽增量的测定。 和直接以发酵菌株的次生代谢产物为产品的生物活性肽的生产不同，本研究利用微 生物发酵来产大豆多肽主要利用的是发酵菌株的产酶及酶解能力。豆粕是制油工业的副 产品，富含大豆蛋白，不仅价格低廉(约为大豆分离蛋白的十分之一)，而且能提供了菌体生长所需的碳氮源和无机盐，十分适于作为发酵底物。在发酵过程中将原料中的大豆 蛋白水解并脱除苦味根源的肽链末端疏水性氨基酸。因此，控制好发酵的进程，便可得 到具有特定链长和对应功能的无苦味大豆多肽。本发酵工艺不仅与纯酶水解法制备大豆 多肽的工艺相比优势明显，而且与目前同类的发酵法制备多肽工艺相比，成本更为低廉 (利用豆粕而不是大豆分离蛋白作底物)；发酵效率高(24h水多肽增量达27%)；多肽品质好(主要为300～1000Da短肽链)，更为重要的是解决了蛋白水解产物苦味难除的问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 [18]，因此是一项极具潜力的多肽制备工艺。进一步的工作有待于在对发酵液中多肽混 合物进行分级分离，纯化精制等下游技术上展开。 大豆多肽因易为人体消化吸收利用、较好的稳定性和良好的物理加工特性以及诸多 的功能特性而成为当前食品、药品及化妆品等行业研究的热点。关于大豆蛋白的酶水解 问题国内外研究均较多，能够应用于酶法水解大豆蛋白的各种酶已经或正在被广泛关 注，酶水解的方式也由单酶水解正逐渐转向复合酶的分步水解，但是酶法水解过程中也 存在一些问题，比如酶在反应过程中稳定性不高，易被氧化，受反应温度、pH、体系金属离子浓度的影响较大，且在水解过程中常常不可避免的会产生少量苦味物质，影响产 品风味。但是随着制备工艺的不断改进，微生物酶技术的不断发展，多肽产物测定方法 的不断完善，风味及生产成本得到了进一步的改善，可以预见大豆多肽也必将在食品、 药品乃至化妆品等诸多领域中展示出更加广阔的开发前景。 - 18 - 毕业设计论文能够顺利地完成，首先要感谢我的专业课老师。正是在他们的悉心教 导下，才得以让我灵活运用所学到的扎实的基础理论知识。通过本次毕业设计论文的整 体把握和具体的实验日程安排，我学到了很多。不仅综合运用了所学的理论知识，还学 会了从教科书、图书、期刊等途径获取有用的资料，并在做实验的过程中自己动手，不 断掌握、透彻掌握和熟练运用蛋白酶解工艺和生化基本分离鉴定实验的原理和方法。认 识到科学研究的真谛。用科学的态度去做科学性的研究，用科学的理论思维去探索和创 新，一丝不苟，不断探索！ 最后，本人衷心感谢老师的悉心指导，以及其他老师和同学在试验中所给予的帮助， 谢谢！！！ 作者：李洲 2008年6 月6日 - 19 - 参考文献 1张晶,李牧,单安山,等.大豆活性肽对14日龄早期断奶仔猪生长性能和甲状腺素分泌的 影响[J].东北农业大学学报,2005,36(4):467～471 2李绍章,梁运祥,葛向阳.大豆蛋白发酵降解多肽在养殖中的应用[J].饲料广角,2004(7):36～39 3胡先勤,韩继宏.大豆小肽在鲫鱼鱼苗中的应用[J].科学养鱼,2005(2):7～8 4陈萱,陈昌福,梁运祥.发酵豆粕饲料对异育银鲫非特异性免疫功能的影响[J].淡水渔业,2005,35(2):6～8 5 朱秀清，付春梅。大豆多肽食品的开发，大豆通报，1998(4):26 6丁纯孝，大豆蛋白的机能特性及其在食品中的应用，中国粮油食品，1984(6):12-13 7 盛国华，大豆多肽的功能及应用，食品工业科技，1993(6):21-26 8 江和源，吕飞杰，部建祥。大豆中生物活性成分及其功能，大豆科学，2000.19(2):160一163 9 阂育娜，刘虎，陆元东。生物活性肽的生理作用及其在畜禽生产中的应用，动物医学 进展，2003.24(6):64一66 10 汪建斌，邓勇。大豆多肽的生理功能及开发利用，广州食品工业科技,1997(3):52一53 11 Wang Lijun，Masayoshi SAITO，Eizo TATSUMI and Li Lite .Antioxidative and Angiotensin I-Converting Enzyme Inhibitory Aetivities of Sufu(Fermented Touf)Extracts，JARQ37(2):129-132 12 M.Kuba，C.Tana，S.Tawata，M.Yasuda. 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