木瓜凝乳蛋白酶的自水解作用及其对分离纯化的影响

木瓜凝乳蛋白酶的自水解作用及其对分离纯化的影响 木瓜凝乳蛋白酶的自水解作用及其对分离 纯化的影响 第26卷第1期 2005年1月 华南农业大学 JournalofSouthChinaAgriculturalUniversity Vo1.26.No.1 Jan.2005 木瓜凝乳蛋白酶的自水解作用及其 对分离纯化的影响 舒薇l'郭勇 (1华南理工大学食品与生物工程学院,广东广州510640;2华南农业大学测试中心,广东广州510642) 摘要:对木瓜凝乳蛋白酶的自水解作用及其对分离纯化的影响作了探讨.结果表明:激活的和未激活的木瓜凝乳 蛋白酶液均能发生自水解作用,而激活剂的使用可加速酶的自水解过程,在分离纯化过程中易造成分离纯化产物 不均一,酶活力回收率和蛋白回收率下降等;与之相比,未激活的木瓜凝乳蛋白酶的应用可抑制或延缓分离过程中 酶的水解,纯化产物蛋白回收率达64.08%,比前者提高了10%以上;酶活力回收达68.9%,比前者提高了15%. 关键词:木瓜凝乳蛋白酶;分离纯化;自水解作用 中图分类号:Q556;Q814.1文献标识码:A文章编号:1001—411X(2005)01—0080一o4 Theautolysisofchymopapainandtheeffectonitspurification SHUWei,GUOYong (1CortegeofFoodandBioenglneefing,SouthChinaUniversityofTechnology,Guangzhou5 10640,China; 2TestingCenter,SouthChinaAgric.Univ.,Guangzhou510642,China) Abstract:Theeffectofchymopapainautolysisonitspurificationwasstudied.ItWasfoundthat:activatedand inactivatedchymopapainsolutioncouldundergoautolysis.Theuseofactivatoracceleratedtheautolyticpro— cess,msuhinginheterogeneityofthepurifiedproducts,anddeclineintherecoveryofenzymeactivityand protein.Bycontrast,usinginactivatedchymopapaininhibitedordelayedtheautolysis,therec overyofprotein Was54.08%,showinganincreaseofmorethan10%,andrecoveryofactivityWas68.9%,againofover 15%. Keywords:chymopapain;purification;autolysis 木瓜凝乳蛋白酶(Chymopapain,EC3.4.22.6,简 称Cp)是木瓜乳汁中含量最丰富,水解和凝乳活性最 强的一种巯基蛋白酶J.目前,该酶除了在食品,工 业生产等领域有重要而广泛的用途外,在医药(疗) 领域也显现出越来越重要的药用价值,如治疗腰椎 间盘突出症[2-5],肿瘤的辅助治疗6,分离细胞【7,8J, Rh血型鉴定及交叉配血,消炎和助消化等.然而, 因木瓜乳汁中4种巯基蛋白酶的结构,性质极为相 似,所以获得高活力,高纯度的Cp非常困难.近年 来,我国的一些科研人员和实验室相继开展了该酶 的分离纯化,抗体制备等相关的研究'l..,在分离纯 化过程中大多采用先将酶液用半胱氨酸,EDTA或巯 基乙醇激活半小时,再进行分离纯化的 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 .本研究 通过对自水解过程的分析和对分离纯化结果比较得 出:激活的木瓜凝乳蛋白酶由于具有很强的自水解 作用,常造成分离产物不均一,酶活力回收率及蛋白 回收率偏低等结果,这远不能满足临床医药和科研 方面的要求.本试验鉴于上述结果,在分离纯化过程 收稿Et期,'2004—06—07作者简介:舒薇(1968一),女,讲师,博士研究 生;E-mail:happyyin@21cn.o,om 基金项目:广东省重点科研项目(C11707) 第1期舒薇等:木瓜凝乳蛋白酶的自水解作用及其对分离纯化的影响81 中采用未激活木瓜蛋白复合酶为上样酶液,在离子 强度和pH线性双梯度洗脱下,获得比活力为3389.1 U/rag,蛋白回收率提高10%以上,比活力提高1.05 倍的纯酶,这为今后制备高活力,高纯度的木瓜凝乳 蛋白酶和开展相关的应用研究提供了重要依据. 1材料与方法 1.1材料 1.1.1材料与主要试剂木瓜蛋白酶(粗粉),广州酶 制剂厂提供,ps1级别,活力为130万酪氨酸单位/g;羧 甲基纤维素(CMC),截留相对分子质量5000的超滤 浓缩管(型号AmiconUltra-4),MiUipore公司产品;酪 蛋白(casein)进口分装;木瓜凝乳蛋白酶标准品,Sig— rna公司产品;其余试剂为电泳纯或分析纯试剂. 1.1.2仪器设备ECONO中低压层析仪,Bio—rad 公司产品;截留相对分子质量为30000的再生纤维超 滤包及超滤装置,型号PelliconXL30,Millipore公司 产品;小型双垂直电泳槽,大连捷迈科贸有限公司. 1.2方法 1.2.1Cp水解活力测定参照徐凤彩【?J酶活力测 定方法并有所改进.酶活力单位定义为在测定条件 下[pH7.0,(37?0.2)oC],每分钟水解酪蛋白产生1 腭酪氨酸所需的酶量为1个酶活力单位(u).按下 式计算酶活力: 酶活力(u/rl1L)=×标×了V×样品稀释 总倍数, 式中:(D—D0)为275rffn波长下待测酶液与对照的 光密度差值;D指以水为对照,275rffn波长下50 mI标准酪氨酸光密度值;标为标准酪氨酸溶液 浓度;为反应体系总体积(mL);t为反应时间,10 min. 1.2.2CD凝乳活力的测定参照A血12J方法.把 40min内凝固1mL质量浓度为0.1g/mI~脱脂乳(含 0.O1mol/LCaC1,)的酶量定义为1个酶活力单位,即 1个索氏单位(SoxhletUnit),以相对活力(RU)表示各 因素的影响效果. 1.2.3蛋白质含量的测定按Bradford方法_13_.并 以牛血清白蛋白为标准蛋白质. 1.2.4SDS-PAGE电泳比较取2组酶液,第1组将 Cp溶于0.05mol/LpH7.0含20nrnol/LCys,1nrnol/L EDTA的磷酸缓冲液中(蛋白质质量浓度30mg/mI~), 室温放置并分别于激活3,6,24和36h后提取酶液 进行SDS—PAGE电泳分析.第2组将CD溶于0.05 mol/LpH7.0的磷酸缓冲液中(蛋白质质量浓度30 mg/mI~),室温放置并分别于第3,6,24和36h提取酶 液作SDS—PAGE电泳分析.电泳参照张龙翔_1J方法. 用W=5%浓缩胶,W=12.5%分离胶,每孔点样10 L,稳流10mA.剥胶后以考马斯亮兰It一250染色 1,2h,脱色液脱色至条带清晰,用凝胶成像系统拍 照. 1.2.5Cp的分离纯化结果比较分2组.第1组将 0.6g木瓜蛋白酶粗粉溶于20mL0.05mol/LpH7.0 含20mmol/LCys,1mmol/LEDTA的磷酸缓冲液中 (蛋白质质量浓度30mg/mL),研磨15min,4000r/ min离心10min,上清液上CMC层析柱,用0.05 mol/LpH5.8,0.4mob/LpH8.0的磷酸缓冲液进行 线性梯度洗脱,在280rffn波长检测下,收集第2活 性峰,经超滤及冰冻干燥成酶粉;第2组将0.45g木 瓜蛋白酶粗粉溶于15mL0.05mol/LpH7.0的磷酸 缓冲液中(蛋白质质量浓度30mg/mI~),研磨15rain, 4000r/rain离心10min,上清液转入5000超滤离心 管,5000r/min离心5min,取上清液上CMC层析 柱,用0.05mol/LpH5.8,0.5mol/LpH8.0的磷酸 缓冲液进行pH,离子强度线性梯度洗脱,在280rffn 波长检测下,收集第2活性峰,经超滤及冰冻干燥 成酶粉.在CMC层析过程中,层析柱大小为2.6cm x22.5cm,流速均控制在0.55mL/min,5mL/管. 1.2.6Cp的分离纯化及纯度鉴定CD的分离纯化 按1.2.5中第2组未激活酶液的方法进行,其纯化 产物用SDS—PAGE电泳进行分析,电泳方法同 1.2.4. 2结果与分析 2.1水解活性随时间变化的趋势 从图1,2可见,激活和未激活酶液(蛋白质质量 浓度0.9mg/mI~)的水解酶活力和凝乳酶活力均随时 间的变化呈下降趋势,其中以激活态酶活力下降明 显,而未激活酶液的酶活力下降相对缓和.可能的原 因是:木瓜凝乳蛋白酶的独特结构[15,16],使它具有高 反应活性的潜能,在溶液状态下,活性一SH一旦被激 活就表现出极强的活性,并以自身为底物,分子之间 相互切割,发生自水解作用,导致酶活力下降.而此 过程中也出现活性反弹波动,说明酶的水解作用使它 82华南农业大学第26卷 的一级结构和空间结构不断发生变化,有时结构的变 化使其活性中心更有利于与底物结合,也验证了酶的 天然结构并不一定是酶的最佳活性结构. t/d 激活态酶液activatedchymopapain 未激活酶液inactivatedchymopapain 图l木瓜凝乳蛋白酶水解活力随时间变化曲线 Fig.1Curveofpmteolytieactivityofchymopapainagainsttime 图2木瓜凝乳蛋白酶凝乳活力随时间变化曲线 Fig.2Curveofmilkclottingactivityofchymopapainagainsttime 2.2蛋白质浓度随时间的变化 从图3可见,随着时间的变化,2种Cp酶液(蛋 白质质量浓度约O.9m~/mL)的D595mn值在不断下 降.其中未激活酶液的下降程度较激活的平缓,这 与上述结果一致. 12345678 t/d +激活态酶液activatedchymopapain +未激活酶液inactivatedchymopapain 图3蛋白质浓度随时间变化曲线 Fig.3Curveofchymopapainconcentrationagainsttime 2.3SDS.PAGE电泳比较结果 通过对SDS—PAGE电泳图(图4)比较发现,第1 组激活的Cp于激活3h内已出现明显的降解带,于 第6,24和36h在纯酶的对应位置电泳带逐渐变浅 或消失,而下方的降解带却较为明显(图4一a),而第 2组未激活Cp的降解带较第l组明显少,降解速度 相对较慢(图4一b),进一步说明了木瓜凝乳蛋白酶 的激活加速了其自身降解,最终导致水解片段产生, 酶活力下降及产物的不均一性. 97400 66200 43000辫i 201 oo 00 j _谛 marker纯酶3h6h24h36h a:激活的木瓜凝乳蛋白酶液 activatedchymopapain 31000黼 嚣一‰…镕獬#$黼 201O0 14400 marker纯酶3h6h24h36h b:未激活的木瓜凝乳蛋白酶液 inactivatedchymopapain 图4激活和未激活木瓜凝乳蛋白酶液不同时间的SDS- PAGE电泳比较 Fig.4SDS-PAGEanalysisofactivatedandinactivatedchymopa— painatdifferenttimes 2.4co分离纯化结果的比较 从表1纯化结果比较来看,未激活酶经多步纯 化后酶比活力为3389.1U/mL,是激活酶的1.O5倍; 酶活力回收率为68.9%,比激活酶的53.87%提高 15%以上;蛋白回收率为64.1%,比激活酶的53.O% 提高了ll%. 2.5Cp分离纯化及纯度鉴定 通过以上对比研究表明,激活态酶液活性高,在 分离纯化过程中易导致自身降解而造成酶蛋白含量 下降及产物的不均一性,因此试验选择以未激活的 木瓜蛋白复合酶为上样酶液,经CMC离子交换柱层 析分离(图5),超滤,冻干等步骤纯化,获得Cp纯品, 经SDS—PAGE电泳分析呈现单一条带,达电泳纯(图 6). 一..,1LU.3)/喜^l1u日u戛10u10JdR焙涟 , 伽 642O 000 第1期舒薇等:木瓜凝乳蛋白酶的自水解作用及其对分离纯化的影响83 洗脱缓冲液washingbuffer:O.05mol/LpH5.8,O.5mol/LpH8.0PBS, 流速flowrate:0.55mL/min,5mL/mbe 图5未激活木瓜凝乳蛋白酶CMC柱层析洗脱曲线 Fig.5ThechromatographyofinactivatedehymopapainonCMC 97400 66200 3l000 2O1O0 14400 j 黼 蝴瞬* 端—__ …*械一 , 黼躺? 誓_圈 marker粗酶纯酶 crudepure. proteinasechymopapam 图6木瓜蛋白酶粗酶和木瓜凝乳蛋白酶冻干品的SDS-PAGE Fig.6SDS-PAGEanalysisofcrudeproteinaseandlyophilizedchy- mopapain 3结论 木瓜凝乳蛋白酶有很强的水解蛋白质,小(多) 肽的能力,它的切割位点很多,但最优先分解精氨 酸,苯丙氨酸的肽键,此外也具有水解酰胺键和酯键 的特点以及具有凝乳活性.由于它的高水解活性,纯 天然性和木瓜资源极其丰富,目前Cp已成为一种非 常重要的药用酶.本试验的结果表明:在分离纯化过 程中,采用未激活的Cp酶液将大大提高产物酶活力 回收率,蛋白回收率,提高产物品质.这一结果将为 该酶的实际生产和开展应用研究提供一定的理论依 据和参考. 参考文献: [1]JANSENEF,BAU_SAK.Chymopapain-ancrysta1line proteinasefrompapayalatex【JJ.JBiolChem,1941,137:459 — 46O. 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(下转第88页) 一一_ll10LLcu【pJ暑uc【1暮超 8642O8642O 88华南农业大学第26卷 3Conclusion[42 Variousgenotypesofsoybeanshowdifferentresponses insomaticembryogenesisintermsofbothquantitativeand qualitatiVeresponsesatdi雎rentanleVels?S0rnevari一『5] etiespoorlyrespondwhereassomeothershighlyrespondat 山eSalTleauxinleve1.A11thelocalvarietiesusedinthis studyrespondedwellinthelowestconcentrationofauxin used.However,theirresponsescouldbeimprovedbyus— ingadditivessuchascoppersulfateandsilvernitrate.Ac一[63 cordingtoourstudy,silvernitratecouldbeusedwithcop— persulfatetoobtaintheirsynergisticeffectsonsomaticem— r] bryogenesis.Thepresentresultshavehighapplicati.nva1一LJ ueforimprovementofsoybeanwhenbio—technicalmeans aretobeused. Refe: [83 [1]CHRISTIANSONML,WARNICKDA,CARLSONPS.A morphogenetieallycompetentsoybeansuspensionculture[J].[9] Science,1983,222:632—634. [2]WALKERDR,PARROTrWA.Effectofpolyethyleneglycol andsugaralcoho~onsoybeansomaticembryogerminationand conversion[J].PlantCellTissueOrganCult,2001,64:55一[10] 62. 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