引物设计原则

引物设计原则 引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则: (1) 引物长度约为16-30bp， 太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费,且难以合成。 (2) 引物中G+C含量通常为40%-60%,可按下式粗略估计引物的解链温度 Tm,4(G+C)+2(A+T). (3) 四种碱基应随机分布，在3'端不存在连续3个G或C,因这样易导致错误引发。 (4) 引物3'端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应, 以减少由于密码子摆动产生的不配对。 (5) 在引物内, 尤其在3'端应不存在二级结构。 (6) 两引物之间尤其在3'端不能互补, 以防出现引物二聚体, 减少产量。两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。 (7) 引物5'端对扩增特异性影响不大, 可在引物设计时加上限制酶位点、核糖 体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等. 通常应在5'端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。 (8) 引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产物本身无稳定的二级结构, 以免产生非特异性扩增,影响产量。 (9) 简并引物应选用简并程度低的密码子, 例如选用只有一种密码子的Met, 3'端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。 一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0μmol/L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体, 过低则降低产量。利用紫外分光光度计, 可精确计算引物浓度, 在1cm光程比色杯中,260nm下,引物浓度可按下式计算: X mol/L, OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600) X: 引物摩尔浓度,A、C、G、T: 引物中4种不同碱基个数。 分子生物学实验作的并不多，我的几点经验， 1 直接查文献照搬别人成功的引物最省事。 2 需要多对引物时，最好退火温度设计为同一温度，便于实验同时进行。 3 RT-PCR及 Real timePCR的引物必须包含intron，以排除genomic DNA的影响 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 软件(比如DNAman)比对(Alignment)，各基因相同的序列就是该基因的保守区。 2.引物长度一般在15~30碱基之间。 引物长度(primerlength)常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74?，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。 3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72?。 GC含量(composition)过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相 差太大。另外，上下游引物的Tm值(meltingtemperature)是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10?。若按 公式 小学单位换算公式大全免费下载公式下载行测公式大全下载excel公式下载逻辑回归公式下载 Tm=4(G+C)+2(A+T)估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80?，其Tm值最好接近72?以使复性条件最佳。 4.引物3′端要避开密码子的第3位。 如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。 5.引物3′端不能选择A，最好选择T。 引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。 6.碱基要随机分布。 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发(Falsepriming)。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。 7.引物自身及引物之间不应存在互补序列。 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构(Hairpin)使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。 两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′端的互补重叠以防止引物二聚体(Dimer与Crossdimer)的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。 引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其?G值不要过高(应小于4.5kcal/mol)。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。 8.引物5′端和中间?G值应该相对较高，而3′端?G值较低。 ?G值是指DNA双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，?G值越大，则双链越稳定。应当选用5′端和中间?G值相对较高，而3′端?G值较低(绝对值不超过9)的引物。引物3′端的?G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。(不同位置的?G值可以用Oligo6软件进行分析) 9.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。 引物的5′端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括:加酶切位点;标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等;引入蛋白质结合DNA序列;引入点突变、插入突变、缺失突变序列;引入启动子序列等。 引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能。 10.扩增产物的单链不能形成二级结构。 某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件(比如RNAstructure)可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明，待扩区域自由能(?G?)小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。 11.引物应具有特异性。 引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。 值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物;用作克隆目的的PCR，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。 做RealTime时,用于SYBRGreenI法时的一对引物与一般PCR的引物,在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求: 1)避免重复碱基，尤其是G. 2)Tm=58-60度。 3)GC=30-80%. 4)3'端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C. 5)正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。 6)PCR扩增产物长度:引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可;80,150bp最为合适(可以延长至300bp)。 7)引物的退火温度要高，一般要在60度以上; 要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。 而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。 至于设计软件，PRIMER3,PRIMER5,PRIMEREXPRESS都应该可以的。 做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。对于引物，你要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备---寻找合适的引物非常不容易。 关于BLAST的作用应该是通过比对，发现你所设计的这个引物，在已经发现并在GENEBANK中公开的不物种基因序列当中，除了和你的目标基因之外，还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列，如和你的目标序列之外的序列相同的序列，则可能扩出其他序列的产物，那么这个引物的特异性就很差，从而不能用。 一、 利用ncbi搜索不同物种中同一目的基因的蛋白或cDNA编码的氨基酸序列 因为密码子的关系，不同的核酸序列可能表达的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是 真正保守的。首先利用NCBI的Entrez检索系统，查找到一条相关序列即可。随后利用这一 序列使用BLASTp(通过蛋白查蛋白)，在整个Nr数据库中中查找与之相似的氨基酸序列。 二、对所找到的序列进行多序列比对 将搜索到的同一基因的不同氨基酸序列进行多序列比对，可选工具有Clustal W，也可在线 分析[url][/url]。 三、确定合适的保守区域 设计简并引物至少需要上下游各有一个保守区域，且两个保守区域相距50, 400个aa为 宜，使得pcr产物在150~1200bp之间，最重要的是每一个保守区域至少有6个aa残基， 因为每条引物至少18bp左右。若比对结果保守性不是很强很可能找不到6个aa的保守区 域，这时可以根据物种的亲缘关系，选择亲缘相近的物种进行二次比对，若保守性仍达不到 要求，则需进行三次比对。总之，究竟要选多少序列来比对，要根据前一次比对的结果反复 调整。最终目的就是有两个6个aa且两者间距离合适的保守区域。 四、利用软件设计引物 当得到保守区域后，就可以利用专业的软件来设计引物了，其中pp5支持简并引物的设计， 将参与多序列比对的序列中的任一条导入pp5中，再将其翻译成核苷酸序列，有密码子简 并性，其结果是有n多条彼此只相差以个核苷酸的序列群，该群可用一条有简并性的核苷酸 链来表示(其中R,A,G，Y,C,T，M,A,C，K,G,T，S,C,G，W, A,T，H, A ,C,T，B, C,G,T，V,A,C,G， D,A/G /T,N=A,C,G/T)，该具有简并性的核苷 酸链必然包含上一步中找到的氨基酸保守区域的对应部分，在pp5中修改参数，令其在两 个距离合适的保守的nt区域内寻找引物对，总之要保证上下游引物都落在该简并链的保守 区域内，结果会有数对，分数越高越好。 五、对引物的修饰 若得到的引物为: 5-NAGSGNGCDTTANCABK-3 则其简并度,4×2×4×3×4×3×2=2304，很明显该条引物的简并度多高不利于pcr。我们可 以通过用次黄嘌呤代替N(因为次黄嘌呤能很好的和4种碱基配对)和根据物种密码子偏好 这两种方法来降低简并度(有个查密码子偏好的数据库我以前发过大家搜索一下把)。 最后，这样子设计出来简并引物对，适用于用于比对的氨基酸序列所属物种及与这些物种分 类地位相同的其他物种。 如果知道了基因序列，(从pubmed上下载的)怎么样设计出最合适的引物呢,关于引物设计，有oligo和primer5两种主要的软件，但是这两个软件***版的在网上很难找，我这里有primer5的***版. 还有一种简便易行的因无设计方法，那就是利用在线的因无设计软件primer3.0进行引物的设计 1.打开网址: 2.在框中粘贴入你的原始序列(要比你要扩的目的片段两端延伸一点) 3.在框的下方有许多可以设定的限制条件,如片段长度,一定包含的片段位置,引物长度,引物退火温度等,你可以进行设定 4.点击"pickup primers"就会出现下一页,上面会列出多种设计，一般来说，第一对引物是最适合的。 同时引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则: (1) 引物长度约为16-30bp，太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费,且难以合成。 (2) 引物中G+C含量通常为40%-60%,可按下式粗略估计引物的解链温度 Tm,4(G+C)+2(A+T). (3) 四种碱基应随机分布，在3'端不存在连续3个G或C,因这样易导致错误引发。 (4) 引物3'端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应, 以减少由于密码子摆动产生的不配对。 (5) 在引物内, 尤其在3'端应不存在二级结构。 两引物之间尤其在3'端不能互补, 以防出现引物二聚体, 减少产量。两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。 (7) 引物5'端对扩增特异性影响不大, 可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等. 通常应在5'端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。 引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产物本身无稳定的二级结构, 以免产生非特异性扩增,影响产量。 (9) 简并引物应选用简并程度低的密码子, 例如选用只有一种密码子的Met, 3'端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。 RT-PCR引物设计原则和方法 在NCBI上搜索到该基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。 打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内(选择As)，此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。点击Primer，进入引物窗口。 此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。在Search Parameters里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100,200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择300,500bp。 点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照 评分 售楼处物业服务评分营养不良炎症评分法中国大学排行榜100强国家临床重点专科供应商现场质量稽核 (Rating)排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。 对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况:3’端不要以A结尾，最好是G或者C，T也可以;3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或 CCC，否则容易引起错配。此窗口中需要着重查看的包括:Tm应该在55,70度之间，GC,应该在45,,55,间，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo来完成，Oligo自身虽然带有引物搜索功能，但其搜索出的引物质量感觉不如Primer5。 在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后在菜单栏，选择File-Print-Current pair，使用PDF虚拟打印机，即可转换为Pdf文档，里面有该引物的详细信息。 在Oligo软件界面，File菜单下，选择Open，定位到目的cDNA序列(在primer中，该序列已经被保存为Seq文件)，会跳出来两个窗口，分别为Internal Stability(Delta G)窗口和Tm窗口。在Tm窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框，输入候选的上游引物序列位置(Primer5已经给出)即可，而引物长度可以通过点击Change,Current oligo length来改变。定位后，点击Tm窗口的Upper按钮，确定上游引物，同样方法定位下游引物位置，点击Lower按钮，确定下游引物。引物确定后，即可以充分利用Analyze菜单中各种强大的引物分析功能了。 Analyze中，第一项为Key info，点击Selected primers，会给出两条引物的概括性信息， 其中包括引物的Tm值，此值Oligo是采用nearest neighbor method计算，会比Primer5中引物的Tm值略高，此窗口中还给出引物的Delta G和3’端的Delta G。3’端的Delta G过高，会在错配位点形成双链结构并引起DNA聚合反应，因此此项绝对值应该小一些，最好不要超过9。 Analyze中第二项为Duplex Formation，即二聚体形成分析，可以选择上游引物或下游引物，分析上游引物间二聚体形成情况和下游引物间的二聚体情况，还可以选择Upper/Lower，即上下游引物之间的二聚体形成情况。引物二聚体是影响PCR反应异常的重要因素，因此应该避免设计的引物存在二聚体，至少也要使设计的引物形成的二聚体是不稳定的，即其Delta G值应该偏低，一般不要使其超过4.5kcal/mol，结合碱基对不要超过3个。Oligo此项的分析窗口中分别给出了3’端和整个引物的二聚体图示和Delta G值。 Analyze中第三项为Hairpin Formation，即发夹结构分析。可以选择上游或者下游引物，同样，Delta G值不要超过4.5kcal/mol，碱基对不要超过3个。 Analyze中第四项为Composition and Tm，会给出上游引物、下游引物和产物的各个碱基的组成比例和Tm值。上下游引物的GC,需要控制在40,,60,，而且上下游引物之间的GC,不要相差太大。Tm值共有3个，分别采用三种方法计算出来，包括nearest neighbor method、,GC method和2(A，T)，4(G，C)method，最后一种应该是Primer5所采用的方法，Tm值可以控制在50,70度之间。 第五项为False Priming Sites，即错误引发位点，在Primer5中虽然也有False priming分析，但不如oligo详细，并且oligo会给我正确引发效率和错误引发效率，一般的原则要使错误引发效率在100以下，当然有时候正确位点的引发效率很高的话，比如达到400,500，错误引发效率超过100幅度若不大的话，也可以接受。 Analyze中，有参考价值的最后一项是“PCR”，在此窗口中，是基于此对引物的PCR反应Summary，并且给出了此反应的最佳退火温度，另外，提供了对于此对引物的简短评价。若该引物有不利于PCR反应的二级结构存在，并且Delta G值偏大的话，Oligo在最后的评价中会注明，若没有注明此项，表明二级结构能值较小，基本可以接受。 引物评价完毕后，可以选择File,Print，打印为PDF文件保存，文件中将会包括所有Oligo软件中已经打开的窗口所包括的信息，多达数页。因此，打印前最好关掉Tm窗口和Delta G窗口，可以保留引物信息窗口、二级结构分析窗口(若存在可疑的异常的话)和PCR窗口。 引物确定后，对于上游和下游引物分别进行Blast分析，一般来说，多少都会找到一些其他基因的同源序列，此时，可以对上游引物和下游引物的blast结果进行对比分析，只要没有交叉的其他基因的同源序列就可以。 有一个问题，引物设计原则里面常常强调，引物所对应模板序列的Tm 值最好在72?左右，但是软件里面Search出来的引物，很少有达到这个值的，一般都在50,65度之间，这是什么原因,软件怎么没有限定这个规则, PCR引物设计原则 PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。现在可以在这一保守区域里设计一对引物。一般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600碱基对。让我们先看看P1引物。一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%。而且四种碱基的分布最好随机。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否则P1引物设计的就不合理。应重新寻找区域设计引物。同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。 引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5′端加酶切位点序列;标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。但3′端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3′端开始的。这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。 综上所述我们可以归纳十条PCR引物的设计原则: ? 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 ? 产物不能形成二级结构。 ? 引物长度一般在15~30碱基之间。 ? G+C含量在40%~60%之间。 ? 碱基要随机分布。 ? 引物自身不能有连续4个碱基的互补。 ? 引物之间不能有连续4个碱基的互补。 ? 引物5′端可以修饰。 ? 引物3′端不可修饰。 ? 引物3′端要避开密码子的第3位。 PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。 1.引物的特异性 引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。 2.避开产物的二级结构区 某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能(?G?)小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。 3.长度 寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为20~27mer。引物的有效长度:Ln=2(G+C)+(A+T+，Ln值不能大于38，因为>38时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度(74?),不能保证产物的特异性。 4.G+C含量 G+C含量一般为40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5~10?。若按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80?，其Tm值最好接近72?以使 复性条件最佳。 5.碱基础随机分布 引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。 6.引物自身 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。 7.引物之间 两引物之间不应不互补性，尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。 8.引物的3′端 引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR(AS-PCR)反应中，引物3′端不能发生错配。 在 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 PCR反应体系中，用2U Taq DNA聚合酶和800μmol/L dNTP(四种dNTP各200μmol/L)以质粒(103拷贝)为模板，按95?，25s;55?，25s;72?，1min的循环参数扩增HIV-1 gag基因区的条件下，引物3′端错配对扩增产物的影响是有一定规律的。A?A错配使产量下降至1/20，A?G和C?C错七下降至1/100。引物A:模板G与引物G:模板A错配对PCR影响是等同的。 9.引物的5′端 引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括:加酶切位点;标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等;引入蛋白质结合DNA序列;引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。 10.密码子的简并 如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。 PCR引物设计及软件使用技巧 2006-12-2 19:54:41 信息来源:来源网络 , PCR引物设计及软件使用技巧 生 物 谷 网 站PCR引物设计及软件使用技巧 张新宇，朱有康，高燕宁 (中国协和医科大学中国医学科学院肿瘤研究所，北京100021) 摘要:本文旨在介绍使用软件设计PCR引物的技巧。在PCR引物设计原则的基础上，详 细介绍了两种常用引物设计软件的基本使用方法，并对其各自的优缺点进行了比较。一般性 引物自动搜索可采用“PremierPrimer5”软件，而引物的评价分析则可采用“Oligo6”软件。 关键词:PCR;引物设计 中图分类号:Q524文献标识码:文章编号: 1 自从1985年KarnyMullis发明了聚合酶链式反应以来，PCR技术已成为分子生物学研 究中使用最多、最广泛的手段之一[1]，而引物设计是PCR技术中至关重要的一环。使用不 合适的PCR引物容易导致实验失败:表现为扩增出目的带之外的多条带(如形成引物二聚 体带)，不出带或出带很弱，等等。 现在PCR引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得 到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。一般来说，专门进行PCR 引物设计的专业软件功能更为强大，但使用起来却不太容易。本文将就引物设计原则及软件 使用问题进行探讨。 引物设计的原则 引物设计有3条基本原则:首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避 免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即 错配)。 具体实现这3条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度(primerlength)，产物长度 (productlength)，序列Tm值(meltingtemperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性 (internalstability,用?G值反映)，形成引物二聚体(primerdimer)及发夹结构(duplex formationandhairpin)的能值，在错配位点(falseprimingsite)的引发效率，引物及产物的 GC含量(composition)，等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点， 引进突变等。根据有关参考资料和笔者在实践中的总结，引物设计应注意如下要点: 1.引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延 伸温度大于74?，不适于TaqDNA聚合酶进行反应[2]。 2.引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导 致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增 加[2]。 3.引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配 位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应 当避免在引物的3’端使用碱基A[3][4]。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反 应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物[2]。 4.引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC 含量不能相差太大[2][5]。 5.引物所对应模板位置序列的Tm值在72?左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种 方法，如按公式Tm,4(G+C)，2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(thenearest neighbormethod)[6][7]。 6.?G值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定 性。应当选用3’端?G值较低(绝对值不超过9)，而5’端和中间?G值相对较高的引 物。引物的3’端的?G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应[6]。 7.引物二聚体及发夹结构的能值过高(超过4.5kcal/mol)易导致产生引物二聚体带，并且 降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行[8]。 8.对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载 体的相应序列而确定。 值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC 2 含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物;在用作克隆目的的PCR因为产 物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条 件。 引物的自动搜索和评价分析 软件的引物设计功能主要体现在两个方面:首先是引物分析评价功能，该功能只有少数 商业版软件能够做到，其中以“Oligo6”最优秀;其次是引物的自动搜索功能，各种软件在 这方面的侧重点不同，因此自动搜索的结果也不尽相同。据笔者的经验，自动搜索功能以 “PremierPrimer”为最强且方便使用，“Oligo6”其次，其他软件如“VectorNTISuit”、 “Dnasis”、“Omiga”和“Dnastar”都带有引物自动搜索功能，但搜索结果不是十分理想。 要想得到效果很好的引物，在自动搜索的基础上还要辅以人工分析。笔者认为引物设计软件 的最佳搭配是“Oligo”和“Premier”软件合并使用，以“Premier”进行自动搜索，“Oligo” 进行分析评价，如此可快速设计出成功率很高的引物。 PrimerPremier5.0的使用技巧简介 1.功能 “Premier”的主要功能分四大块，其中有三种功能比较常用，即引物设计()、 限制性内切酶位点分析()和DNA基元(motif)查找()。“Premier”还具有同源 性分析功能()，但并非其特长，在此略过。此外，该软件还有一些特殊功能，其中 最重要的是设计简并引物，另外还有序列“朗读”、DNA与蛋白序列的互换()、 语音提示键盘输入()等等。 有时需要根据一段氨基酸序列反推到DNA来设计引物，由于大多数氨基酸(20种常见 结构氨基酸中的18种)的遗传密码不只一种，因此，由氨基酸序列反推DNA序列时，会 遇到部分碱基的不确定性。这样设计并合成的引物实际上是多个序列的混和物，它们的序列 组成大部分相同，但在某些位点有所变化，称之为简并引物。遗传密码规则因物种或细胞亚 结构的不同而异，比如在线粒体内的遗传密码与细胞核是不一样的。“Premier”可以针对模 板DNA的来源以相应的遗传密码规则转换DNA和氨基酸序列。软件共给出八种生物亚结 构的不同遗传密码规则供用户选择，有纤毛虫大核(CiliateMacronuclear)、无脊椎动物线粒 体(InvertebrateMitochondrion)、支原体(Mycoplasma)、植物线粒体(PlantMitochondrion)、 原生动物线粒体(ProtozoanMitochondrion)、一般标准(Standard)、脊椎动物线粒体(Vertebrate Mitochondrion)和酵母线粒体(YeastMitochondrion)。 2.使用步骤及技巧 “Premier”软件启动界面如下: 3 其主要功能在主界面上一目了然(按钮功能如上述)。限制性酶切点分析及基元查找功 能比较简单，点击该功能按钮后，选择相应的限制性内切酶或基元(如-10序列，-35序列 等)，按确定即可。常见的限制性内切酶和基元一般都可以找到。你还可以编辑或者添加新 限制性内切酶或基元。 进行引物设计时，点击按钮，界面如下: 进一步点击按钮，出现“searchcriteria”窗口，有多种参数可以调整。搜索目 的(SeachFor)有三种选项，PCR引物(PCRPrimers)，测序引物(SequencingPrimers)， 杂交探针(HybridizationProbes)。搜索类型(SearchType)可选择分别或同时查找上、下游引 物(Sense/Anti-sensePrimer，或Both)，或者成对查找(Pairs)，或者分别以适合上、下游 引物为主(CompatiblewithSense/Anti-sensePrimer)。另外还可改变选择区域(Search Ranges)，引物长度(PrimerLength)，选择方式(SearchMode)，参数选择(SearchParameters) 4 等等。使用者可根据自己的需要设定各项参数。如果没有特殊要求，建议使用默认设置。然 后按，随之出现的SearchProgress窗口中显示SearchCompleted时，再按， 这时搜索结果以表格的形式出现，有三种显示方式，上游引物(Sense)，下游引物 (Anti-sense)，成对显示(Pairs)。默认显示为成对方式，并按优劣次序(Rating)排列，满分 为100，即各指标基本都能达标(如下图)。 点击其中一对引物，如第1#引物，并把上述窗口挪开或退出，显示“PeimerPremier” 主窗口，如图所示: 该图分三部分，最上面是图示PCR模板及产物位置，中间是所选的上下游引物的一些 5 性质，最下面是四种重要指标的分析，包括发夹结构(Hairpin)，二聚体(Dimer)，错误引 发情况(FalsePriming)，及上下游引物之间二聚体形成情况(CrossDimer)。当所分析的引 物有这四种结构的形成可能时，按钮由变成，点击该按钮，在左下角的 窗口中就会出现该结构的形成情况。一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最 好的情况是最下面的分析栏没有，只有。值得注意的是中间一栏的末尾 给出该引物的最佳退火温度，可参考应用。 在需要对引物进行修饰编辑时，如在5’端加入酶切位点，可点击，然后修改 引物序列。若要回到搜索结果中，则点击按钮。 如果要设计简并引物，只需根据源氨基酸序列的物种来源选择前述的八种遗传密码规 则，反推至DNA序列即可。对简并引物的分析不需像一般引物那样严格。 总之，“Premier”有优秀的引物自动搜索功能，同时可进行部分指标的分析，而且容易 使用，是一个相当不错的软件。 Oligo6.22使用技巧简介 1.功能 在专门的引物设计软件中，“Oligo”是最著名的。它的使用并不十分复杂，但初学者容 易被其复杂的图表吓倒。Oligo5.0的初始界面是两个图:Tm图和ΔG图;Oligo6.22的界 面更复杂，出现三个图，加了个Frq图。“Oligo”的功能比“Premier”还要单一，就是引物 设计。但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。 2.使用(以Oligo6.22为例) Oligo6.22的启动界面如下: 图中显示的三个指标分别为Tm、ΔG和Frq，其中Frq是6.22版本的新功能，为邻近6 至7个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发 6 的可能性。因为分析要涉及多个指标，起动窗口的cascade排列方式不太方便，可从windows 菜单改为tili方式。如果觉得太拥挤，可去掉一个指标，如Frq，这样界面的结构同于Oligo 5.0，只是显示更清楚了。 经过Windows/Tili项后的显示如图: 在设计时，可依据图上三种指标的信息选取序列，如果觉得合适，可点击Tm图块上左 下角的Upper按钮，选好上游引物，此时该按钮变成，表示上游引物已选 取好。下游引物的选取步骤基本同上，只是按钮变成Lower。?G值反映了序列与模板的结 合强度，最好引物的?G值在5’端和中间值比较高，而在3’端相对低(如图:) Tm值曲线以选取72?附近为佳，5’到3’的下降形状也有利于引物引发聚合反应。Frq曲线 为“Oligo6”新引进的一个指标，揭示了序列片段存在的重复机率大小。选取引物时，宜选 用3’端Frq值相对较低的片段。 当上下游引物全选好以后，需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改。首先检查 引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性。需要注意的是，引物二聚体有可能是上游或 下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之间形成(crossdimer)。二聚体形成的能值 越高，越不符合要求。一般的检测(非克隆)性PCR，对引物位置、产物大小要求较低， 因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。第二项检查是发夹结构(hairpin); 与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。一般来说，这两项结构的能值以不超过4.5为好。 当然，在设计克隆目的的PCR引物时，引物两端一般都添加酶切位点，必然存在发夹结构， 而且能值不会太低。这种PCR需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果，对引物的发夹 结构的检测就不应要求太高。第三项检查为GC含量，以45-55,为宜。有一些模板本身的 GC含量偏低或偏高，导致引物的GC含量不能被控制在上述范围内，这时应尽量使上下游 引物的GC含量以及Tm值保持接近，以有利于退火温度的选择。如果PCR的模板不是基 因组DNA，而是一个特定模板序列，那么最好还进行Falseprimingsite的检测。这项检查 可以看出引物在非目的位点引发PCR反应的可能性。如果引物在错配位点的引发效率比较 高，就可能出假阳性的PCR结果。一般在错配引发效率以不超过100为好，但对于特定的 7 8 模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的 引发效率为450以上，而在错误位点的引发效率为130，那么这对引物也是可以接受的。 当我们结束以上四项检测，按Alt+P键弹出PCR窗口，其中总结性地显示该引物的位 置、产物大小、Tm值等参数，最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价。 由于“Oligo”软件的引物自动搜索功能与“PrimerPremier5”的相类似，并且似乎并 不比后者更好用，在此不再赘述。其实，使用软件自动搜索引物就是让计算机按照人的要求 去寻找最佳引物，如果参数设置得当将大大提高工作效率。 除了本地引物设计软件之外，现在还有一些网上引物设计软件，如由WhiteheadInstitute 开发的“Primer3”等(本网站 已引进并调试好该软件，欢迎使用)。该 软件的独特之处在于，对全基因组PCR的引物设计;可以将设计好的引物对后台核酸数据 库进行比对，发现并排除可引发错配的引物。因此建议经常做全基因组PCR的用户试用。 参考文献(References): [1]H.A.艾得希主编,田丁等译.PCR技术——DNA扩增的原理与应用.北京:北京医科大学中国 协 和医科大学联合出版社,1991. [2]林万明著.PCR技术操作与应用指南.北京:人民军医出版社,1993. [3]朱平主编.PCR基因扩增实验操作手册.北京:中国科学技术出版社,1992 [4]郑仲承.寡核苷酸的优化设计，生命的化学,2001,21(3):254-256. [5]GeorgeH.KellerMarkM.Manak.DNAprobes.1992. [6]Oligo软件帮助文件(Oligo.HLP). [7]Martin,F.H.,Castro,M.M.,andTinoco,Jr.I.Basepairinginvolvingdeoxyinisine,implicationsfor probedesign.NucleicAcidsRes,1985,13:8927-8938. [8]Rychlik,W.andRhoads,R.E.Acomputerprogramforchoosingoptimaloligonucleotidesforfilter hybridization,sequencingandinvitroamplificationofDNA.NucleicAcidsRes,1989,17: 8543-8551. 生物谷网站