人精子冷冻前后超微结构及受精能力的变化

人精子冷冻前后超微结构及受精能力的变化 徐惠明1 　张军荣1 　富炜1 　伏晓敏2 　金爱华2 　　【摘要】目的　了解人精子冷冻前后超微结构及受精能力的变化。方法　对 10 名志愿者的精液分别在冷 冻前、冷冻后进行人精子低渗膨胀试验 (HOS) 、活动率及穿卵率 (SPA) 测定 , 并利用电镜对精子进行微细 结构观察。结果　冷冻后 SPA 及精子活动率与冷冻前相比显著下降 ( P < 0105) , 精子微细结构的变化主要局 限于头部顶体 , 而精子形态、生物膜及亚细胞结构基本完整。结论　人精子冷冻后虽然微细结构及功能受到 一定程度的损伤 , 但部分精子的顶体内膜和中纬段未丢失 , 精子尾部的动力装置未受到损害。 【关键词】冷冻精子 ; 受精能力 ; 人精子低渗膨胀试验 ; 超微结构 ; 穿卵试验 中图分类号 : R16911 　　文献标识码 : A 　　文章编号 : 100720931 (2006) 0320004202 Alteration of Ultrastructure and Fertility of Human Sperm before and after Frozen XU Hui2ming , ZHANG Jun2rong , FU Wei , et al . ( Zhejiang Family Planning Institute , Hangzhou , Zhejiang , 310012 , China. ) 【Abstract】Objective 　To explore the alteration of ultrastructure and fertility of human sperm before and after frozen. Methods 　Sperm from 10 volunteers were evaluated for abilities of respond to sperm hypoosmotic tail swelling test (HOS) and sperm penetration assay ( SPA) before and after frozen respectively. Then the ultrastructure of sperm was observed using electron microscope. Results 　Abilities to HOS , SPA and motility of frozen sperm were significantly lower than those before frozen (p < 0105) . Ultrastructure alteration was limited to acrosome , but sperm morphology , biomembrane and subcellular structure were normal completely. Conclusion Although ultrastructure and ability of frozen sperm are damaged , spermatozoa have fertility if inner acrosomal membrane and the equatorial segment are not lost and the dynamic device of sperm tail is not damaged. 【Key words】Frozen sperm ; Fertility ; Sperm hypoosmotic tail swelling test ; Sperm penetration assay ; Ultrastructure 作者单位 : 1. 浙江省 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 生育技术研究所 , 浙江 杭州 　310012 ; 2. 浙江省医学科学院 　　为了解冷冻精子的受精能力及超微结构的变化 , 我们 进行了一系列的研究及探讨 , 现将结果报导如下。 材料与方法 1 　材料 　精液标本来自健康、已婚、已育的 10 名 30～35 岁志愿献精者 , 经泌尿外科及精液常规检测正常后进入本 研究。 2 　方法 　每位志愿献精者取精液 2ml 以上 , 分为 4 份。其 中 1 份进行冻前精液常规检查及 HOS、SPA 和电子显微镜的 测定 , 剩余部分进行冻贮 , 并分别于冷冻后 3 个月、3～6 个月、12～15 个月后复温 , 复温后分别进行精液常规检查 及 HOS、SPA 的测定。冷冻后进行一次电子显微镜的测定。 精液常规检查及 HOS、SPA 的测定方法及判断 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 均按照 《WHO 人类精液及精子 —宫颈粘液相互作用实验室手册 (第三版)》的要求进行[1 ] 。精液冻贮方法按照刘金刚报道 的方法进行[2 ] 。电镜标本的制作按常规进行。将经处理后 的冷冻前 10 份精液和冷冻后 10 份精液用LKB22 型超薄切片 机切片 , H2600 电子显微镜观察。3 　统计处理 　计量资料以 X±S 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 示 , 使用 t 检验。结 　果10 名志愿献精者的精液量为 218 ±012ml , 精子密度为12716 ±1412 ×106/ ml。冷冻前后 HOS的结果见表 1。冷冻前与冷冻后 3 个月内的 HOS结果无变化 (P > 0105) 。冷冻 3～6 个月和 12～15 个月的 HOS 结果与冷冻前相比则有非常显著的下降 (P < 0105) , 而冷冻 3～6 个月与冷冻 12～15 个月二组间的 HOS结果无差异 ( P > 0105) 。冷冻后的精子活动率均明显低于冷冻前 (P < 0101) , 而且冷冻 3～6 个月和 12～15 个月的精子活动率下降速率明显大于冷冻后 3 个月内的精子活动率下降速率 (P < 0101) 。冷冻后 3 个月内与 12～15 个月的精子活动率和冷冻后 3 个月内及 12～15 个月的HOS结果之间无相关性 (P > 0105) 。SPA 冷冻前后均具有明显差异 (P < 0101) , 而冻后各时段间无差异。 ·4· 浙江预防医学 2006 年第 18 卷第 3 期 　Zhejiang Prev Med , March 2006 , Vol 18 , No. 3 表 1 　精子冷冻前后活动率、复苏率 及 HOS的变化 ( %) 　　组别 份数 精子活动率 复苏率 HOS SPA 冻冷前组 10 7419 ±312 7615 ±116 4219 ±412 冷冻 3 个月内组 10 6216 ±219 8317 ±213 7612 ±311 2718 ±312 冷冻 3～6 个月组 10 5111 ±214 6912 ±411 6415 ±216 2014 ±218 冷冻 12～15 个月组 10 4919 ±116 6716 ±314 6211 ±315 1915 ±315 　　电镜观察可见冷冻前精子形态正常 , 细胞膜完整 , 顶 体内、外膜结构清晰 , 核膜完整 , 顶体内膜与核膜呈平行 排列。冷冻后精子的改变主要位于头部顶体 , 可见顶体内、 外膜分离 , 内膜与质膜相贴。部分精子顶体肿胀、崩解 , 质膜与核膜被破坏 , 核局部出现凹陷。然而冷冻后精子的 形态、生物膜及亚细胞结构基本完整。 讨 　论 许多研究表明 , 人精子冷冻复温后由于冰晶形成等原 因 , 使精子的结构及功能受到影响 , 使得精子的活动率及 穿卵率下降。Pederson 等对冷冻后精子电镜观察发现 , 精子 的超微结构改变主要在顶体范围 , 表现为顶体前段肿胀 , 外膜弯曲和不连贯 , 精子线粒体基质密度降低[3 ] 。国内刘 源等也报道冷冻后精子超微结构改变主要局限于顶体和线 粒体[4 ] 。通过本研究我们发现冷冻后人精子的损伤主要位 于头部顶体 , 可见顶体肿胀 , 顶体内、外膜分离 , 部分精 子顶体崩解 , 质膜与核膜被破坏 , 核局部出现凹陷。在 Mahadevan的研究中 , 发现复温后超微结构完全正常的精子 只占 818 %[5 ] 。我们认为 , 冷冻后人精子微细结构的这一变 化与冷冻后精子活动率和穿卵率的下降有关。 通过 HOS的检测可以了解精子细胞膜的完整性及预测 精子的受精能力。许多作者认为 HOS 与精子活动率、活力 之间呈正相关 , 而且能够提供一些有关精子尾部细胞膜完 整性和柔性的信息[6 ] 。精子尾部是精子的运动器官 , 尾部 功能的好坏直接影响到精子的活动率及受精能力。本研究 HOS结果表明 , 冷冻后 3 个月组与冷冻前 HOS 结果相比无 显著差异 , 而冷冻后 6 个月及 12 个月组的 HOS结果则与冷 冻前相比具有显著差异。同时 , 冷冻后人精子的微细结构 观察我们也发现 , 冷冻后人精子的形态、生物膜及亚细胞 结构基本完整。所以我们认为是否冷冻初期人精子尾部细 胞膜通透性的损伤具有一定的可逆性 , 随着冻贮时间的推 移损伤程度加大 , 从而造成人精子尾部细胞膜通透性的不 可逆性损伤。但是这种损伤仅限于细胞功能方面 , 而细胞 的形态、生物膜及亚细胞结构并未受到破坏。因此 , 通过 本研究我们认为 , 冷冻复温后精子尾部由于其结构的特殊 性 , 虽然由于渗透压梯度作用液体渗透细胞壁进入细胞内 , 造成一定程度的细胞肿胀 , 但并不能造成精子尾部的动力 装置 (如中央微管 , 双微管的动力蛋白臂及中央鞘等) 的 损伤。所以冷冻后精子的活动率及活动力下降 , 但并不影 响精子的前向运动能力及受精能力。 Sherman曾报道 , 25 例样本进行冷冻贮存 1、4、10 年 后发现 , 冷冻精子复温后的活动率仍均保持冷冻前的 70 %[7 ] 。许多文献报道冷冻精液进行人工授精后的周期妊 娠率和新鲜精液进行人工授精后的周期妊娠率相比要低[8 ] 。 因此 , 冷冻后精子的穿卵率虽然有所下降 , 但仍具有一定 的受孕能力。许多研究表明顶体内能够溶解透明带的顶体 素可能与顶体内膜及中纬段有关[9 ] 。所以冷冻精子复温后 虽然顶体受到损伤 (如顶体外膜破损等) , 但只要顶体内膜 和中纬段未丢失 , 顶体素的活性就可能存在 , 因而 , 冷冻 后精子的穿透能力及受精能力也就存在。 综上所述 , 人精子冷冻复温后虽然超微结构受到了一 定的损伤 , 导致冷冻后精子活动力、活动率、穿卵率及 HOS的下降 , 但只要顶体内膜和中纬段未受到破坏 , 顶体 素未丢失 ; 精子尾部的动力装置 (如中央微管 , 双微管的 动力蛋白臂及中央鞘等) 未受到损伤 , 则无论冷冻储存多 长时间 , 冷冻后精子仍具有一定的前向运动能力、穿卵能 力及受精能力。 参考文献 [1 ] 陈振文 , 张光华 , 贾孟春 , 等译. 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(收稿日期 : 2005207225) ·5·浙江预防医学 2006 年第 18 卷第 3 期 　Zhejiang Prev Med , March 2006 , Vol 18 , No. 3