（1-4）毕赤酵母表达重组人白细胞介素11的纯化与鉴定

17 卷 3 期 2001 年 5 月 生 　物 　工 　程 　学 　报 Chinese Journal of Biotechnology Vol. 17 No. 3 May 　2001 　 收稿日期 :2000211210 ,修回日期 :2001202217。3 通讯作者。Tel :86257126910099 ; Fax :86257126911688 ; E2mail :niuwa2000 @sina. com 毕赤酵母表达重组人白细胞介素 11 的纯化与鉴定 黄岩山1 3 　董 　勇2 　李 　辉2 　王同映2 　裘霁宛2 　余应年1 1 (浙江大学医学院　杭州　310006) 2 (杭州九源基因工程有限公司　杭州　310018) 摘 　要 　报道了毕赤酵母表达人白细胞介素 11 的下游工艺研究 ,并对其产物进行了分析鉴定。所用工艺流程为 离心收集上清、超滤浓缩脱盐、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤。所得产物经 SDS2PAGE 电泳、RP2HPLC 分析、N 端和 C端序列分析、质谱、等电点分析和生物学活性分析 ,结果表明 :产品纯度大于 97 % ,结构和性质与 E. coli 融合 表达的 Neumega 完全一致。 关键词 　毕赤酵母 , 重组人白细胞介素 11 , 纯化 , 鉴定 中图分类号 　R968 　　文献标识码 　A 　　文章编号 100023061 (2001) 0320250204 　　人白细胞介素 11 (hIL211) 是一种多功能的细胞 因子 ,最基本的功能在于造血调控作用 ,它能刺激人 的造血祖细胞和巨核细胞前体的分化并诱导巨核细 胞的生成和成熟 ,最终导致血小板数量的增加。此 外 ,它还具有促进消化道上皮损伤的恢复、调节脂肪 细胞分化等多种生物活性[1 ,2 ] 。FDA 于 1997 年批准 该产品上市 ,用于防止化疗引起的再生性血小板减 少症[3 ,4 ] 。它是目前全世界唯一已用于临床的促进 血小板生成药。其它适应症如肿瘤化疗引起的口腔 粘膜炎、节段性回肠炎的治疗也正处于临床阶段 ,具 有较好的临床应用价值[5 ] 。但是 ,由于该蛋白的性 质相当特殊 ,结构上富含 Pro ,等电点极高 ,常规的表 达和复性都很困难 ,因此目前的生产都是采用融合 表达方法 ,生产过程中需酶切处理 ,工艺复杂 ,成本 居高不下。毕赤酵母 ( Pichia pastoris) 系统是近年来 发展起来的一个外源蛋白表达系统[6 ] 。它既具有 E. coli 系统操作简便、生产成本低的优点 ,又对重组 蛋白有一定的折叠和加工能力 ,已用于表达 EGF、 TNF、HSA 等多种蛋白[7 ] 。这里 ,我们利用毕赤酵母 分泌表达人白细胞介素 11 的工程菌 ,对其纯化工艺 和表达产物进行了研究 ,并与 E. coli 融合表达的 rhIL211 做了对比分析。 1 　材料与方法 1. 1 　菌种 工程菌由本公司自行构建。由于天然 IL211 基 因在甲醇酵母中不能有效表达 ,因此我们根据甲醇 酵母的偏爱密码子 ,人工合成了缺失第一位 Pro 的 人 IL211 全长基因 ,经克隆转化筛选得到 rhIL211 的 高表达工程菌 J YIL4。 1. 2 　工程菌培养与上清收集 设定发酵温度 30 ℃,利用全自动发酵罐 (Biostat C ,B. Braun Biotech) 进行发酵。根据需要进行培养 基成分添加 ,待甘油耗尽后进入甲醇诱导阶段。诱 导阶段进行 pH及溶氧的控制。整个发酵时间视工 程菌生长情况确定。培养结束后离心法收集发酵上 清液。 1. 3 　发酵液预处理 利用 Pellicon 超滤系统 (美国 Millipore 公司) ,孔 径为 5000 的超滤膜堆 ,以 5∶1 的比例 ,用 20mmolΠL Tris2HCl (pH810)缓冲液对发酵上清进行超滤脱盐处 理 ,使最终发酵上清的电导小于 5mSΠcm。 1. 4 　rhIL211 的纯化 纯化采用的层析系统为 ∋ KTA Explore (瑞典 Pharmacia 公司) 。发酵上清先经 SP Sepharose FF 柱 层析纯化。柱子先用 20mmolΠL Tris2HCl (pH810) 平 衡 ,经预处理的发酵上清液直接上样后 ,用 NaCl 梯 度洗脱。收集 rhIL211 目标峰 ,再加入固体硫酸铵至 210molΠL ,上 Phenyl Sephrose HP 柱 ,210～0molΠL 硫酸 铵梯度洗脱。收集目标峰后 ,再上经 5mmolΠL 磷酸 缓冲液 (pH710) 平衡的 Sephadex G25 柱脱盐获得纯 化终产品。 1. 5 　分析与鉴定 1. 5. 1 　菌体浓度用分光光度计在 600nm 波长处测 定光密度值 ( OD600 ) ;1215 %的 SDS2PAGE 采用 Lae2 mmli 法[8 ] ;蛋白质定量采用 Bradford 法。表达量采 用光密度扫描法 (Pharmacia VDS system) 。 1. 5. 2 　rhIL211 纯度采用 HPLC2C4 反相柱 (Vydac , USA. 20 %～ 90 %含 011 % TFA 乙腈梯度 ,流速为 018mLΠmin ,检测波长为 214nm)测定。 1. 5. 3 　等电点测定采用 Beckman 公司的毛细管等 电聚焦电泳系统测定 ,方法见说明书。两性电解质 的 pH范围为 3～10。质谱委托中科院化学所测定 , N 端和 C端测序委托中科院上海生物化学研究所测 定。 1. 5. 4 　生物学活性分析 :用 IL26 依赖细胞株 7TD1 和 MTT色素还原法测定酵母表达的 rhIL211 的生物 学活性[9 ] ,以 Genetics Institute 大肠杆菌重组表达的 rhIL211 (商品名 :Neumega)为对照 (比活为 810 ×106 uΠ mg) 。用酶标仪测定 OD570nm ,参考波长为 630nm。以 OD 值为 Y 轴 ,板上稀释梯度的对数为 X 轴 ,作对照 品和待检样品的量效关系散点图。利用 Excel 软件 对实验结果进行回归分析 ,得到各样品的回归方程 和相关系数。根据回归方程求出各样品的 ED50值。 样品比活按下式计算 : 待检样品比活性 (uΠmg) = 对照品比活性 (uΠmg) ×对照品 ED50Π待检样品 ED50 2 　结果与讨论 2. 1 　重组工程菌的高密度高表达发酵 对于罐上发酵 ,为缩短培养时间 ,减小因为表达 外源蛋白导致的对重组菌株的选择压力 ,rhIL211 发 酵分两阶段进行。首先 ,在以甘油为唯一碳源的合 成培养基中增殖菌体 ,等甘油耗尽后再加甲醇诱导 IL211 基因表达。另外实验证明在中性 pH 下 rhIL2 11 表达水平不高 (蛋白酶降解) ,因此将甲醇诱导阶 段的 pH 降低以抑制蛋白酶对分泌表达产物的降 解。诱导至 72h 以上表达到达最高峰 ,放罐 ,此时菌 浓度 OD600 ≥200 ,上清液中 rhIL211 表达量经 SDS2 PAGE分析大于 014gΠL。图 1 为 J YIL4 菌种罐上培 养菌密度与 rhIL211 表达量的关系图。 2. 2 　rhIL211 的分离与纯化 酵母分泌表达的最大特点就是表达产物直接分 泌在培养基中 ,不需要复杂的破菌手段 ,而且表达上 清中杂蛋白含量很低。但是 ,由于发酵培养基含有 大量的无机盐和酵母代谢产物 ,因此我们利用切向 流超滤技术 ,去除发酵上清中的小分子杂质 ,使其有 利于下一步的离子交换层析。 图 1 　高密度发酵中 J YIL4 生长曲线与 rhIL211 的表达量 Fig. 1 　J YIL4 growth curve and the expression of rhIL211 →: Inducing 由于 rhIL211 的等电点偏碱性 ,因此我们选用了 SP 阳离子交换层析进行初步纯化 (见图 2) ,一步即 可去除绝大部分杂蛋白 ,使其蛋白纯度达 90 %以 上。 精纯化采用了 Phenyl Sephrose HP 柱。由于它 是通过疏水性质进行分离 ,与离子交换具有不同的 分离机理。因此 ,除了去除杂蛋白外 ,还能去除很大 部分的色素、热原质和核酸片段等非蛋白类杂质。 经过此柱 ,蛋白纯度即可大于 98 %(见图 2) 。 图 2 　SP Sepharose FF(A)和 Phenyl Sepharose HP(B) 分离纯化 rhIL211 的层析图 Fig. 2 　Chromatograph of rhIL211 on SP Sepharose FF(A) and Phenyl Sepharose HP(B) 最后通过 Sephadex G25 柱脱盐 ,不仅能去除发 酵和纯化过程中的小分子物质 ,还可将蛋白转入适 合于制备制剂的缓冲液体系中。 整个纯化过程中 ,超滤处理后的样品电导较低 , 刚好能满足离子交换的要求 ,而经离子交换的样品 , 含有一定的盐浓度 ,适合于进行疏水层析。而且这 1523 期 黄岩山等 :毕赤酵母表达重组人白细胞介素 11 的纯化与鉴定 两步都是吸附性层析 ,具有较好的浓缩蛋白的能力 , 样品体积变小 ,刚好适合于脱盐层析。因此 ,整个纯 化组合相对比较合理 ,不需要其他的处理步骤 ,易于 工业放大。纯化的总回收率在 28 %左右 ,蛋白生物 学活性与对照品相当 ,产品最终纯度在 98 %以上。 纯化各步骤的 SDS2PAGE电泳图谱见图 3。 图 3 　rhIL211 纯化过程中的 SDS2PAGE图 Fig. 3 　SDS2PAGE analysis of rhIL211 1. Supenatant ;2～4. Purification after CM Sepharose FF ,Phenyl Sephrose FF ,Sephadex G25 ,respectively ;5. Marker 表 1 　毕赤酵母 JYIL4 表达的 rhIL211 的纯化 Table 1 　Purification of rhIL211 from Pichia pastoris JYIL4 Procedure Total rhIL211Πg PurityΠ% rhIL211 recoveryΠ% Supernatant 31 - 100 Ultrafiltration 25. 1 - 81 CM Sepharose FF 14. 1 90. 8 45. 5 Phenyl Sepharose HP 9. 43 97. 5 30. 4 G25 desalting 8. 87 98. 6 28. 6 2. 3 　rhIL211 的鉴定 2. 3. 1 　SDS2PAGE 电泳和免疫印迹分析 :SDS2PAGE 电泳分析表明它的分子量比理论值 (19kD) 大 ,为 22kD 左右 ,可能与它的特殊结构有关。但不同方法 表达的蛋白其电泳行为和免疫性质是一致的 (参见 图 4) 。 2. 3. 2 　RP2HPLC分析 :经 Sephadex G25 脱盐的半成 品用 RP2HPLC进行纯度鉴定 ,纯度超过 97 %(图 5) 。 2. 3. 3 　等电点分析 :由于 rhIL211 富含碱性氨基酸 , 因此它的理论等电点高达 1114 ,目前没有哪一种两 性电解质能用于它的测定。因此 ,我们采用毛细管 等电聚焦电泳方法 ,对毕赤酵母分泌表达的 rhIL211 进行了分析 ,与对照品 (Neumega) 相比 ,它们的出峰 位置基本一致 ,两者等电点均大于 10。 2. 3. 4 　N 端和 C端序列分析 :对甲醇酵母分泌表达 的 rhIL211 的 N 端 15 个氨基酸和 C端 5 个氨基酸进 　　　 图 4 　纯化后 rhIL211 电泳和免疫印迹分析图 Fig. 4 　SDS2PAGE and Western2blotting analysis of purified rhIL211 1. Marker ; 2. Purified rhIL211 ; 3. Neumega 图 5 　rhIL211 纯度鉴定 Fig. 5 　Purity analysis of rhIL211 by RP2HPLC 行测定的结果为 ,NH22GPPPGPPRVSPDPRAE 和 LK2 TRL2COOH ,与理论一致。 2. 3. 5 　质谱分析 :毕赤酵母分泌表达系统与大肠杆 菌不一样的是它有一定的修饰加工能力 ,特别是糖 基化修饰。质谱分析表明 ,酵母表达来源的 rhIL211 分子量为 19060 ,Neumega 为 19056 ,而理论分子量为 19051 ,两者非常吻合 ,说明不同来源的 rhIL211 均无 任何修饰。 2. 3. 6 　生物学活性分析 :结果见图 6 ,两者活性基 本相当 ,酵母表达的 rhIL211 比活为 812 ×106 uΠmg。 　　以上分析结果证明 ,不同表达系统所生产的 rhIL211 ,其结构和性质是相同的。此外 ,还进行了动 物体内药效、药代、急性毒性和长期毒性等研究 ,表 明不管是药效还是毒性 ,两者结果也是基本一致。 hIL211 由于其结构的特殊 ,用常规的表达方法 很难获得有活性蛋白。但临床对 hIL211 的用量很 大 ,目前国外临床每次为 5mg ,需连续使用 1 周以 上。现有的融合表达的 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 成本高 ,工艺复杂 ,难以 252 生 　　物 　　工 　　程 　　学 　　报 17 卷 　　　 图 6 　毕赤酵母表达 rhIL211 生物学活性测定 Fig. 6 　Bioactivity of rhIL211 expressed by Pichia pastoris 满足临床需求。因此 ,发展低成本的生产方案的要 求极为迫切。我们在这里报道的酵母生产系统 ,具 有表达量高、生产成本低、易于规模生产 ,获得的产 品与已经在临床使用的 Neumega 性质一致 ,与传统 生产技术相比 ,具有重大突破 ,至今尚未见有该方面 的报道。因此 ,该技术具有极大的实用前景 ,目前正 在临床申报之中。 REFERENCES(参考文献) [ 1 ] 　Du X X ,Williams D A. Review of molecular ,cell biology ,and clinic use. Blood ,1997 ,89 (11) :3897～3908 [ 2 ] 　Reynolds CH. Clinical efficacy of rhIL211 , Oncology ( Huntingt ) . 2000 ,14 (9 Suppl 8) :32～40. [ 3 ] 　Kaye JA et al . FDA licensure of NEUMEGA to prevent severe chemo2 therapy2induced thrombocytopenia , Stem Cells , 1998 ; 16 ( Suppl 2) : 207～223. [ 4 ] 　Rust DM ,Wood LS ,Battiato LA et al . Oprelvekin :an alternative treat2 ment for thrombocytopenia , Clin J Oncol Nurs ,1999 ,3(2) :57～62 [ 5 ] 　Dickinson EC ,Tuncer R ,Nadler EP ,Koltuksuz U et al . Recombinant hu2 man interleukin211 prevents mucosal atrophy and bowel shortening in the defunctionalized intestine J Pediatr Surg. ,2000 ,35(7) :1079～83. [ 6 ] 　Cereghino JL ,Cregg JM. Heterologous protein expression in the meth2 ylotrophic yeast Pichia pastoris. FEMS Microbiol Rev ,2000 ,24 (1) : 45～66 [ 7 ] 　Cregg J M ,Vedvick T S ,Raschke W G. Recent advances in the ex2 pression of foreign genes in Pichia pastoris , BioΠTechnology ,1993 , 11 :905～910 [ 8 ] 　Sambrook J ,Fritsch E F ,Maniatis T. Molecular Cloning : A Laborato2 ry Manual . 2nd , New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press , 1989 [ 9 ] 　Miao J H(苗继红) ,Wang J X(王嘉玺) et al . Cloning and expres2 sion in E. coli of hIL211 gene. Sci China ( series B ) (中国科学 B 辑) ,1995 ,25 (6) :616～622 Purif ication and Characterization of Recombinant Human Interleukin 11 Which Expressed by Pichia pastoris HUANG Yan2Shan1 3 　DONG Yong2 　LI Hui2 　WANG Tong2Ying2 　QIU Ji2Wan2 　YU Ying2Nian1 1 ( School of Medicine , Zhejiang University , Hangzhou 310005 , China) 2 ( Hangzhou Jiuyuan Gene Engineering Co. Ltd. Hangzhou 310018 , China) Abstract 　This study first time report a method to purify the rhIL211 which expressed by Pichia pastoris . rhIL211 was secreted into the supernatant and collected by centrifugation. The purity of rhIL211 reached 97 % through the steps of ultrafiltration、SP Sepharose FF、Phenyl Sepharose HP and Sephadex G25. Analysis of SDS2PAGE、Western2blotting、IEF、RP2HPLC、Mass spec2 trometer、N and C terminus amino acid sequence and bioactivity was conducted. All the analysis results proved that the rhIL211 expressed by Pichia pastoris was the same as Neumeg which was expressed in E. coli with fusion expression system. So it is pos2 sibly a cheaper and easilier method to produce rhIL211 for clinical use. Key words 　Pichia pastoris , recombinant human interleukin 11 , purification , characterization Received :November 10 ,20003 Corresponding author. Tel :86257126910099 ; Fax :86257126911688 ; E2mail :niuwa2000 @sina. com 3523 期 黄岩山等 :毕赤酵母表达重组人白细胞介素 11 的纯化与鉴定