人类染色体标本的制作细胞与遗传学教研室、实验目的掌握人类染色体标本的制作
方法
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2.了解人类染色体形态结构特征2Jhc时加入BrdU68hrs时加入秋水仙素72hrs后收集细胞预固定一低渗处理人类外周血/・•体外培养植物血球凝典素TFhX厂肝素、培养基.小牛血滴制作玻片标本■■闔定fGiesma染色R—带Giesma染色d•血V荧光染料染色Q—帶染色体带的制作方法二.实验原理♦外周血中的淋巴细胞几乎都是处在G。期或®期，一般情况下長不分裂的.♦当在培养基中加入植物凝集素（PHA）时，小淋巴细胞受到刺激后转化为淋巴母细胞，并开始进行有丝分裂.♦经过短期培养后，用秋水仙素处理.低渗、定.滴片和染色，就可获得大量中期分裂相的细胞，制片后可以清楚地对染色依进行观察.♦这种培养方法是Moorhead于1960年建立的.外周血淋巴细胞PHA、37t68hGO期或G1期秋水仙素■■■•至72h三、实验用品•1・材料：人体外周血材恒器、'水浴锅等培养箱、培养瓶.离心机.刻度离心•3•试剂：培养基、秋水仙素（12・5口g/ml）、植物凝集素（PHA）、肝素、0・075Mkcl低渗液、甲醇、冰乙酸、PH6.8磷酸缓冲液、Giemsa原液。四、实验方法1•外周血细胞培养采血：无菌，肝素抗凝。用无菌注射器抽取肝素o・2ml,润湿针筒,推出多余肝素•消毒后，抽取受试者静脉血2ml。)接种培养：每培养瓶加入0.3〜0.5ml(10滴)，接种于装有5ml培养基的培养瓶中，摇匀，37£培养箱中培养68小时。(20滴)•(3)秋水仙素处理：0.05〜0・4ug/ml培养基，轻摇混匀后，继续培养至72小时。实验方法染色体的制备收获细胞：用吸管吸取培养物，移至离心管中，以1500转/分离心10分钟，弃去上清液，留下沉淀物约0.3mloIII低渗处理：加入预温379的低渗液至8ml,用吸管轻吹打混匀，置于37C恒温水浴锅中低渗20分钟。低渗后吹打要轻•以防细胞破裂.上清液，留约0.3ml沉淀物。预固定：缓缓加入1ml新配制的固定液(甲醇：冰乙酸=3：1),立即用吸管轻吹打混匀。以1500转/分离心10分钟，弃重复固定1次。固定：加入新鲜固定液至8ml,吸管吹打混匀，室温固定20分钟，1500转/分离心10min,去上清液。依上述方法再实验方法（5）制备细胞悬液:预留0.2〜0・3m個定液，加2滴新配固定液制成细胞悬（6）滴片:吸取细胞悬液，滴2〜3滴于冰镇的载玻片上•于酒精灯火焰上过火后，空气干燥。（每组3张，只染1张）（7）染色：Giemsa染液染色10分钟，自来水轻冲洗,五、实验结果•在低倍镜下选择分散良好，长度适中的分裂相，再转至油镜观察。六、实验注意事项1•接种的血样愈新鲜愈好。2•培养中成败的关键，除了至为重要的PHA的效价外。培养的温度和培养液的酸碱度也十分重要。3.培养过程中，如发现血样凝集，可将培养瓶轻轻振荡，使凝块散开，继续放回37°C恒温箱内培养。4.制片过程中，如发现细胞膨胀得不大，细胞膜没有破裂，染色体聚集一团伸展不开，可将固定时间延长。每组上交2张未经染色染色体标本。
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