66例血液病患者bcr_abl融合基因、Ph染色体结果分析

一 l：O ～ 3 讨论 肺癌 可分 为小 细胞肺 癌 (SCLC)和非 小 细胞 啼癌 (NSCLC)，NSCLC包括鳞癌、腺癌和大细胞癌，占肺癌比例 70％ 一80％左右 J。肺癌的临床表现多样，70％ 一80％的患 者就诊时已属Ⅲ、Ⅳ期病变，丧失了根治的机会 肿瘤标 志物的检测成为近年来研究早期发现肿瘤的一一个重要手段 ， 而且新的标志物不断涌现，我们选择 CEA、NSE、CYFRA21—1 和CA19-9联检 NSCLC，探讨联检对早期发现诊断 NSCLC的 临床价值。 CEA是富含多糖的蛋白复合物，是临床应用较多的肿瘤 标志物，其对由内胚层分化来的肿瘤特别是消化道腺癌，其 有较高的阳性检出率，对早期的肿瘤诊断并不理想。本文结 果显示 ，CEA对 NSCLC诊断敏感性仅为44．07％。 NSE是糖原酵解．烯醇化酶中最有意义的同工酶形式， 特异地定位于神经元和神经分泌 APUD细胞系中，很多学者 认为，它是 SCLC的特异性标志物 J。在 NSCLC患者中的表 达相对较低。本文显示，NSCLC患者血清中 NSE含量明显 高于对照组(P<0．01)。 CYFRA21．1是由正常上皮细胞表达的 CK19的一个可 溶性片断，主要存在于肺肿瘤上皮细胞浆 内，是检测 NSCLC 尤其是鳞癌的重要标志物 4 J。本文显示，NSCLC患者血清 CYFRA21—1含量明显高于对照组。CA19-9是一种低聚糖类 肿瘤相关的糖类抗原 ，’，子量 >5000KD．存在于胎儿、。肾、肠 和胰腺的上皮，在成人肺中浓度较低。CAJ9-9作为一种非 特异性肿瘤标志物对 NSCLC也具有诊断价值 ，本文显示 ， 其对 NSCLC诊断敏感性为38．98％。 本文表明，NSCLC患者四种肿瘤标志物含量均明显高于 对照组，表明此四种肿瘤标志物对 NSCLC的辅助诊断有一 定的临床意义。联检结果显示 ，四项指标联检时对 NSCLC 诊断的敏感性可达94．50％，大大提高了NSCLC的阳性检出 率 。 参考文献 [1]罗素霞，马保根，陈小兵 ．血清肿瘤标志物联合检测在肺癌诊断 中的价值EJ]．中华检验医学杂志，2005，28(12)：1266． [2]周际昌，主编．实用肿瘤内科学[M]．第2版．北京：人民卫生出 版社，2003，538-539． [3]Pinson P，Joos G，Watripont P，et a1．Serum nem'on—specific ellolag~ as atumormarkerinthe diagnosis andfollow—up of small-celllung cancer [J]．Respiration，1997，64(1)：102—107． [4]Muraki M，Tohda Y，Lwanga T，et a1．Assessment of 8erulll cY· FRA21一l in lung c~llcer[J]．Cancer，1996，77(7)：1274—1277． [5]朱元钰，陈文彬 ．呼吸病学[M]．第 1版 ．北京：人民卫生出版 社，2OO4，459． (2011一O1—06收稿，2011一O1—20修回) 66例血液病患者 bcr／abl融合基因、Ph染色体结果分析 浙江省中医院(310006) 刘永林 陈益民 张 丽 彭来君 施丽华 谈潘莉 钱丽丽 胡正军 陈婷婷 虞玉群 CML特异性费城染色体(Philadephia，Ph)是由t(9：22) (q34：11)易位形成。9号染色体原癌基因 abl(Abelson pro- tooncogene)易位至22号染色体的断裂点簇集区(breakpoint duster region，ber)，发生重排 ，产生 bcr／abl融合基因，引起 CML的始动突变。融合基因 bcr／abl几乎见于所有的慢性粒 细胞性 自血病、25％ 一50％的急性 B系淋巴细胞性 白血病 (ALL)和约 5％的急性粒细胞性白血病中 J，本文统计了进 行染色体和bcr／abl融合基因检查的初诊血液病66例，对其 骨髓细胞染色体核型及 ber／~l融合基因进行分析。 1 资料和方法 1．1 一般资料 收集浙江省中医院2007年1月 ～2010年5 月初诊血液病患者66例(男 44，女 22)，年龄(6—77)岁，平 均 44岁。其中慢性粒细胞性白血病 48例，急性淋巴细胞性 白血病 1I例，急性粒细胞性白血病3例 ，慢性淋巴细胞性白 血病 1例，淋巴瘤骨髓侵犯 1例，白细胞增多症 2例，以上病 人诊断均参照《血液病诊断及疗效标准》拉J。 1．2 仪器与试剂 美国 Bio．RAD凝胶成像分析系统，美 国 ABI公司PE7000实时荧光定量 F-CR仪 ，Thermal cycler 480 DNA扩增系统，Trizol(invitrogen公 司)逆转录试剂盒(上海 宝诚生物工程大连有限公司)，引物为杭州晶大生物科技有 限公司合成。 1．3 染色体标本制备 染色体榱本来源骨髓，肝素抗凝，采 用直接法或24h短期培养法，收集 有丝分裂中期细胞，采用 R显带技术分析 20个分裂中期细 胞，核型分析或异常克隆 描述按《人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN)(1995)》进 行。 1．4 bcr／abl融合基因测定 取 骨髓标本经肝素抗凝 ，用 Ficol1分离液分离单个核细胞。Trrizol、氯仿-异丙醇法提取总 RNA，进行 RT—PCR，K562细胞株作 为阳性对照。RT反应体 系如 F：RNA 2trg，Oligo—dT 1 ’．，DEPC水补足 10 ，70cc 5min后加5mmol／L Tris—HCI 4 ，,~tNTP(10raM)2 ，Rnasin (40tr／ )O．5 ，DEPC水 1．5 ，25(=【：5rain，加逆转录酶(M — MLV)1 ，混 匀 25~C 10min，42℃ 60rain，70~C 10rain。取 逆转录产物4 进行 PCR，扩增程序为 ：95℃预变性 25min， 95℃ 1min、55~C 1min、72℃ 1min，35个循环72~C延伸 10min， 16~C60min将扩增好的产物电泳，放入凝胶成像系统内扫描。 2 结果 2．1 各类血液病 bcr／abl和 ph染色体检测结果 ，见表 1。 2．2 66例骨髓样本经显带法检测 Ph染色体与RT—PCR方 法检测融合基因后发现 ，45例 bcr／abl限性患者中染 色体阳 性为39例(86．67％)，48例 Ph染色体阳性患者中ber／abl阳 性有 4J0例(83．33％)，阳性总符合率为 85．05％。 表 1 各类血液病 Ph染色体及ber／abl检测结果 3 讨论 Ph染色体(ber／ab1)是CML的标志物，9号与22号染色 体发生遗传物质交换，产生 ber／abl融合基因，导致一种异常 融合蛋白p210(费城染色体编码融合基因产物)的产生 ]。 由于融合蛋白酪氨酸激酶活性增强，干扰正常细胞程序，抑 制细胞凋亡，导致细胞恶变 ，骨髓祖细胞大量增生，骨髓基质 细胞黏附性下降，使大量不成熟的髓细胞释放于外周血，导 致 CML。CML实验诊断技术有细胞遗传学方法、荧光原位 杂交技术、逆转录 PCR(RT—PCR)、巢 氏逆转录 PCR、实时定 量PCR法(real—time quantitative，RQ—PCR)等。细胞遗传学方 法可识别典型和变异 Ph染色体易位，还可检测多种染色体 异常，但检测速度较慢、灵敏度较低。PCR方法有高度的灵 敏性，可检测出微量的残留肿瘤细胞。本文运用 RT．PCR、染 色体显带技术对 66例血液病患者进行 ber／abl检测，46例 CML患者4_4例 bcr／abl阳性，45例 Ph染色体阳性 ，阳性率分 别为91．67％，93．75％，11例 ALL患者 I例 bcr／abl阳性(9． 09％)，2例 Ph染色体阳性(18．18％)，其余血液病患者仅有 1例 AML患者 Ph染色体阳性，ber／abl均阴性。这提示 bet／ ahl融合基因见 于大部分的 CML患者，此外，部分 ALL及 AML患者中也可出现。大量文献_4 J亦证实 bcr／abl融合基 因在各类自血病发生中的作用 本文在对两种方法检测融合基因后发现．45例 bcr／abl 阳性患者中染色体阳性为 39例(86．67％)，48例 Ph染色体 阳性患者中ber／abl阳性有 40例(83．33％)，刚性总符合率 为(85．05％)。理论上所有核型分析可见 Ph染色体的标本 都可检测到 ber／abl融合基因，但本文中有 8例 出现阴性表 达(16．67％)，其原因可能为标本送检或处理不及时致使 RNA降解，RNA酶广泛存在且稳定，RNA制剂中只要存在少 量的 RNA酶就会引起 RNA在制备与分析过程中的降解。 还有原因可能由于 RT引物设计上的不完善或反应体系中其 它存在的问题。本文对这 8名患者随后重新取样进行检测 ， 有 6例为 bcr／abl阳性，证实在标本送检和处理过程中引起 的RNA降解对结果的影响。另2例样本推测可能为反应体 系中如引物序列等原因引起假阴性或是少见型 bcr／abl融合 转录子的存在。另一方面，45例 bcr／abl阳性患者中染色体 阳性为 39例(86．67％)，推测由于染色体分析有时存在分裂 中期细胞少，质量欠佳，或有隐匿性易位存在而引起结果偏 差 。 Pl1染色体和 bcrfabl融合基因检测为 CML诊断提供 了 更为敏感和可靠的指标，但实际检测过程中，应注意标本的 送检与处理，对最终结果的解释应结合细胞形态学结果和临 床，仔细分析，并可进一步采用 FISH技术对骨髓细胞中期分 裂相或骨髓涂片直接进行 ber／abl融合基因检测 ，从而给临 床治疗和预后判断提供帮助。 参考文献 [1]Kurm~k R，Gutterman JV，T',dpaz M．The molecular genetics of philadelphia chromosome positive leukemias[J]．N Engl J Med，1988， 319(15)：990-998． [2]张之南 ，沈娣，主编 ．血液病诊断及疗效标准[M]．第 1版 ．北 京：科学出版社，2007，219—227． [3]Guo JQ，L／an J，Glassman A，et a1．Comparison of bcr／abl protein expression and philadelphia chromosome analy8e8 in chronic myelogenous leukemia patient8[J]．Am J Clin Pathol，1996，106(4)：4_42448． [4]Hawkins LM，Jayanthan ACt。Narendran A，et a1．Effects of l7一al— lylamino-17-demet hoxgeldmmmycin(17AAC)On pediatric acute lym— phoblastic leukemia(ALL)with respect to bcr／abl 8tatu8 and imatinib mesylate sensiffvlty[J]．Pedlatr Res，2005，57(3)：430437． [5]Cimino G，Pane F，Eha L．The role of BC1L／ABI isoforms in the presentation and outcome of patients tll philadelphia—positive acute lym phoblasfic leukemia：a 8evetl—year update of the GIMEMA0496 al[J]． Heamatologiea，2OO6，94(3)：377~80． [6]主鸿鹄，徐开林．慢性髓细胞白血病研究现状[J]．自血病 ·淋 巴瘤，2006，15(4)：303-306． (2011一O1一o9收稿，2011一O1—14修回)