DPPH法分析测定生地和熟地清除自由基的能力

DPPH法分析测定生地和熟地清除自由基的能力 桂语歌，宗晓菲，王晶，刘春明，李丽 (长春师范学院中心实验室，吉林 长春 130032) 摘 要:目的:采用不同提取溶剂、不同提取方法提取生地和熟地，并对其进行抗氧化活性研究。方法:采用 Folin － Ciocalteu方法测定生地和熟地不同提取物的总多酚含量，利用 DPPH测定样品清除自由基的能力。结果:生地正丁醇提 取物，熟地无水乙醇提取物的总多酚含量最高，ASE提取总多酚含量高。在 DPPH 实验中，生地正丁醇提取物和熟地丙 酮提取物的清除自由基的能力最强，ASE法提取样品均具有很好清除 DPPH自由基能力。结论:生地和熟地清除 DPPH 自由基能力的强弱与样品中的总多酚含量无关。 关键词:生地;熟地;总多酚;DPPH 中图分类号:R284 文献标识码:A 文章编号:1000 － 1719(2011)09 － 1866 － 03 Analysis and Determination Scavenging Free Radical of the Capacity of Raw Rehmanniae and Processed Radix Rehmanniae by DPPH GUI Yu-ge，ZONG Xiao-fei，WANG Jing，LIU Chun-ming，LI Li (The Central Laboratory，Changchun Normal University，Changchun 130032，Jilin，China) Abstract:Objective:To study antioxidant activity of Raw Rehmanniae and Processed Radix Rehmannia extracted by different solvents and methods． Methods:The samples were measured by Folin － Ciocaileu method and the free radical 2，2 － diphenyl － 1 － picrylhydrazyl (DPPH˙)assay． Results:The n － butanol extract of Raw Rehmanniae showed highest total phenolic contents (TPCs) ，however，the TPCs of ethanol extract Raw Rehmannia showed the highest TPCs． The TPCs of Raw Rehmanniae and Raw Rehmannia is the highest by the ASE method of extract． In DPPH experiment，the n － butanol extract of Processed Radix Reh- manniae and acetone extract of Processed Radix Rehmannia exhibited strong antioxidant activity，and the extracts of Processed Ra- dix Rehmanniae and Processed Radix Rehmannia by ASE have strong antioxidant activity． Conclusion:The TPCs of of Processed Radix Rehmanniae and Processed Radix Rehmannia didn’t affect the antioxidant activities． Key words:Raw Rehmanniae;Processed Radix Rhmannia;total phenolics;DPPH 收稿日期:2011 － 01 － 03 基金项目:国家自然科学基金(30970299) ;吉林省科技厅项目 (200905109，20090936) ;吉林省教育厅项目(2009D206， 2011 － 187) 作者简介:桂语歌(1986 －) ，女，吉林长春人，硕士研究生，研究方向:天 然产物化学。 通讯作者:李丽(1969 －) ，女，吉林人，副教授，博士，硕士研究生，研究 方向:天然产物化学。 地黄为玄参科植物地黄(Rehmannia glutinosa Li- bosch)的新鲜或干燥块根。根据炮制方法不同分为鲜 地、生地和熟地 3 种。鲜地是秋季采挖，除去芦头、须 根及泥沙，直接药用;生地是将鲜地缓缓烘焙至八成 干;熟地是将生地酒炖至酒吸尽，取出，晾晒至外皮黏 液稍干，取出晒至八成干时，切厚片或块，干燥。药理 研究表明:生地黄具有清热凉血、养阴生津的作用;而 熟地黄具有滋阴补血，益精填髓的功效［1 － 2］。另具报 道，地黄具有抗衰老的作用［3］。 本文采用 Folin － ciocalteu法测定生地和熟地不同 提取样品中总多酚的含量，并应用 DPPH 方法对其抗 氧化活性进行了系统研究。研究结果表明，生地正丁 醇提取物，熟地无水乙醇提取物的总多酚含量最高，生 地和熟地 ASE 提取物的总多酚含量高。在 DPPH 实 验中，生地正丁醇提取物和熟地丙酮提取物的清除自 由基的能力最强，ASE 法提取样品均具有很好清除 DPPH自由基能力。 1 实验部分 1. 1 实验设备与材料 DU800 型紫外可见分光光度计 (Beckman) ; SHB －Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限 公司) ;BS － 124S 电子天平(Sartorius AG，Sartorius) ; 加样枪(Germany) ;旋转蒸发仪(上海爱郎仪器有限公 司) ，ASE －150 快速溶剂萃取仪(Dionex)。 生地和熟地药材购于长春仁德医药;Folin － Cio- calteu 试剂，没食子酸标准品，2，2 － diphenyl － 1 － pic- rylhydrazyl (DPPH·)试剂购自 Sigma Chemical Co. 公司 (St. Louis，Mo) ;实验所用试剂均为分析纯，购于 北京北化精细化学品有限责任公司;水为超纯水 18. 2 ΩPa。 1. 2 样品制备 1. 2. 1 不同溶剂提取 精密称取生地和熟地药材粉 末 5 份，每份约 2g，置于具塞锥形瓶中，分别加入乙酸 乙酯、正丁醇、丙酮、无水乙醇、80%乙醇 50mL，常温下 ·6681· 辽宁中医杂志 2011 年第 38 卷第 9 期 超声提取 2 次，提取时间为 30min，过滤，合并滤液，减 压回收溶剂至干，用 4mL甲醇溶解，得样品。 1. 2. 2 不同提取方法 精密称取生地和熟地药材粉 末 4 份，每份约 2g，80% 乙醇 50mL 为提取溶剂，分别 采用回流、常温超声，冷浸 3 种提取方法提取 2 次，提 取时间为 30min，过滤，合并滤液;另一份样品采用 ASE快速溶剂萃取方法提取，以 80%乙醇作为提取溶 剂，提取温度 40℃，提取时间 5min，静态提取 2 次，过 滤，合并滤液。将过滤后的样品减压回收溶剂至干，分 别用 4mL甲醇溶解，得样品。 1. 3 样品总多酚含量测定 采用 Folin － Ciocalteu 方法测定样品总酚含量［4］， 结果表示为每克样品中含有相当没食子酸的毫克数。 吸取 0. 2 mL一定浓度(使吸光度值落在标准曲线上) 的没食子酸标准品或样品溶液，分别加入 1mL 0. 5N的 Folin － Ciocalteu 试剂，0. 8 mL7. 5% 的碳酸钠溶液，充 分混合，室温下放置 0. 5h，然后在 765nm 下测吸光度。 以没食子酸溶液浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标得标 准曲线方程为 y = 9. 5623x － 0. 1332(R2 = 0. 9999) ，没食 子酸质量浓度范围为 0. 02 ～0. 2 mg /mL。 1. 4 DPPH分析 DPPH自由基(二苯代苦味肼基自由基，2 － 2 － di- phenyl － 1 － picry － hydrazyl radical)是一种稳定的以氮 为中心的质子自由基，其甲醇或乙醇溶液呈紫色，在波 长 515 nm处有强烈吸收。在有自由基清除剂存在时， 自由基清除剂提供 1 个电子与 DPPH的孤对电子配对 而使其褪色，褪色程度与其接受的电子呈定量关系，在 波长 515nm处的吸光度变小，其变化程度与自由基清 除程度呈线性关系，即自由基清除剂的清除自由基能 力越强、吸光度越小［5 － 6］。 准确称取 DPPH，配置浓度为 0. 04076mg /mL 的 ［DPPH·］乙醇溶液，得到［DPPH·］标准曲线为:y = 18. 032x － 0. 0016，R2 = 0. 9993。样品浓度范围为 0. 000815 ～ 0. 04076 mg /mL。 分别取 0. 1mL 不同样品溶液，分别加入 3. 9 mL 质量浓度为 2. 5mg /100mL［DPPH·］标准液(现用现 配)。以乙醇溶液为空白，将混合溶液摇匀，用比色 皿，在 515nm波长处，测定其在不同时间的吸光度值， 根据标准曲线可以换算成［DPPH·］的质量浓度，从 而计算出［DPPH·］残留率。根据［DPPH·］残留率 和相应的样品添加量，可以绘制样品清除［DPPH·］ 自由基的曲线。根据［DPPH·］的质量浓度与吸光度 的关系曲线，可以将添加自由基清除剂后侧的吸光度 换算为［DPPH·］的质量浓度，从而计算出添加自由 基清除剂后的［DPPH·］残留率，其计算公式如 下［5 － 6］: ［DPPH·］REM =［DPPH·］T /［DPPH·］T = 0 × 100% 其中［DPPH·］T 为自由基清除过程中某一时刻 ［DPPH·］的质量浓度，［DPPH·］T = 0为［DPPH·］的 原始质量浓度。 根据［DPPH·］残留率与相应地黄提取物的添加 量，制作二者的关系曲线，通过线性回归分析可以得到 回归方程，根据回归方程式可以计算出［DPPH·］残 留率为 50%时样品的添加量即半抑制量(EC50)。AE 则代表自由基清除能力 AE(Antiradical efficiency) ， AE =1 /EC50。 2 结果与分析 2. 1 Folin － ciocalteu法测定总多酚含量 2. 1. 1 不同溶剂提取样品总多酚含量测定 见表 1。 表 1 不同溶剂提取生地和熟地中的总多酚含量 样品 总多酚含量(mg 没食子酸 / g 样品) 生 地 熟 地 正丁醇提取 408. 98 300. 04 无水乙醇提取 399. 75 398. 49 乙酸乙酯提取 244. 76 220. 45 80%乙醇提取 200. 51 240. 24 丙酮提取 166. 30 196. 57 如表 1 所示，采用正丁醇、无水乙醇、乙酸乙酯、 80%乙醇及丙酮 5 种不同溶剂提取生地和熟地中总多 酚物质，生地不同样品的总多酚含量分别为 408. 98， 399. 75，244. 76，200. 51，166. 3mg没食子酸 / g 样品，熟 地不同样品的总多酚含量分别为 300. 04，398. 49， 220. 45，240. 24，196. 57 mg 没食子酸 / g 样品。可见， 生地正丁醇提取的样品总多酚最高;而熟地无水乙醇 提取的样品总多酚含量最高。 2. 1. 2 不同提取方法样品总多酚含量测定 如表 2 所示，采用超声、回流、ASE 和冷浸四种方法提取生地 和熟地中的多酚类化合物，生地不同样品总多酚含量 分别为 290. 25，204. 14，200. 51，120. 08mg 没食子酸 / g 样品，熟地不同样品总多酚含量分别为 239. 92， 226. 86，240. 24，224. 93mg 没食子酸 / g 样品。可见， ASE法从生地中提取的总多酚含量最高，ASE 和超声 法从熟地中提取的总多酚含量接近、偏高。并且 ASE 法具有高效、省时、节省溶剂、环保的特点。因而，ASE 法可以作为从生地和熟地中提取多酚类化合物的最佳 提取方法。 表 2 不同方法提取生地和熟地中的总多酚含量 样品 总多酚含量(mg 没食子酸 / g 样品) 生 地 熟 地 ASE提取物 290. 25 239． 92 回流提取物 204. 14 226． 86 超声提取物 200. 51 240. 24 冷浸提取物 120. 08 224． 93 2. 2 DPPH法测定样品的抗氧化活性 2. 2. 1 DPPH 法分析不同提取溶剂样品抗氧化活性 DPPH实验中 EC50 越小，清除自由基能力越强，AE 越大，清除自由基能力越强。由表 3 可以看出，生地不 同提取溶剂提取物的清除自由基能力的强弱顺序为: 正丁醇提取物 ＞乙酸乙酯提取物 ＞无水乙醇提取物 ＞ 丙酮提取物 ＞ 80%乙醇提取物。熟地不同溶剂提取样 品的清除自由基能力的强弱顺序为:丙酮提取物 ＞无 水乙醇提取物 ＞正丁醇提取物 ＞乙酸乙酯提取物≈ 80%乙醇提取物。可见，生地正丁醇提取物的清除自 由基的能力最强，而熟地丙酮提取物的清除自由基的 能力最强。 ·7681·辽宁中医杂志 2011 年第 38 卷第 9 期 表 3 生地和熟地不同溶剂提取物的清除自由基能力 样品 生地 半抑制率a 清除能力b 熟地 半抑制率a 清除能力b 80%乙醇提取 3. 75 ± 0. 91 0. 27 ± 0. 07 4. 25 ± 0. 25 0. 23 ± 0. 08 丙酮提取 3. 02 ± 0. 14 0. 31 ± 0. 01 1. 34 ± 0. 21 0. 76 ± 0. 12 无水乙醇提取 2. 32 ± 0. 23 0. 43 ± 0. 04 2. 00 ± 0. 06 0. 51 ± 0. 02 乙酸乙酯提取 1. 93 ± 0. 17 0. 52 ± 0. 05 4. 54 ± 0. 00 0. 22 ± 0. 00 正丁醇提取 1. 64 ± 0. 18 0. 61 ± 0. 07 3. 02 ± 0. 13 0. 33 ± 0. 01 注:a:mg 抗氧化物 /mg DPPH·;b:AE = 1 / EC50。 2. 2. 2 DPPH 法分析不同方法提取样品抗氧化活性 由表 4 可以看出，采用超声、回流、ASE 和冷浸 4 种 提取方法，所得的生地和熟地的不同提取物的清除 DPPH自由基能力的进行比较，ASE 法提取的生地清 除 DPPH 自由基能力最好，而冷浸法提取的熟地黄清 除 DPPH自由基能力强。 由于炮制方法不同，生地和熟地的总多酚含量及 清除 DPPH自由基的能力也不一样，而且研究表明生 收稿日期:2011 － 01 － 17 基金项目:“十一五”国家科技重大专项(2009ZX09103 － 338) 作者简介:王徽(1985 －) ，男，山东济南人，硕士研究生，研究方向:中药 制剂新技术和新剂型。 作者简介:代龙，男，教授，硕士生导师，Tel : (0531)82860367;E － mail: dailongdailong@ 126． net 地和熟地清除 DPPH自由基能力的与样品中的总多酚 化合物无关。 表 4 生地和熟地不同提取方法清除自由基能力 样品 生地 半抑制率a 清除能力b 熟地 半抑制率a 清除能力b 回流提取 5. 17 ± 0. 81 0. 20 ± 0. 03 3. 12 ± 0. 14 0. 32 ± 0. 01 超声提取 3. 75 ± 0. 91 0. 27 ± 0. 07 4. 25 ± 0. 25 0. 23 ± 0. 08 ASE提取 3. 70 ± 1. 11 0. 28 ± 0. 08 3. 17 ± 0. 06 0. 32 ± 0. 00 冷浸提取 2. 7 ± 0. 47 0. 10 ± 0. 07 2. 54 ± 0. 47 0. 40 ± 0. 07 注:a:mg 抗氧化物 /mg DPPH˙;b:AE = 1 / EC50。 参考文献 ［1］ 吕杨，王慧森，李更生，等．正交试验优选鲜地黄提取工艺［J］．中 医研究，2009，22(2) :18 － 20． ［2］ 国家药典委员会．中华人民共和国药典:一部［M］． 北京:化学工 业出版社，2005:82283． ［3］ 曾艳，贾正平，张汝学． 地黄化学成分及药理研究进展［J］． 中成 药，2006 － 4，28(4) :609 － 611． ［4］ C S Ough，M A 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was used with Spherisorb C18 column(4． 6mm × 150mm，5μm) ，with 1． 7% formic acid － methanol (60∶ 40)used as a mobile phase． The detection wavelength was at 286nm． The flow rate was 1． 0 mL·min －1 ． Results:The linear response range lay in 0． 323mg ～ 1． 939mg，the average recoveries of paeoniflorin was 98． 10% ． Conclusion:This method was proved to be simple， accurate and can be used for quality control of xintong dropping pills． Key words:HPLC;xintong dropping pills;salvianolicacid B 心通滴丸是由瓜蒌、薤白、丹参、三七等中药提取 精制而成的一种中药制剂。它是由传统医学名方——— 瓜蒌薤白白酒汤经加味而成，临床用途不断扩大，用于 治疗冠心病、心绞痛及心肌梗死等疾病。为了更好的 控制本制剂的质量，本文采用 HPLC 法对心通滴丸中 的丹酚酸 B进行质量控制研究。 1 仪器与试药 LC －2010A型高效液相色谱仪(日本岛津 CLASS － VP工作站) ;AB135 － S电子天平(瑞士梅特勒 －托利 多公司) ;超声机(昆山市超声仪器有限公司 KQ － ·8681· 辽宁中医杂志 2011 年第 38 卷第 9 期