地高辛标记cDNA探针检测猪繁殖与呼吸综合征病毒

地高辛标记cDNA探针检测猪繁殖与呼吸综合征病毒 地高辛标记cDNA探针检测猪繁殖与呼吸 综合征病毒 畜牧与兽医2007年第39卷第5期?43? 地高辛标记cDNA探针检测猪繁殖与 呼吸综合征病毒 李广明,姜平,李玉峰,秦承学 (南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室,江苏南京210095) 摘要:本研究以猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)S1株ORF7基因为模板,通过RT—PCR技术扩增出394bp的cDNA.用PCR纯化试剂盒纯化 PCR产物,并以此为模板制备出地高辛标记的cDNA探针.特异性试验 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明,该探针仅与PRRSV核酸反应,与PPV,PRV,FMDV,HCV及PCV2 的核酸反应为阴性.敏感性检测表明,采用CSPD化学发光检测时,硝酸纤维素膜上最低检出量为62.5Pg;尼龙膜上最低检出量为0.5Pg.应用 该探针,在尼龙膜上对1O份PRRSV阳性病料的组织RNA样品进行检测,结果均为阳性,与RT-PCR检测结果一致,证明该方法可用于PRRSV临 床样品检测. 关键词:地高辛标记;探针;斑点杂交;化学发光;猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒 中图分类号:$858.285.2文献标识码:B文章编号:0529—5130(2007)05—0043—03 猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductiveandrespir— atorysyndromevirus,PRRSV)归属于动脉炎病毒科(Ateriviri- dae)动脉炎病毒属(Arterivirus),为有囊膜单股正链RNA病 毒.该病毒可引起母猪发热,流产,死产,木乃伊胎和产弱仔 等繁殖障碍以及仔猪的呼吸道疾病.该病从1987年首次在美 国发现以来,迅速传播至世界养猪国家与地区.自我国 1996首次从国内猪场分离到本病毒以来,该病毒已在我国迅 速传播,造成巨大经济损失.目前,实验室常用的诊断方 法包括病毒分离和鉴定,RT—PCR技术,免疫过氧化物酶细胞 单层试验(IPMA),间接免疫荧光法(IFA)和ELISA试 验等一. 核酸探针杂交技术是一种敏感性和特异性都很高的检测方 法.Sur等通过扩增PRRSV的ORF7,用地高辛标记方法制备 了特异性的cDNA探针,从而建立了原位杂交法用于检测 PRRSV.Larochelle等在分析了美洲型与欧洲型PRRSV各自 基因组特点的基础上,制备了组合型地高辛标记的cDNA探 针,在检测的同时可以对病毒进行分型J.任慧英等利用RT. PCR技术扩增了ORF6的一段基因,并制备了地高辛标记的 cDNA探针一. 本研究采用liT-PCR技术扩增PRRSVORF7的一段基因, 利用地高辛标记试剂盒制备了cDNA探针,并通过比显色法更 加敏感的化学发光法对靶基因实施检测,从而建立了尼龙膜上 斑点杂交,化学发光检测PRRSV的检测方法,为PRRSV检测 和致病机理研究奠定了基础. 收稿日期:2006-06-17 基金项目:国家自然科学基金(30471288,30270990),新世纪优 秀人才项目(NCET.04.0502),教育部博士点基金项目 (2003030712). 作者简介:李广明(1981.),男,硕士研究生. 通讯作者. 1材料和方法 1.1病毒和病料 PRRSVS1分离株由本实验室分离保存.患病仔猪肺脏病 料10份,由本实验室收集保存. 1.2试剂和器材 DIGHighPrimeDNALabelingandDetectionStarterKitII购 自Roche公司.Ag~oseGelDNAPurificationKitVer.2.0购自 TaKaRa公司.反转录酶(M—MLV)和TaqDNA聚合酶购自 Promega公司.引物由TaKaRa合成.其它试剂根据试剂盒说 明和分子克隆严格配制.用于膜上RNA杂交的所有溶液用 DEPC处理过的双蒸水配制,使用的玻璃器皿经常规洗涤处理 后高压灭菌,160oC烘烤2h. 1.3病毒RNA抽提 用Trlzol试剂按 说明书 房屋状态说明书下载罗氏说明书下载焊机说明书下载罗氏说明书下载GGD说明书下载 方法提取PRRSV细胞毒上清液或 组织病料总RNA. 1.4RT.PCR 反转录采用10L反应体系,含Oligo(dT)0.5L, dNTP(10mmol/L)0.25ILL,5Xbuffer2ILL,RNA7L,65 ?水浴10min,加入反转录酶(M-MLV)0.25ILL,37oC1h. PCR采用25反应体系,含N,/N:引物(N序列:5-CCA GAATTCCATCATGCTGAGGGTGATGC一3;N,序列5-CGA GGATCCAATATGCCAAATAACAACGG-3)(1mmol/L) 各加0.5ILL,Mg"(2.5mmolfL)1.5L,dNTP(2.5mmoL/ L)2ILL,10Xbuffer2.5ILL,Taq酶0.2ILL,双蒸水16.8ILL, cDNA1ILL.反应程序:95oC3min;94?458,58oC458, 72?608,34个循环;72oC10min.扩增基因片段大小为 374bp. 1.5地高辛标记探针的制备方法 PCR产物纯化按照DNA纯化试剂盒说明进行.cDNA探 针标记按照地高辛标记试剂盒说明进行,反应体系为20, 包括煮沸变性的cDNA1ug(16),随机引物(试剂盒提 供),dATP,dTI'P,dGTP,DIG.dUTP及Klenow酶和缓冲液4 ? 44?AnimalHusbandry&VeterinaryMedicine2007Vo1.39No.5 ,37?反应过夜.65?10min终止反应.标记好的探针于 一 20?保存. 1.6探针标记效率检测 将Dig标记的 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 DNA和探针稀释到1ng/ILL和10,3, 1,0.3,0.1,0.03及0.01pg/ILL.每一稀释度取1ILL点于硝 酸纤维素膜上,在12000p.J/cm的紫外灯下固定1min后, 将膜转移到马来酸缓冲液中,室温作用2rain,转移到封闭液 中孵育30min.之后在连有碱性磷酸酶的抗DIG抗体溶液中孵 育30min.洗脱液洗膜2X15min.检测缓冲液中平衡3min 后,在膜上滴加CSPD化学发光底物,封膜,对x光片进行曝 光和显影. 1.7探针敏感性检测 将纯化的PCR产物100?变性10min后,倍比稀释,分 别取1ILL点于硝酸纤维素膜和尼龙膜上,在12000p.J/cm的 紫外灯下固定1min;将膜转移到预热到42?的预杂交液中, 预杂交1h;将标记的探针100?变性10min,在冰上冷却5 min,之后1:1000加入到42?预杂交液中,使用浓度约50 pg/ILL;将膜转移到杂交液中,杂交过夜.杂交后经三步洗 涤:2×SSC(含0.1%SDS)室温振摇洗2X5min;0.5XSSC (含0.1%SDS)65?洗2X15min;洗脱液中2X15min.封 闭,抗体孵育和曝光显影等过程同上. 1.8探针特异性检测 取细小病毒(PPV),伪狂犬病毒(PRV),口蹄疫病毒 (FMDV),猪瘟病毒(HCV),圆环病毒2型(PCV2),猪繁 殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)的核酸各2ILL点于尼龙 膜上,之后处理膜的过程同上. 2结果 2.1探针标记效率 按照试剂盒标准的标记反应所得的DIG标记探针与对照 样品点于硝酸纤维素膜上,通过与对照样品同时曝光判定.结 果显示,相同稀释度的标记探针与对照样品的曝光度基本相 同,说明探针浓度与对照样品浓度基本一致,标记效率较为理 想(图1). A—B.对照DNA样品C,D标记探针 A,C.1—4为1ng/L,10pg/ixL,3pg/L,1pg/ixL B,D.1,4位0.3pSIILL,0.1pSIL,0.03pSIILL,0.01pg/ILL 图1eDNA探针标记效率检测结果 pg/ILL.同时取0.5,0.25,0.125ng/;62.5,31.25,15, 7.5,3.75,1.8,1,0.5,0.25pg/ILLPCR产物点于尼龙膜 上,进行斑点杂交.结果显示,相同曝光时间的情况下,硝酸 纤维素膜上最低检测量为62.5pg/ILL(图2);而尼龙膜上最 低检测量为0.5pg/ILL(图3). A1,4 B1,d C1,d D1,4 63ng/ILL,32ng/ILL,16ng/ILL,8ng/ILL 4ng/ILL,2ng/ILL,1ng/ILL,0.5ng/ILL 25pSIILL,125pg/ILL,62.5pg/ILL,31pg/ILL 15pSIILL,7.5pg/ILL,375pg/ILL,0pg/ILL 图2NC膜上核酸探针敏感性检测结果 1234 -I_黑l……l—A1,4.0.5ng/ILL,0.25ng/ILL,125pg/ILL,62.5pg/ILL B1,4.31pg/ILL,15pg/txL,7.5pg/ILL,3.75pg/ILL C1,4.1.8pg/ILL,1pg/txL,0.5pg/ILL,0.25pg/ILL 图3Nylon膜上核酸探针敏感性检测结果 2.3探针特异性 将PRRSV,PPV,PRV,FMDV,HCV,PCV2的核酸点于 尼龙膜上进行杂交,结果表明该探针仅与PRRSV核酸反应, 与其它5种病毒的核酸不反应,为阴性(图4). A B 23 A1,3.PRRSV,PPV,PRV B1,3.FMDV,HCV,PCV2 图4核酸探针特异性试验 2.2 …,…………….. 2 ir,1~//病料组织.提核酸后进Pc R产物于硝酸纤维素膜上点样,取6.,.2,,,4,行PRRsv, RT-P … CR …'' 测 t,plo , - P 结 J/I 陛.另. 2,1,0.5,0.25,0.125ng/txL;62.5,31,15,7.5,3.75.'..…………,… 一 舔 一 畜牧与兽医2007年第39卷第5期?45? (图5A)和病毒RNA(图5B)1L点于尼龙膜上,通过固定,杂交,曝光和显影后,均可见 到清晰的曝光点. 3讨论 A 1234512345 67891O6789lO A.PCR产物斑点杂交B.病毒RNA斑点杂交 图5核酸探针临床样品检测结果 核酸探针标记物分为同位素,生物素和地高辛等,其中同 位素探针敏感性好,特异性强,分辨率高,但其半衰期短,并 易对人体造成危害,所以已逐渐被非放射性标记物取代.生物 素探针敏感性低于同位素探针,而且由于生物样品中内源生物 素及生物结合蛋白存在,容易产生非特异性.地高辛可从洋地 黄植物中提取出获得,具有分子量小和渗透性好等特点,其标 记的探针是一种类固醇半抗原.地高辛标记法,于1988年报 道,其检测过程使用了抗原抗体特异性反应,在原位杂交分析 中具有高敏感性,安全性,特异性和快速简便等优点,并且地 高辛探针可以一20?冻存数月至1年以上,因此,该标记 探针受到广泛青睐.本文在通过对GenBank数据库中PRRSV ORF7基因序列分析的基础上, 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 合成了一对PCR引物,通 过RT.PCR技术获得大小394bp的DNA片段.利用随机引物 法,将纯化DNA片段标记成地高辛探针,斑点杂交后用化学 发光法检测靶基因.特异性试验和敏感性试验的结果表明,该 探针具有较高的特异性和敏感性. 核酸探针检测敏感性受到多种因素的影响,包括探针标记 效率,杂交体系溶液成份及显色等.本研究在确保探针标记效 率和杂交体系成份稳定可靠的基础上,对杂交膜和CSPD化学 发光检测X光片曝光时间进行了优化选择,结果发现,尼龙 膜上的最低检出量为0.5pg/,硝酸纤维素膜上最低检出量 是62.5pg/.说明用尼龙膜时敏感性可明显提高,此外, 曝光时间的长短对判定试验结果有一定影响,并且两种膜的最 佳曝光时间也相差较大.尼龙膜的最佳曝光时间在6h左右, 而硝酸纤维素膜的最佳曝光时间在36h左右. 本文建立的斑点杂交检测PRRSV的方法与传统的病原学 和血清学检测方法相比,具有操作简便,快速,准确和敏感性 高等特点;与RT—PCR检测方法相比,虽然敏感性没有RT— PCR高,检测时间较长,但是避免了假阳性,非特异性扩增 及交叉污染等问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 .为了将该方法直接用于检测临床样品病毒 RNA,本研究对PRRSV阳性组织RNA样品进行了检测,结果 证明,该方法可以直接检测RNA.但在点样杂交处理过程中, B 必须防止RNase污染而影响结果,其反应条件有待于进一步的 研究.该方法为PRRSV检测和致病机理研究奠定了重要基础. 参考文献: RowlandRR,LawsonS,RossowK,eta1.Lymphoidtissuetropism ofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusreplicationdur- ingpersistentinfectionofpigs0堍inallyexposedtovirusinutero [J].VetMicmbio,2003,96:219—235. 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