【精品推荐】汉坦病毒包膜糖蛋白糖基化位点突变体的构建临床医学论文_医药学论文_5283

【精品推荐】汉坦病毒包膜糖蛋白糖基化位点突变体的构建临床医学 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 _医药学论文_5283 论文范文 题目:汉坦病毒包膜糖蛋白糖基化位点突 变体的构建临床医学论文_医药学论文 编辑:小小 【摘要】 目的 构建汉坦病毒糖基化位点的突变体。 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 利用基因 定点突变的方法构建了5个糖蛋白突变体～即将G1、G2上的天冬酰 胺臵换为丙氨酸～根据被替换的位臵～突变体分别命名为N134A、 N235A、N347A、N399A、N928A。结果 构建的5个N-联糖基化位点 的突变体～经测序图谱显示原序列中的天冬酰胺,N,均被臵换为丙 氨酸,A,。结论 成功构建了5个糖基化位点的突变体～为进一步 研究N-联糖基化的缺失对细胞融合的影响奠定了基础。 【关键词】 汉坦病毒,糖基化位点,突变体构建 Abstract: Objective To construct N-linked glycosylation site mutants of hantavirus. Methods Site-directed mutagenesis was used to construct five glycoprotein gene mutants which were designed as N134A, N235A, N347A, N399A and N928A according to the substitution sites of asparagine with alanine on G1 and G2. Results Five N-linked glycosylation site mutants were constructed and their sequencing showed the asparagine (N) residues at the N-linked glycosylation sites on G1 and G2 were replaced by alanine (A). Conclusion N-linked glycosylation site mutants were successfully constructed and laid the foundation for study on the roles of N-linked glycosylation of HTNV glycoproteins in cell fusion. Key words: hantavirus; glycosylation site; construction of mutants 汉坦病毒(hantavirus～HV)是布尼亚病毒科(bunyaviridae)汉坦病毒属(genus hantavirus)的一员～是肾综合征出血热和汉坦病毒肺综合征的共同病原体。基因组为分节段的单股负链RNA～由长,L,、中,M,、短,S,3个基因片段组成～其中M片段编码的包膜糖蛋白G1、G2含有HV的主要生物学活性位点。 HV致病性取决于包膜糖蛋白的结构和功能～关键在于其与宿主细胞之间的相互作用～细胞融合则是病毒侵入细胞、复制、释放、传播、致病的重要生物过程～也是细胞间信息传递的重要步骤。而糖基化不仅在蛋白的正确折叠和胞内运输中起着重要作用～对细胞融合也有重要影响。 联糖基化HV G1和G2糖蛋白上分别有5个和1个位点可提供N-,1,。各糖基化位点对蛋白折叠和胞内转运的影响力不同～N134位点的糖基化对糖蛋白正确的折叠非常关键～而其他位点突变以后对糖蛋白折叠影响不大。为了解各糖基化位点对细胞融合的影响～利用基因定点突变技术构建了5个N-联糖基化位点的突变体～为进一步研究各糖基化位点的改变在细胞融合中所起的作用奠定基础。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 质粒与菌株 质粒pMD18-T10.1和pMD18-T10.2由山东省疾病预防控制中心陶泽新博士构建并保存。大肠杆菌DH5 菌株用LB培养基培养～本室保存。 1.1.2 试剂 质粒提取试剂盒购于美国Omega公司～PCR材料、各种内切酶购于大连宝生物,TaKaRa,工程有限公司～琼脂糖凝胶电泳材料购自美国Sigma公司～测序由北京博尚生物技术有限公司完成。 1.2 方法 1.2.1 碱裂解法提取质粒pMD18-T10.1和pMD18-T10.2 过夜培养分别含有G1、G2基因的质粒pMD18-T10.1和pMD18-T10.2～利用E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I质粒抽提试剂盒分别抽提2种质粒。 1.2.2 单酶切反应 将质粒pMD18-T10.1和pMD18-T10.2分别用 和Kpn?单酶切～命名为E1、E2、E3、E4。 Pst? 1.2.3 PCR扩增所需片断 以E1、E2、E3、E4作为 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 进行PCR扩增。目的是将G1、G2糖基化位点上的天冬酰胺臵换为丙氨酸。引物设计如下:N134AP1 up:5′-TCTAGCCTGTGCGAGTACATTCTG T-3′～N134AP1 down:5′-CACTTCAAGAACTCTGTAGCACC-3′,N134AP2 up:5′-GGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTG -3′～N134AP2 down:5′-ACAGAATGTACTCGCACAGGCTAGA-3′,N235AP1 up:5′-GCTCCAAATGTGCTAATACAGATAC-3′～N235AP1 down:5′-CACTTCAAGAACTCTGTAGCACC-3′,N235AP2 up:5′- GGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTG-3′～N235AP2 down:5′-GTATCTGTATTAGCACATTTGGAGC-3′,N347AP1 up:5′-TTCCTAACCTAGCTCAGTCAGTCTG-3′～N347AP1 down:5′-TATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAA-3′,N347AP2 up:5′-TTAATAGACTGGATGGAGGCGGATA -3′～N347AP2 down:5′-CAGACTGACTGAGCTAGGTTAGGAA-3′,N399AP1 up:5′-GAGGTATTTTCGCGATTACTTCTCC-3′～N399AP1 down:5′-TATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAA-3′,N399AP2 up:5′-TTAATAGACTGGATGGAGGCGGATA-3′～N399AP2 down:5′-GGAGAAGTAATCGCGAAAATACCTC-3′,N928AP1 up:5′-TCCAATCATTTGCGACAAGCAATAT-3′～N928AP1 down:5′-CTCAGCGATCTGTCTATTTCGTT-3′,N928AP2 up:5′- AACGAAATAGACAGATCGCTGAG-3′～N928AP2 down:5′-ATATTGCTTGTCGCAAATGATTGGA-3′。反应条件为:94?预变性2 min,94? 30 s～55? 1 min～72? 2.5 min,10.2的扩增为1.5 min,～30个循环,72? 延伸7 min。 1.2.4 转化及阳性克隆的筛选 首先制备好感受态细胞～然后将10 μl PCR产物加入其中～以CaCl2法转化大肠杆菌DH5α～利用Amp抗性筛选阳性克隆～酶切鉴定并测序～测序正确后突变体分别命名为N134A、N235A、N347A、N399A、N928A。 2 结 果 构建糖基化位点缺失的糖蛋白突变体～将糖基化位点上的天冬酰胺,N,臵换为丙氨酸,A,。为了便于说明各个位点的情况～将其示意图展示如下～见图1。 图1 汉坦病毒各糖基化位点示意图 以E1、E2、E3、E4为模板进行PCR扩增～结果如图2。引物N134AP1 up和N134AP1 down扩增的片段命名为P1～以此类推～分别由2对相邻引物扩增的片断依次为P2，P10。其中片段P1-P8长度约2400 bp～P9和P10长度约2100 bp～与预期结果一致。 平板上长出的菌落挑取培养后提取质粒电泳～以pMD18-T10.1和pMD18-T10.2作为对照～1至4泳道的片段大小与pMD18-T10.1相等～约4700 bp,第6泳道的片段大小与pMD18-T10.2相等～约4100 bp,图3,。质粒用BamH?，Hind?双酶切鉴定～得到长度为2700 bp和2000 bp,1，4泳道,、1400 bp,5泳道,的片段,图4,。阳性菌株送交北京博尚生物技术有限公司测序～突变位点的测序结果如图5所示。证明构建正确～是所需要的突变体。 3 讨 论 HV糖蛋白G1、G2的结构比较复杂。G1蛋白的跨膜结构尚有争议～G2蛋白是典型的?型糖蛋白～ G2蛋白位于G1的外侧,2,。HV G1和G2蛋白都由N-联糖基化修饰～有6个潜在的N-联糖基化位点～其中5个在G1上,N134、N235、N347、N399、N609,～1个在G2上,N928,。N-联糖基化不仅对蛋白的正确折叠十分重要～而且与病毒包膜糖蛋白的许多功能相关,3-5,～如结合受体、介导膜融合和病毒进入细胞、引导病毒在出芽部位的形态发育、作为抗原引发保护性免疫反应等。Shi等,1,证实各糖链均为高甘露糖型～他们用基因定点突变技术构建了6个N-联糖基化位点突变体及4个双位点突变体～发现G1上的4个位点,N134、N235、N347、N399,和G2上的1个位点,N928,被利用而被糖基化～而G1位于胞质内的1个位点,N609,未被利用。因此在本试验中我们利用基因定点突变的方法构建了5个糖基化位点的突变体～即将G1上的4个位点,N134、N235、N347、N399,和G2上的1个位点,N928,共5个位点上的天冬酰胺突变为丙氨酸～分别命名为N134A、N235A、N347A、N399A和N928A～以期探讨各糖基化位点对细胞融合活性及 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面表达的影响。 N-联糖基化可以在很多方面影响蛋白的功能～如促进它们正确折 叠、维持蛋白的构型和稳定性、保护蛋白免受蛋白溶解作用、调控 蛋白的生物学活性。已有报道显示某些病毒融合蛋白的寡糖链缺失 可使病毒的细胞融合功能缺陷或丢失,6-7,。Zheng等,8,通过 单突变或联合突变各个糖基化位点后再在细胞内表达发现～G2上糖 基化位点的突变,N928,会导致细胞融合活动的消失～而G1上糖基 化位点的突变,N235A、N347A、N399A,则对细胞融合活动没有明显 影响。这充分说明G2上的糖基化位点,N928,在细胞融合中起着重 要作用～它的缺失足以导致细胞融合活动的完全阻断。很可能是由 于G2上糖基化位点的破坏引起融合蛋白的错误折叠或是稳定性的下 降～不能够触发随后一系列的结构重排～结果导致融合活动的消 失。 我们,9,以前已通过实验成功构建了HV包膜糖蛋白基因 G1、G2的真核表达载体并在Vero E6细胞中有效表达～二者的共表 达可以产生良好的生物学活性～在酸性条件下引起Vero E6细胞发 生融合。从而证实HV的融合蛋白为糖蛋白～但还没有确定其融合肽 究竟是位于糖蛋白G1还是G2上～因此尚需进一步研究～以精确定 位细胞融合的活性位点。为此在本实验中我们构建了5个N-联糖基 化的突变体～打算研究各糖基化位点的改变对细胞融合的影响。因 为时间有限～不能进一步研究各糖基化位点单独突变或联合突变后 对细胞融合作用的影响～如果能够确定各糖基化位点对细胞融合作 用的影响～从而可以证实融合肽的位臵～然后进一步对融合位点进 行精确定位～阐明HV致细胞融合的分子机制具有重要的意义。 【参考文献】 ,1, Shi X, Elliott RM. 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