毛细管电泳多次进样法快速测定尿肌酐

毛细管电泳多次进样法快速测定尿肌酐 毛细管电泳多次进样法快速测定尿肌酐 第16卷第2期 1998年3月 . 色谱Vo1.6No. CHINESEJOURNALOFCHROMATOGR里呈!!!墨 毛细管电泳多次进样法快速测定尿肌酐 程明刚梁l/周克元凌光鑫 . 周克元凌光鑫 7[2牛6I| 提要采用毛细管电泳多次进样技术快速测定了尿肌酐.采用36cmX5O胛i.d涂层柱,0?lmmol/LpH2?5 的磷酸缓冲液,在200nm处检测.连续进样5个样品总分析时间为12min,比单次进样节省20min左右.日内, 日间变异系数均小于7.0H,用吡啶作内标,在肌酐浓度为5~80mg/L范围内,肌酐浓度与肌酐同毗啶的峰高 比值的线性关系很好(r=0.9996).测定12个样品同生化分析仪测定的结果相关性好(r=0.9773),且分析时 间节省 关键词 分类号 1前言 '术繇日屎 血清,尿肌酐浓度在临床上已作为评价肾功能 的有用指标,且在随意尿中评价如凝血和纤溶系统 标志物(纤维蛋白肽)A[1],肿瘤标志物(假尿嘧啶核 苷[妇)以及违禁药物筛查[3等均需肌酐参照.1886年 Jaffe建立了肌酐测定的苦味酸法已沿用至今,但 该法特异性差,许多内源性物质如蛋白质,尿酸,葡 萄糖等会产生干扰;酶法及反相色谱法测定肌 酐虽特异性及灵敏度高,但前者需要高纯度的酶,后 者分析时间长,消耗大. 毛细管电泳(capillaryelectr0ph0resis,CE)作 为一种新兴的分析技术,在Il缶床检验中的应用日益 引起重视,这不仅因为它高效,分析时间短,需样量 小,消耗低,全自动化,而且还因为它具有通用性,可 分离多种多样的化合物],如血清/尿中的蛋白质, 无机离子,氨基酸,药物及其代谢产物等.本文探讨 了CE检测尿肌酐的条件并建立了多次进样的方 法,大大节省了分析时间. 2实验部分 2.1仪器与试剂 配 美国Bio—RadBiofocusTM..型毛细管电泳仪,有二极管阵列检测器.用Bio—Rad5.0积分软件处 理数据.36cm×5Om丙烯酰胺涂层柱由中科院大 连化学物理研究所提供,安装在Bio.Rad公司的柱 组装卡内. 肌酐标准品购自Sigma公司,其它为国产分析 本文收稿日期:1997—01.14,修回日期:1997一O8.29 纯试剂.内标吡啶1mmol/L溶于20mmol/L(pH2. 5)的磷酸缓冲液,所有试剂均用三蒸水配制并经 0.45m的膜过滤. 2.2色谱条件 运行电压I6kV,200nm紫外检测,压力进样 34.5kPa?s,正极进样负极检测,样品室温及毛细管 柱温为25?,运行缓冲液为0.1mol/LpH2.5的磷 酸缓冲液. 2.3尿样测定 取新鲜尿2oL用三蒸水稀释25倍.从中取出 2oL加等体积的内标吡啶,离心后进行CE分析; 同时取出100t~L加等体积的水,用美国康宁公司 505型全自动生化分析仪(本院附属医院检验科, Jeffe氏反应法)测定. 2.4标准曲线 用倍比稀释法配制1O,160mg/L的肌酐标准 品,取出2OL加等体积的内标分析. 2.5多次进样技术 用3个操作程序进样,A:常规冲洗毛细管柱进 样,4kV运行lmin停止,B:无冲洗程序进样,4kV 运行lmin停止,c:无冲洗进样,16kV运行5min.5 次进样方法:程序A进样样品1一程序B进样样品 2一程序B进样样品3一程序B进样样品4一程序C 进样样品5.整个过程编好后均可自动进行. 3结果 3.1色谱结果 单次进样肌酐,吡啶,迁移时间分别约为4.18 16卷?150? 和2.98min.5次进样的图谱如图1所示. AU 0.002 AU 0.002 色 AU 0.002 闰15个样品5次进样分析闰 (丑.5个不同浓度尿标准品的图谱,b.5个不同浓度尿样闰谱,C.同一尿样连续进样5次的图谱) Fig.1MultipieinjectionanalysisoffivesampJesobtainedfrom 且.fivestandardswithdifferentconcentration,b.fivedifferenturines,C.thesmeurine 峰1,5为吡啶,峰6,1o为相应的肌酐,峰1和6代 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 第一次进样,峰2和7代表第二次进样,其余类推. Peaks1-5standforpyridine(theinternalstandard).peaks6-10standforcreatinine,peaks1an d6standforthefirstin一 ;ection,peaks2and7standforthesecondinjection,andSOon. 3.2标准曲线 用5次进样法分析5个不同浓度的标准品,在5 , 80mg/L的范围内肌酐浓度(y)与相应的肌酐同 内标的峰高比值(x)的线性关系为y=19.4X+ 0.8(r=0.9996). 3.3重复性实验 同一尿样连续进样5次的图谱见图1-c.5mg/ L,40mg/L的标准品连续进样5次,其峰高比的变 异系数分别为4.59oA,5.12,3.19.5个不同尿 样用5次进样法3天内共分析5次,肌酐与吡啶峰 高比的变异系数见表i. 表15个尿样的日问(=3)变异系数 Table1Thebetween-dayCV()ofthepeakheight r~iosofereatinineandpyridineinfiveurine 峰高比值Peakheightratio 一 尿t天第2nd天第2ndSample天第3.rd天气c,1st3rd' daydaydaydayday 12.923.053.073.052.853.26 23.553.553.223.293.454.43 31.031.031.O91.150.966.8O 43.213.273.163.213.022.98 52.412.492.482.522.274.11 3.4干扰实验 用单次进样法分析了正常人和DIC,恶性肿瘤, 大手术后病人原倍尿样,在9rain前出峰的物质除肌 酐外,其它峰均较低,且在稀释5O倍后分析无别的 杂峰.在本文条件下尿中存在的尿酸,尿素,肌酸等 不干扰测定.另外,用二极管阵列检测器作多波长扫 描也证实了尿中的肌酐峰. 3.5尿样测定 采用本法测定了1O个正常人尿样及2个标准 肌酐样品,同生化分析仪测定结果比较有好的相关 性:y=1.01X+2.99(r一0.9773). 4讨论 毛细管电泳存在进样偏差,尤以电迁移进样为 显着,我们采用压力进样并用内标校正来克服.在实 践中5次进样时吡啶,肌酐的峰高虽有差异(这可能 是由于进样偏差及尿样内组成成分的不同所导致的 "堆积效应.]的差异),但肌酐同吡啶的峰高比值的 重复性很好. 从理论上讲,连续进样技术的进样次数(N)有 一 限值.假定单次进样分析图中仅有两个峰,此时两 峰迁移时间的差值(fo)约为一定值.要确保多次进 样时相邻峰的分离度(尺s),则Rs至少为1,此时?仅 与相邻两峰的峰宽有关.根据Rs的表达式,在R.为 1时两峰峰宽之和为2倍的迁移时间之差(2?f),此 约为进样的时间间隔(确切地讲应是进样后电泳时 间和压力进样时使前次进样的待分离组分被动移动 的距离在实际电泳时所需的时间).根据相同条件下 待分离组分的迁移时间同电压之间的正比关系,很 程明刚等:毛细管电泳多次重室垦2期 容易通过降低电压来控制进样的时间间隔,从而控 制进样次数.本文在程序A和B的运行电压降为 2kV时可连续进样9次仍不损失分离度(见图2). 圉29次进样圉 Fig.2Chromatogramofnineinjections 本文采用CE连续进样技术可大大缩短分析时 间(12个样品总分析时间约为30rain,而生化分析仪 约需60min),方法可靠,为临床肌酐测试提供了一 种简便,低消耗(仅耗几微升的缓冲液),全自动的途 径. 致谢感谢附院检验科生化室协助用生化分析仪测 定尿肌酐. 参考文献 1刘莉,宋善俊,魏文宁等.临床血液杂志,1996,9:5, 7 2GehrkeCW,KuoKC,WaalkesTPeta1.Cancer Res,1979,39:1150-1153 3SimpsonD.JarvieDR,MooreFMLeta1.Clin Chem,1993,39:698—699 4JeffeM.ZPhysiolChem,1886.10:391-395 5FossatiP.PrencipeL.Fermoleta1.ClinChem, 1983,29:1494—1496 6ParoniR,ArcelloniC,Fermoleta1.ClinChem, 1990,36:830—836 7LandersJP.ClinChem,1995,41(4):495—509 8VitherA,SebergH.JChromatogr,1991,559:3-26 RapidDeterminationofCreatinineinUrinebyCapillary ElectrophoresisinaMultipleInjectionMode ChengMinggang,LiangTong,ZhouKeyuanandLingGuangxin (DepartmentofBiochemistry,GuangdongMedicalCollege,Zhanjiang,524023) AbstractThelevelofurinarycreatinineinclinicdiagnosisisoneoftheusefulindexofrenalfunction,andis oftenusedasareferenceofsomebiochemicalsubstancedeterminedinrandomurine.Inthispaper,arapid multiple— injectioncapillaryelectr0ph0resis(CE)methodforthedeterminationofurinarycreatinineisreport. ed.A36cm×50mcoatedcapillary,aphosphoricacidbuffer(0.1mol/L,pH2.5)andUV— detectorat200nm wavelengthwereusedinthismethod.Incomparingwithsingleinjectionforfivesamples,theanalysistimeof fivesuccessiveinjectionscansave20rain.Byuseofpyridineasinternalstandard,thecorrelationbetweenthe concentrationsofcreatinineandthecorrespondingpeakheightratiosofcreatinineandpyridineisgood(r一 0?9996),andtheassayprecisionisacceptable.WealsocomparedtheCEmethodwiththebio—analyser(Jef. fekinetic),andtheresultsshowedasatisfactorycorrelation(r一 0.9773.,2:12)andashorteranalysis time. Keywordscapillaryelectrophoresis,creatinine,urine,multipleinjection