细胞复苏及存活率测定
细胞工程实验报告
实验课程:细胞工程
实验内容:细胞复苏及存活率测定
一 实验目的
1、掌握细胞快速复苏的原理，学习冻存细胞快速复苏的实验方法。 2、掌握染料排除法鉴定细胞死活的原理。
3、学习用血球计数板进行细胞计数测定细胞的存活率的方法。 二 实验原理
在显微镜下从形态上很难区分死、活细胞。但是，死细胞可被某些染料如台盼蓝、伊红和苯胺黑等染上相应的颜色，而活细胞则不会被染色。因此，可根据细胞是否被染料着色来区分细胞的死活。 血球计数板:
血球计数板是一块上面刻有“H”型凹槽的特制的厚玻璃板。H
型凹槽在玻璃板中间围成上下两个平台，而且中间这两个平台比
两侧平台要低0.1 mm。
计数室:
每一大方格面积为1 mm×1 mm，由于有0.1mm的凹度空隙，因此盖上盖玻片后容积为0.1 mm3，(0.1ul)
三、主要仪器试剂
设备:血球计数板、滴管、试管、倒置显微镜、超净工作台、改良吸管、加样器、培养瓶(玻璃、塑料)、二氧化碳培养箱、恒温水浴锅、
离心管等。
试剂: MEM+10%小牛血清液、胰蛋白酶、PE液、0.4%台盼蓝等。
四 实验步骤
(复苏)
, 从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速放入36,37?恒温水浴中，
不时轻轻摇动，使其在40,60秒内尽快解冻。
, 用75%酒精擦拭消毒细胞冻存管，在超净工作台上打开盖，将
细胞悬液倒入培养瓶中，快速加3ml MEM血清培养液，摇匀
后静置，? 30min后在显微镜下检查贴壁情况? 大部分细胞
贴壁后，从侧面轻轻吸出培养液2ml MEM血清培养液置培养
箱中培养? 从侧面加入新培养液，培养，一周后观察。 (细胞死活鉴定及计数)
, 用95%酒精冲洗血球计数板及盖玻片，用电吹风吹干。把盖玻
片覆在计数板上面，露出计数板台面少许，以便滴加细胞悬液。
, 取吸管一支，伸入培养瓶中，吸取细胞悬液向一小试管中滴入
6滴，再滴入0.4%台盼蓝3滴，混匀，染色2-3分钟。
, 如果细胞悬液含细胞过多，可先用MEM培养液稀释，稀释倍
数视情况而定，然后再进行染色。
, 向计数板边缘处轻轻滴加1-2滴已染色的细胞悬液，使之充满
计数板和盖玻片间的空隙。
, 显微镜下观察和计数。
活细胞不着色，死细胞被染上蓝色。
, 分别统计角上的4个大方格内的活细胞和死细胞数，两个平台
共8个大方格。
五 实验结果
计算公式:
活(死)细胞数(个/ml)=
8个大方格中的活(或死)细胞总数/8 ，10*4，稀释倍数 细胞存活率(%)=(活细胞数/细胞总数)，%
通过观察统计:
活细胞:27个
死细胞:10个
活细胞(个/ml)=27/8*10^4*6=2*10^5(个/ml)
细胞存活率=(27/37)*100%=72.97%
六 思考
题
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绘图并说明复苏培养细胞的成活情况及形状。
, 复苏后细胞生长状态良好，透明度大;细胞内颗粒少，没有
空泡,细胞形态完整。
, 过一段时间后细胞已呈现一层，无悬浮状态，多数细胞处于
开始贴壁状态，但是细胞形状未发生明显变化。等到细胞完
全贴壁时，细胞会呈现扁平或梭型或多边形，透明度较好。 细胞成活情况:
从显微观察到的图片上看到细胞整体状态良好。大概有20%的细
胞发生不同程度的破损，细胞质流出，使得细胞变成碎片;其中没有
破碎的细胞透明度下降，形态不规则。具体的成活情况可以通过细胞
计数板更精确的测定。
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