卵胞浆内单精子注射后人精子激活鼠卵母细胞能力的研究.doc
卵胞浆内单精子注射后人精子激活鼠卵母细胞能力的研究
-->[摘 要] 目的:研究各种质量精子的鼠卵母细胞激活能力。方法:选用20~25 g昆明种雌性白鼠,超排卵取卵细胞,用Percoll密度梯度离心法处理正常精液、少精、弱精、畸精以及冷冻后的正常精液,选择优质的精子进行显微注射,计算卵母细胞激活率、卵细胞形态正常率。结果:各种质量精液中优选的精子激活鼠卵母细胞能力差异无显著性(P>0.05)。结论:人精子激活鼠卵母细胞能力与最初精液状态没有直接的相关性,它不受精子数量、活力、运动性及形态的影响。
卵胞浆内单精子注射(intracytoplasmic injec-tion,ICSI)技术是目前世界范围内广泛开展的治疗男性不育症的显微受精技术。据报道,ICSI后卵细胞平均受精率为65%~70%,尚有大约1/3的卵子未能受精[1]。研究表明,精子激活卵细胞相关因子(sperm-born oocyte-activating
factor, SOAF)对卵细胞的激活作用在ICSI技术中起着关键的作用[2]。本文依据人精子激活鼠卵母细胞理论,在本室建立的人精子注入小鼠卵母细胞模型基础上[3],对各种质量精子激活鼠卵母细胞能力进行研究,为ICSI前对精子能否激活卵母细胞进行筛选技术奠定实验基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物 本校动物中心提供的饲养于人工昼夜周期的昆明种雌性白鼠,体重20~25 g,喂以含微量元素
标准
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饲料,自由摄水,分笼饲养。 1.2 试 剂 小牛血清、孕马血清(PMSG)、人类绒毛膜促性腺激素(hCG)、M199粉由北京百灵克生物科技有限责任公司提供,聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、10Earle′s溶液、透明质酸酶(Boviype V)、Percoll、Milli-Q水由Sigma公司提供。
1.3 仪 器 倒置相差显微镜(MM188),解剖镜和倒置镜(日本Nikon),恒温孵箱TC2323、恒温平台(美国Shel.LAB),显微注射仪、EG-400微型磨针仪、PN-30显拉针仪、MF-900微型锻针仪(日本NARISHGE Co.Led.Group)。
1.4 样品采集和处理 雌性小鼠超排卵及采卵法见参文[4]。取出卵细胞后置孵箱中培养2 h,用100 IU•ml-1透明质酸酶的HBE液处理1 min,培养液冲洗2次,置培养箱中培养备用。人精优选和处理:精液标本于本研究室不孕症门诊,患者禁欲3~5 d,手淫法无菌取精,液化后,按u;m,针尖斜面为30°,针尖弯度25~35°。固定针内径为15~20μm,外径60μm,针尖斜面30°,针尖弯度25~35°。显微操作准备及操作过程见参文[5]。
1.6 实验设计与分组 按es;106个•ml-1, a级精子>25%或者前向
运动精子>50%(a级和b级),形态异常率2 结 果
2.1 操作过程对卵母细胞激活能力的影响 ?实验对照组、空白对照组卵母细胞激活率远远低于实验组(P0.05),其中正常组较其他4组略高,畸型精症组卵细胞激活率最低,结果见表2。
卵细胞第二极体的排出在注射后2 h左右,提示卵细胞已经被激活。本研究结果中大部分激活卵细胞没有原核形成,可能卵细胞被激活排出极体后,发育停滞。
3 讨 论
精子能否激活卵细胞是ICSI技术成功的关键。研究表明,SOAF是启动卵母细胞激活的关键因素。SOAF包含一个或更多精子头膜下的热敏感蛋白质成分和至少一个热稳定的核周基质中成分,它们共同作用激活卵细胞,无种属特异性[2]。资料显示SOAF的不表达能引起ICSI的失败。目前临床上还没有一种直接检测SOAF方法,也没有建立一种检测精子激活卵细胞能力的实验。有人曾用金黄地鼠卵和蛙卵进行研究,但易受操作程序的影响,人卵又不易获得。本研究室依据人精子激活鼠卵母细胞理论[3]已建立了检测人精子激活能力的模型[4]。本研究就是在此模型基础上将各种质量精液的精子注入鼠卵母细胞中,观察卵细胞的激活情况,以检测人精子激活卵母细胞的能力。本实验结果显示,少精、弱精、畸形精症以及冷冻精组精子优选后的卵母细胞激活率与正常组比较均有不同程度的降低,但差异无显著性,说明可能在最初的精液检查中精子的密度、形态及活力对卵母细胞激活率影响不是很大。Percoll较其他方法能够回收更多的形态正常的精子,并明显增加精子的活力和体外生存能力。本研究应用Percoll法对各种质量的精液进行处理,选择优质精子进行ICSI注射,这可能也是各组之间差异无显著性的原因。实验结果显示,少精、弱精、畸形精症以及冷冻精组激活率与正常精液组比较差异无显著性,但有降低趋势,提示精子激活卵母细胞的能力也受到影响,这是否表明精子中存在SOAF缺乏,还有待进一步研究。精子生成基因位于Y染色体长臂,由多个基因位点组成。AZF缺乏或突变能导致精子数目减少或缺乏[6]。SOAF的基因调控目前还不清楚。本结果提示,精液中精子数量减少与SOAF之间没有直接的相关性。少精症中的正常精子依然具有激活卵母细胞的能力。临床资料表明,弱精症中弱精子行ICSI卵细胞激活能力降低,并推测与SOAF缺乏有关[7]。
-->本实验对精液进行优选后,行显微注射,发现激活能力没有受到明显影响,提示弱精症中SOAF的缺乏可能只存在于弱精子,而形态正常、活动力好的精子仍具有正常的功能。研究结果表明将弱精症中活力差的精子放入正常精浆中,精子运动能力提高,这一作用可能是精
浆中金属离子和小分子发挥作用,也表明弱精症中很多是由非遗传因素造成的,这样的精子经洗涤去除精浆,其功能不会受到影响[8]。形态异常精子具有遗传学缺陷,用畸形精子注入卵母细胞,受精率明显降低,这可能与SOAF功能的降低有关。本研究结果提示畸形精症中的优选精子能够激活卵细胞,可以进行显微注射。正常精液冷冻组的卵细胞激活率低于正常组,但差异无显著性。徐惠明报道[9],冷冻后精子活动率显著低于冷冻前,但对冷冻精子行ICSI后激活卵细胞能力影响不是很大,这与本研究结果一致。精子在冷冻过程中,顶体及线粒体易受到损伤,使得冷冻后精子顶体反应及精卵融合能力降低。ICSI技术中,顶体反应不是必要条件,主要是位于精子膜下和核周基质中的SOAF发挥作用,由此可见,冷冻程序对SOAF的影响不是很大。人精子激活鼠卵母细胞能力与最初精液质量检查没有直接的相关性,它不受精子数量、活力、形态的影响,但质量较差的精子激活能力有不同程度降低,因此为患者行ICSI注射时,尽量选择精液中质量较好的精子,能明显提高ICSI技术的成功率。
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