大蹼铃蟾皮肤分泌液中抗菌活性肽的分离纯化及其性质

大蹼铃蟾皮肤分泌液中抗菌活性肽的分离纯化及其性质 CN53 - 1040/ Q ISSN 0254 - 5853 动 物 学 研 究 1998 , 19( 4) :257,262 Zoological Research 大蹼铃蟾皮肤分泌液中抗菌活性肽的 3 分离纯化及其性质 ? 赖 仞 叶文娟 冉永禄吕顺清 杨大同 ( )中国科学院昆明动物研究所 昆明 650223 ( 摘 要 通过 Sep hadex G - 75 、G - 50 和 G - 25 洗脱等步骤 ,从云南产大蹼铃蟾 B om bi na ) m ax i m a皮肤分泌液中分离得到了一种有广泛抗菌活性的多肽 ,被命名为 MSP - ?。用快原子 () 轰击质谱f . a. b. m. s分析其 M + / Z = 2648 ,即此活性肽的分子量为 2647 D 。用自动氨基酸 分析仪分析 ,含有 26 个氨基酸 。抗菌实验结果表明 ,此多肽对格兰氏阴性和格兰氏阳性细菌以 及真菌都有较强的抗菌活性 。溶血实验表明此活性肽有很轻微的溶血活性 。此外 , MSP - ?也 可以促进平滑肌收缩和增加微血管的渗透性 。 关键词 大蹼铃蟾 ,抗菌皮肤肽 ,分离纯化 ,性质 中图分类号 Q959 . 53 () 两栖类尤其是无尾两栖类皮肤裸露 ,在长期的自然选择过程中 ,为抵御有害环境因子 的侵袭逐渐形成了一系列保护机制。其中 ,在它们的皮肤分泌液中含有大量的杀灭微生物、 防御天敌的生物胺与活性多肽。其皮肤中生物胺与活性多肽的含量之高是哺乳动物无可比 () 拟的 ,因而被称为生物胺与活性多肽的巨大储存库。自 Anastasi 等 1971首次从欧洲铃蟾 ( ) () Bom bi na bom bi na皮肤中提取出 一种 14 肽 称之为铃蟾肽 , bombesin以来 ,已从世界上 ( ) 600 多种两栖类皮肤中提取出 100 多种活性肽。例如 , 产婆蟾肽 alytesin、细趾蛙肽 () () ( ) ( ) litorin、雨蛙肽caerulin、爪蛙肽xenopsin等Charles ,1990。两栖类皮肤活性肽具有广泛 ( 的生理和药理活性 , 按其活性特点 可 分 为 : 速 激 样 多 肽 p hysalaemin - like peptides or ) ( ) (tachkinin、舒缓激肽样多肽 bradykinin - like peptides、雨蛙肽样多肽 caerulein - like pep2 () ( ) tides、铃蟾样肽bombesin - like peptides以及蛙啡肽类等 14 类多肽家族 Roseg - hini ,1988 , ) ( 1989。对两栖类皮肤活性多肽的研究主要集中于美洲、澳洲、非洲和欧洲Roseghini ,1988 , ) 1989。许多两栖类皮肤活性肽具有广泛的抗菌活性。 ( ) 全世界已知的铃蟾共有 7 种 ,其中大蹼铃蟾 B om bi n a m a x i m a 主要分布于中国西 南部地区 ,云南山区种群数量很大 。其皮肤腺发达 ,受到刺激时便大量分泌含活性物质的 皮肤粘液 。对大蹼铃蟾皮肤分泌物中活性成分的分离与生理生化性质的研究工作 ,国内 外尚未见报道 。本文报道了云南产大蹼铃蟾皮肤分泌液中抗菌活性肽的分离纯化和性 质 。 * 云南省应用基础研究基金资助项目 ?通讯联系人 1 材料和方法 1 . 1 材 料 实验用大蹼铃蟾从云南野外采集并于室内饲养 ; 实验用昆明系小白鼠购自本所实验 动物养殖中心 。Sep hadex G - 25 、G - 50 、G - 75 为瑞典 Phamacia 产品 ; T EM ED 、丙烯酰 β胺 、- 巯基乙醇 、考马斯亮兰 R - 250 为瑞士 Fluka 产品 ; 其他试剂为国产分析纯 。质谱 仪为 Auto spec - 3000 ,氨基酸自动分析仪为 H I TACH I 835 - 50 。 ( ) ( 抗菌实验菌株为 : 枯草杆菌 B aci l l us s ubt i l is 、金黄色葡萄球菌 S t a p hylococcus ) ( ) ( ) a u neus、大肠杆菌 Esche richi a col i 、绿脓杆菌 Pseu dom on as ae r u gi nosa、巨大芽孢杆菌 ( ) ( ) ( B aci l l us m egate ri u m 、白色念珠菌 Ca n di d a al bica ns 、肺炎球菌 Klebsiel l a p neu m oni 2 ) ( ) ( ) ( ) ae、冻土元霉 M ucor l ie m al is、微小毛霉 M ucor p usi l l us 、青霉 Penici l l i u m sp . 、黄曲 ( ( ) ) 霉 A s pe rgi l l us f l av us sp . 、啤酒酵母 S acha rom yces ce re rv isi ae等 。 1 . 2 方 法 ( ) 1 . 2 . 1 M SP - ?的提取分离 参照 Anastasi 等 1971的方法并作了重大改进 。采用刺 激的方法从活体蟾蜍获得皮肤分泌液 ,过滤以除去不溶物 ,冻干保存 。Sep hadex G - 25 、 G - 50 、G - 75 用蒸馏水溶胀 ,经碱处理并用 0 . 5 %的甲醇溶液浸泡 2 h 。首先 ,分泌液冻 () 干粉以 0 . 5 %的甲醇溶液作为洗脱液 ,用 Sep hadex G - 75 层析柱 2 cm ×120 cm分离 ,用 L KB 自动部分收集器收集 ,流速为 1 滴/ 4 s , 每 10 min 1 管 ,在 280 nm 测定紫外吸收值 , () 收集小分子洗脱峰 ?。Sep hadex G - 25 , G - 50 分别装入层析柱 2 cm ×120 cm,然后将 两根柱连接起来 ,并注意使两柱接头处保持最小的柱外体积 ,以 0 . 5 %的甲醇溶液平衡 。 取 Sep hadex G - 75 峰 ?成分上柱 ,以 0 . 5 %的甲醇溶液洗脱 ,用 L KB 自动部分收集器进 行收集 ,流速为 1 滴/ 4 s ,每 10 min 一管 ,在 280 nm 测定紫外吸收值 ,收集第 ?洗脱峰 。 ( ) μ1 . 2 . 2 纯度 、分子量测定 用高效液相色谱 HPL C进行纯度测定 ,注射 100 L M SP ? ( ) 的蒸馏水溶液 浓度为 0 . 3 mg/ mL 于 Nava - Pak C18 反相柱 ,按下列方式进行梯度洗 () (脱 。A 流动相 0 . 1 %三氟乙酸水溶液,B 流动相 0 . 1 %三氟乙酸水溶液与 80 %乙晴水溶 ) 液等体积混合 ,梯度洗脱,220 nm 监测紫外吸收值 。分子量测定采用快原子轰击质谱法 ) ( ) (f ast ato m bo mbardment mass spect ro met ry ,f . a . b. m. sMaria ,1987。以甘油?间硝 () μ基苄醇?二甲亚砜 1?1?1 ,v?v?v为底物 ,以 Cs + 作为轰击粒子 ,电流为 1 A ,发射电压 25 kV 。 1 . 2 . 3 氨基酸组成测定 取一定量的样品经盐酸水解后 ,用 H I TACH I 835 - 50 氨基酸 自动分析仪测定氨基酸组成 。 () 1 . 2 . 4 溶血活性检测 用氰高铁血红蛋白法 上海医学化验所 ,1979测定溶血活性 。 () 1 . 2 . 5 平滑肌收缩活性的检测 采用离体兔主动脉条实验法 徐叔云 ,1985。 () 1 . 2 . 6 对微血管通透性的影响 采用伊文氏蓝染料法 田牛 ,1987。取伊文氏蓝染料和 甲酰胺配成不同浓度的溶液制作标准曲线 。伊文氏蓝染料和生理盐水配成 1 . 5 %溶液 , () ( 小白鼠 对照组和给药组各 5 只尾静脉注入伊文氏蓝溶液 0 . 1 mL / 只 给药组的伊文氏 ) 蓝溶液中含有 1 mg/ mL 的 M SP - ?,注药后 2 . 5 h 将动物处死 ,取大脑 、小脑 、肝脏 、小 肠 、肺分别称量 。然后将组织分别放入已加入 5 mL 甲酰胺溶液的试管中 ,在 54 ?恒温水 浴锅内保持 24 h ,让组织中的伊文氏蓝溶解在甲酰胺溶液中 ,将甲酰胺溶液过滤后用分光 光度计于 620 nm 处测定吸光度 。按标准曲线确定伊文氏蓝的浓度 ,最后以每克组织中 所含染料的微克数表示 。 ( ( ) 1 . 2 . 7 抗菌活性检测 采用杯碟法 徐叔云 ,1985。真菌培养基为改良沙保氏 Sabo u2 ) sand培养基 ,细菌培养基为普通琼脂培养基 。分别注入加热融化的培养基 20 mL 于平皿 中作为底层 ,使其在皿底内均匀摊布 ,凝固后 ,另取培养基适量加热融化后 ,分别在每皿中 加入 5 mL 菌悬液 ,摇匀 ,使其在底层上均匀摊布 ,作为菌层 。冷却后 ,在平皿中等距离均 匀放入已消毒的不锈钢杯 6 个 。第 1 个钢杯加入 0 . 3 mg/ mL 浓度的 M SP - ?溶液 0 . 1 mL ,其余钢杯采用二倍稀释法加入样品液 ,37 ?培养 ,观察抑菌圈大小 。抑菌圈 10 mm ( ) 以上的作为最小抑菌浓度 minimal inhibito ry co ncent ratio n ,M IC。 2 结果与讨论 2 . 1 大蹼铃蟾皮肤分泌液的分离纯化 层析图谱见图 1 和图 2 。收集图 1 中的峰 ?,冻干 ,再经 G - 25 + G - 50 层析而获得 图 2 的层析图谱 。图 2 中峰 ?被命名为 M SP - ?。 图 1 Sep hadex G - 75 凝胶过滤图 2 Sep hadex G - 25 + G - 50 凝胶过滤 Fig. 1 Gel filt ration on sep hadex G - 75 Fig. 2 Gel filt ration on sep hadex G - 25 + G - 50 2 . 2 M SP - ?的纯度 、分子量和氨基酸组成测定 由图 3 M SP - ?的反相 HPL C 层析图谱可以看出 , M SP - ?在 11 . 308 min 出峰 ,其 洗脱模型基本呈单一对称峰 。用快原子轰击质谱法测定 m + / z = 2648 ,即分子量为 2647 D 。其氨基酸组成结果见表 1 。 2 . 3 溶血活性检测 M SP - ?的溶血活性检测 ,每组实验重复 3 次 ,取平均值 ,结果见表 2 。由结果可以 看出 ,M SP - ?有一定的溶血活性 ,但并不是很强 。 2 . 4 M SP - ?对兔主动脉平滑肌收缩的影响 结果见图 4 。从图 4 可以看出 ,M SP - ?促进兔主动脉平滑肌的收缩 。 2 . 5 M SP - ?对微血管通透性的影响 每组实验进行 5 次 ,取平均值 ,结果见表 3 。由结果可以看出 , M SP - ?对肺组织的 影响最大 ,其次是小肠和肝 ,而大脑和小脑的影响较小 。 2 . 6 M SP - ?的抗菌活性检测 每个平板的第 1 个钢杯加入 0 . 3 mg/ mL 浓度的 M SP - ?溶液 0 . 1 mL ,其余钢杯采 用二倍稀释法加入样品液 ,每组实验进行 3 次 ,结果见表 4 。M SP - ?对格兰氏阴性 ,格 图 3 MSP - ?的反相 HPL C 层析图谱 Fig. 3 RP - HPL C chromato grap hy of MSP - ? 表 1 MSP - ?的氨基酸组成和分子量4MSP - ?的抗菌活性检测表 Anti - microbial activity of MSP - ? Table 1 Amino acid composition and Table 4 molecular weight of MSP - ? aga inst various bacteria and f ungi - 1 μ M IC/g?mL 氨基酸残基数 微生物 粗样品MSP - ?Asx 2 枯草杆菌75 18 . 75 Glx 4 金黄色葡萄糖球菌 75 18 . 75 Gly 6 大肠杆菌 150 18 . 75 Ala 2 绿脓杆菌 巨75 37 . 5 Val 2 大芽孢杆菌 150 37 . 5 Ile 白色念珠菌 2 > 300 150 肺炎球菌 冻4 L eu 150 18 . 75 土毛霉 微小L ys 4 毛霉 > 300 75 Trp 未测青霉 黄> 300 75 26 总残基数曲霉 啤300 75 氨基酸分析分子量 2630 ?3酒酵母 > 300 150 质谱分析 M + / Z 2648 150 37 . 5 注 : Asx 和 Glx 可能是 Asn 或 Asp 和 Gln 或 Glu( ) Asx and Glxmay be Asn o r Asp and Gln o r Gln。 MSP - 表 3?对微血管通透性的影响 Table 3 The eff ect of MSP - ? on permeabil ity 表 2 MSP - ?的溶血活性 Table 2 Hemolytic activity of MSP - ? of micro - vessels - 1 μ( ) 单位组织的染料渗出量/g?g 组织 红细胞溶解百分数/ % - 1组织μ 浓度/g?mL 对照 MSP - ? 粗样品 MSP - ? 大脑1 . 75 ?0 . 05?0 . 042 . 31 0 . 0 0 . 00 0 . 00 小脑 1 . 15 ?0 . 032 . 32 ?0 . 06 0 . 2 ?0 . 02?0 . 030 . 11 1 . 50 肝 1 . 34 ?0 . 032 . 87 ?0 . 07 1 . 0 0 . 27 2 . 70 ?0 . 01?0 . 04小肠 2 . 53 ?0 . 016 . 18 ?0 . 05 10 . 0 1 . 31 ?0 . 025 . 71 ?0 . 05肺 4 . 51 ?0 . 0610 . 41 ?0 . 06 100 . 0 2 . 42 ?0 . 02 7 . 27 ?0 . 03 从以上的一些实验结果得知 ,M SP - ?这类从大蹼铃蟾皮肤分泌液中分离出的小分子多肽具有较多和较强的生理和药理活性 ,尤其是对微血管通透性的影响和它的抗生作 用特别显著 。M SP - ?无论是对格兰氏阴性 、格兰氏阳性细菌 、真菌以及酵母菌都有较强 的抗菌活性 。国外对于两栖类皮肤抗菌活性肽有较多的研究 ,目前为止已从两栖类的皮 肤中获得 30 多种抗菌活性肽 。Andreu 等 () 1985对两栖类的皮肤抗菌肽的研究表 明 ,大多数的两栖类皮肤抗菌肽有形成双 α亲- 螺旋的倾向 , 且它们基本上都是碱 性多肽 ,易于与酸性的生物膜脂双分子层 相结合 。两栖类皮肤抗菌活性肽的这些结 构特点 ,使之容易形成跨膜通道 ,介导一系 ( ) 列的生物效应 。Hans 等 1989 的研究表 明 ,两栖类皮肤活性肽的抗菌活性主要是 α由于其依靠双亲- 螺旋的结构特点形成 图 4MSP - ?的兔主动脉平滑肌收缩活性检测 Fig. 4 The effect of MSP - ?on t he 跨膜的离子通道 ,使微生物不能形成跨膜 aorta smoot h muscle 电势差 ,造成氧化磷酸化去偶联 。M SP - ?() ?为加 MSP - ?administering MSP - ?。通过碱性电泳检测 ,也显示出较强的碱 性 ,此皮肤肽也可能是一个碱性肽,且其氨 (αα) α 基酸组成的- 螺旋倾向参数 - helix p ropensities parameter , P的平均值大于 1 。从 αM SP - ?的这些结构特点 ,可以推测它也可能形成双亲- 螺旋的跨膜离子通道 ,从而影 响微生物的代谢和生长 。有关 M SP - ?的结构和功能方面的进一步研究还在继续进行 。 致谢 对中国科学院昆明动物研究所李朝翠 、刘万兆 、饶定齐老师在兔主动脉平滑肌收缩活性检测实验和取材等方面的帮助; 孟庆雄 、吕秋敏同志在试验过程中的帮助; 中国 科学院昆明植物研究所梁慧玲老师在质谱测定和解谱过程中的大力帮助; 云南大学微生 物研究所田永强和廖昌珑同志在抗菌活性检测实验中的大力支持, 谨致谢忱 。 参 考 文 献 上海市医学化验所 ,1979 . 临床生化检验. 上海 :上海科学技术出版社. 121 .田 牛 ,1987 . 微循环方法学. 北京 :原子能出版社. 37 . 徐叔云 ,1985 . 药理实验方法学. 北京 :人民卫生出版社. 561 ,1063 . 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A NTI - M ICROBIAL PEPTID E FROM THE S KI N SECRETIO N OF B ombi n a ma xi ma L A I Ren YE Wen - juan RAN Yo ng - lu L U Shun - qi ng YAN G Da - to ng ( )Ku n m i n g I nst i t ute of Zoology , t he Chi nese A ca de m y of S ciences , Ku n m i n g 650223 Abstract An anti - micro bial pep tide named M SP - ?,was isolated f ro m t he skin secretio n of t hetoad , B om bi n a m a x i m a , dist ributed in Yunnan Province of China , by a t hree step p rotocol including Sep hadex G - 75 and G - 50 co nnected wit h G - 25 t wo step s of t he gel filt ratio n and o ne reverse - p hase high - perfo r mance liquid chro matograp hy. Fast ato m bo mbardment mass - spect ro scop y of M SP - ?gave a p roto nated molecular io n m/ z 2648 w hich matched t he t heo retical molecular weight p redicted f ro m t he co mpo sitio n of amino acids. It co nsist s of t went y - six amino acid residues deter mined by auto matic amino acid analyzer . M SP - ?is a water - soluble pep tide . M SP - ?has a st ro ng anti - micro bial activity to bacteria ,f ungi and yeast wit h a lit tle hemolysis activit y. These characterizatio ns of M SP - ?make it po ssible to be used as a clinical anti - micro bial medicine . We tested it s effect o n micro - vessel o smo sis abilit y wit h Evens blue dye . It was fo und t hat M SP - ?made t he per meabilit y of so me tis2 sues such as lung ,liver ,small intestine ,to Evens blue dye increase . In particular ,t his pep tide o bvio usly increased per meabilit y of lung. In additio n , M SP - ? displayed an effect o n t he co nt ractio n of smoot h muscle , w hich st rengt hened t he co nt ractio n ability of rabbit ao rta smoot h muscle . Key words B om bi n a m a x i m a ,Anti - micro bial skin pep tide , Purificatio n , Characteriza2 tio n