葫芦藓人工培养条件的筛选与优化

葫芦藓人工培养条件的筛选与优化 滨州学院 毕业设计(论文) 题 目 葫芦藓人工培养条件的筛选与优化 系 (院) 生命科学系 专 业 生物科学 班 级 2005级3班 学生姓名 胡美丽 学 号 2005120420 指导教师 刘俊华 职 称 讲师 二〇〇九年 月 日 独 创 声 明 本人郑重声明:所呈交的毕业设计(论文)，是本人在指导老师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，成果不存在知识产权争议。尽我所知，除文中已经注明引用的内容外，本设计(论文)不含任何其他个人或集体已经发 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律后果由本人承担。 作者签名: 二〇〇 年 月 日 毕业设计(论文)使用授权声明 本人完全了解滨州学院关于收集、保存、使用毕业设计(论文)的规定。 本人愿意按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版，同意学校保存学位论文的印刷本和电子版，或采用影印、数字化或其它复制手段保存设计(论文);同意学校在不以营利为目的的前提下，建立目录检索与阅览服务系统，公布设计(论文)的部分或全部内容，允许他人依法合理使用。 (保密论文在解密后遵守此规定) 作者签名: 二〇〇 年 月 日 滨州学院本科毕业论文 葫芦藓人工培养条件的筛选与优化 摘 要 葫芦藓是常见的苔藓植物，属于苔藓植物门藓纲葫芦藓科葫芦藓属。对葫芦藓的组织培养条件多有研究，本文用常见的三种培养基(Konp培养基、Benecke培养基、MS培养基)来培养葫芦藓，先初步筛选出最适培养基为MS培养基。接着作者又用MS培养基培养葫芦藓配子体，并设计了四个pH梯度分别为:5.0、5.5、6.0、6.5，结果表明:当pH值为5.5时葫芦藓配子体的生长状况最好。 关键词:葫芦藓;培养条件;pH梯度 I 滨州学院本科毕业论文 Tissue culture conditions Funariaceae screening and optimizating Abstract Funariaceae which is a common Bryophytes,belonged to bryophytes doors ,Musci Funariaceae Hedw gourd. Resently there are more researches on conditions of tissue culture on Funariaceae.The research in this paper based on three common medium (Konp medium, Benecke medium, MS medium), The result suggest that the MS medium is the best medium. Then again the author use the MS medium to groom the gametophyte Funariaceae And in this resarch the author designed four PH gradient as follows: 5.0,5.5,6.0,6.5, results showed that: When the PH value of 5.5 the gametophyte Funariaceae appears the best growth state. Key words: Funariaceae;Culture conditions;pH gradient II 滨州学院本科毕业论文 目 录 引言 ............................................................. 1 第一章 葫芦藓培养基的初步筛选 ................................... 4 1.1实验材料的采集 ................................................ 4 1.2 需仪器 ....................................................... 4 1.3实验方法 ...................................................... 4 1.3.1培养基的制备 .............................................. 5 1.3.2 培养基、培养皿的灭菌 ..................................... 6 1.3.3 接种 ..................................................... 6 1.3.4 观察结果 ................................................. 7 1(4讨论 ......................................................... 8 第二章 葫芦藓培养条件的优化 ..................................... 9 2.1 实验设计 ..................................................... 9 2.2 研究材料及方法 ............................................... 9 2.2.1 实验材料的采集 ........................................... 9 2.2.2 实验方法 ................................................ 10 2.3讨论 ......................................................... 11 第三章 研究意义 ............... 错误～未定义书签。错误～未定义书签。 3.1 苔藓的生态意义 ............................................... 1 3.2 苔藓植物的抑菌抗菌作用 .... 错误～未定义书签。错误～未定义书签。 3.3 苔藓有药用价值 ............................................... 1 3.4 可作为实验材料 ............................................... 2 3.5 园艺方面的应用 ............................................... 2 结论 .......................................................... 11 参考文献: .................................................... 12 谢辞 .......................................................... 13 i 滨州学院本科毕业论文 引 言 葫芦藓是常见的苔藓植物，它属于苔藓植物门藓纲葫芦藓科葫芦藓属，植株体矮小，在世界各地均有分布，常生长在阴暗潮湿之地。葫芦藓在各个方面都有重要意义。 1 葫芦藓的生态意义 葫芦藓植物不仅为其他生物营造出各种各样的生境，而且对维持生态系统的平 [1]衡起着重要作用。由于结构的简单，在对环境的适应性方面葫芦藓植物显得尤为脆弱。我国以及有些国家已经对葫芦藓植物采取了保护措施。葫芦藓的形态结构特殊，但其生境基质却有多样性，具有特殊的生态生理机制适应其多变的环境条件。 葫芦藓植物具有强大的储水能力。它们在植被类型的指示和演替、水土保持以 [2]及防止水土流失方面起着十分重要的作用。曹同等(1994)测定了长白山森林系统中苔藓植物储水量并研究了苔藓植物在水循环中的作用。 [3]葫芦藓植物被认为是理想的环境污染的指示植物之一。因为葫芦藓的叶片是由单层细胞构成，表皮缺乏角质层，对环境因子的变化敏感，能迅速对环境的改变作出反应。在我国很多城市已经使用藓袋对大气环境进行生态监测， 与别的高等植物比较起来，具有吸附力强，取材简单，成本低，监测范围广，监测点灵活等优点。 作为环境演替中的先锋植物，葫芦藓植物体型微小，有适宜的生态位，常集群 [4]生长成毡垫状，参与土壤结皮的形成，形成保护层以减缓地表径流，防止风蚀和水土流失，为其他植物的生长创造基部条件，在生物防沙、固沙和生态小环境的改善中发挥着不可替代的作用 2 葫芦藓有药用价值 葫芦藓为药用全草，味辛、色、性平。有舒筋活血、祛风镇痛、止血等功能。 [5]用于治疗鼻窦炎、痨伤吐血、跌打损伤、关节炎等。目前常用的药用苔藓大概有57种。通过组织培养可大量繁殖有药用价值的苔藓，制成药物造福于人类。 1 滨州学院本科毕业论文 3 可作为实验材料 地钱培养细胞叶绿体发育良好，叶绿素含量较高，是研究细胞生理生化特别 [6]是光合作用的一种好材料。由于地钱细胞生长速度快，倍增时间段，可同步培养， [6]而且是单倍体细胞，可以作为研究遗传特别是研究基因表达、调控的有用材料。 4 园艺方面的应用 许多苔藓植物有一定的观赏价值。苔藓植物历来是草木花卉以至鱼苗输送的最佳材料。在美国西部，曾用多种苔藓 植物做蔬菜保鲜。多种葫芦藓在日本用于沙和 [13]土壤相混合来栽培杜鹃花。苔藓植物本身也被用于作为花卉替代品以供人欣赏。 5 研究历史、成就与现状 葫芦藓生长分散，难以大面积收集，又很难提供适宜的生态条件进行栽培，还容易与别的种类混杂。解决这个问题的一个很好的办法是应用合适的培养基质在可控条件下让它们生长。对葫芦藓组织培养的研究开始的比较早，但其组织结构和生活习性与其他高等植物差别较大，常规的培养条件对其并不适合，因而发展的比较缓慢。随着国内外对植物组织培养研究越来越重视，对葫芦藓人工组织培养的研究取得了很大的进展。 包文美和陈发生在液体和琼胶培养基上培养葫芦藓孢子使其萌发，观察其生活 [8]史中各个阶段的形态结构特征。随后又有人就葫芦藓的孢子在液体或琼胶培养基 [9]上的形态发生及原丝体的发育有所研究。国内报道钙离子浓度对几种喜钙藓类的 [10]孢子萌发和原丝体的生长有所影响;细胞分裂素6-BA和KT促进葫芦藓芽的形成， [11]而氯丙嗪抑制受其诱导的芽的形成;IAA和GA3对苔藓的原丝体和蒴柄的生长有 [12]促进效果。另外有学者研究得出极地和温带地区苔藓植物的光和最适温度为5-20[13]【14】度;葫芦藓的配子囊只有在植物体处于温度为7度中才能形成;芽的形成以 [15]25度时为最适。苔藓植物属于阴生植物比其他植物需要的光照低，光达2000lux 【16】[17]时全部原丝体开始生长。苔藓孢子萌发于原丝体，生长的pH值在6-10范围内。 过去对葫芦藓人工培养影响条件的研究多是用同种培养基设计不同的参数梯度，但同一外界条件下在不同培养基培养葫芦藓的实验不多见，本实验以此为切入 2 滨州学院本科毕业论文 点在特定条件下不同培养基上培养葫芦藓， 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 结果从而选出特定条件下最适培养 H梯度来优化培养条件。 基。然后以此培养基培养葫芦藓，设计四个不同的p 3 滨州学院本科毕业论文 第一章 葫芦藓培养基的初步筛选 1.1实验材料的采集 葫芦藓，植物体小型至中等大小，茎密集丛生或疏松散生，鲜绿色或黄绿色，单一或稀疏分枝，叶呈莲座状簇生于茎的顶部。干燥时皱缩，湿润时倾立，舌形或长方形向上渐尖，全缘平滑，有时内曲，中肋较粗壮，下部叶小型，上部叶内凹，中肋几乎达到叶尖，蒴柄细长3—5cm，紫红色或稍带黄色，上部弯曲，孢蒴高出， [8]常弧形，呈梨形。 采集选择生长情况良好的葫芦藓(Funaria hygrometrica)的原丝体，地点为山东滨州学院4教西的小树林内。采集时间2009年5月9日(刚下过小雨两天)。 1.2 所需仪器 培养皿 、锥形瓶、 广口瓶、容量瓶、 玻璃棒、 镊子、 剪刀、 烧杯、 滤纸、量筒、 超净工作台、 电子天平、 药匙、 酒精灯、 灭菌锅、 移液管、直尺、PH计。 成分 改良过的Knop培养基 Benecke培养基 Ca(NO3).4HO 1000mg 0 22 NHNO 0 200mg 43 CaCl 0 100mg 2 KHPO 250mg 100mg 24 MgSO.7HO 250mg 100mg 42 KCl 250mg 0 FeSO.7HO 12.5mg 0 42 FeCl.6HO 0 微量 32 琼脂 8000mg 8000mg 用蒸馏水定容至 1000ml 1000ml 1.3实验方法 4 滨州学院本科毕业论文 1.3.1培养基的制备 (1)培养液各成分表 表1.1 Konp及Benecke培养基的成分 成分 改良过的Knop培养基 Benecke培养基 Ca(NO3).4HO 1000mg 0 22 NHNO 0 200mg 43 CaCl 0 100mg 2 KHPO 250mg 100mg 24 MgSO.7HO 250mg 100mg 42 KCl 250mg 0 FeSO.7HO 12.5mg 0 42 FeCl.6HO 0 微量 32 琼脂 8000mg 8000mg 用蒸馏水定容至 1000ml 1000ml 表1.2 MS培养基成分 母液编号 成分 用量 母液配法及倍数 NHNO41.25g 43 母液1 KNO 47.25g 定容至500ml为50倍 3 KHPO 4.25g 24 母液2 MgSO.7HO 18.5g 定容至500ml为50倍 42 母液3 CaCl.2HO 22g 定容至500ml为50倍 22 NaEDTA 1865mg 2母液4 定容至500ml为100倍 FeSO.7HO 1390mg 42 KI 41.5mg HBO 310mg 33 MnSO.7HO 845mg 42 母液5 ZnSO.7HO 529.5mg 定容至500ml为100倍 42 NaMo.2HO 12.5mg 42 CuSO.5HO 1.25mg 42 CoCl,6HO 1.25mg 22 肌醇 5g 烟酸 25mg 母液6 盐酸硫胺素(B1) 5mg 定容至500ml为100倍 盐酸吡哆素(B6) 25mg 甘氨酸 100mg 5 滨州学院本科毕业论文 按上表成分配制Konp、Benecke培养基和MS培养基的各个母液。 (2) MS培养液的制备 量取MS母液1、母液2、母液3各20ml，母液4、母液5、母液6各10ml，转移到烧杯中，用玻璃棒搅拌，混匀。再转移到1000ml容量瓶中用移液管定容。然后倒入广口瓶中保存。 (3)养液的分装 将配制好的三种培养液分别倒入150ml的锥形瓶中于1/3处，用棉塞塞紧牛皮纸封口，准备消毒。 1.3.2 培养基、培养皿的灭菌 (1)消毒与灭菌 采用热湿消毒法，将分装好的培养基、培养基皿等实验操作器具置于型自动蒸 03汽灭菌锅内温度为121C、压力为1.1kg/cm条件下灭菌20-25分钟。 (2)倒培养基 将倒培养基用的器皿、酒精灯和盛酒精棉塞的广口瓶放入超净工作台中，打开紫外灯照射30分钟。 等培养皿不热的时候倒培养基，先用酒精棉擦手，点燃酒精灯，在酒精灯附近将培养基倒入培养皿。三种不同的培养基各倒入5个相同规格的培养皿中，并贴上 0标签。将暂时不用的,已经灭菌好的培养基最好置于4C冰箱保存。 1.3.3 接种 (1)葫芦藓原丝体的消毒 葫芦藓的培养一般是从孢子开始，但笔者采集了新鲜生长良好的配子体，用配子体开始培养。原丝体经过75%的酒精和0.1%的次氯酸钠的消毒，然后在无菌水中反复冲洗。 6 滨州学院本科毕业论文 (2)接种 在超净工作台上用无菌镊子将消毒过的葫芦藓配子体接种倒培养基上。每个培养皿中接种10株葫芦藓配子体。 (3)培养 0[15]接种好的培养基放在培养箱中培养。设置条件参照:温度25C(研究表明在 [16]此温度下原丝体的发育生长与芽的形成状况最好)、光照2000lux(苔藓植物中的苔类和藓类都属于阴生植物，比其他高等植物需要的光照低。对大多数苔藓而言2000lux的光照就足以满足其生长的需要，较高的温度对其有伤害作用)调节光照12小时黑暗12小时。 1.3.4 观察结果 四周后观察结果如下: 表1.3 30天后观察各培养基中葫芦藓生长情况 a b c 总数 污染数 褐化数 污染率死亡率无菌率MS培养基 50 9 11 18% 22% 60% 50 16 16 32% 32% 36% Benecke培 养基 Konp培养基 50 19 20 38% 40% 22% 注:“a” 污染率=所有污染的个数/接种总数*100% “b” 死亡率=死亡但未污染的个数/接种总数*100% “c” 无菌率=未死亡且没有污染的个数/接菌总数*100% 7 滨州学院本科毕业论文 30天后MS培养基上葫芦藓的长势如下图: 图1 葫芦藓在MS培养基中培养30天后生长状况 表1.4 三种培养基中葫芦藓配子体的生长状况 培 养 原 Benecke培养基 Konp培养基 MS培养基 基 丝 体 1号 6 5 8 2号 7 4 9 3号 5 5 7 4号 7 6 7 5号 4 6 8 *平均值?标准误 5.8?0.58 5.2?0.37 7.8?0.37 注:“*”表明与其他两组间差异显著。 1(4讨论 8 滨州学院本科毕业论文 实验表明葫芦藓原丝体在MS培养基上比在另外两种培养基上生长要好。MS为有机培养基，推论其结果比其他两种培养基要好的原因与加入的有机物有密切的关系。 维生素类:VB、VB、烟酸等主要以辅酶的形式参与每当活动，参与细胞的蛋16 白质、脂肪、糖类的代谢。 肌醇:主要参与糖类代谢及磷脂代谢和离子平衡作用。 氨基酸:常作为有机碳源。常用的氨基酸有:甘氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、 天冬酰胺、水解酪蛋白、水解乳蛋白等。 在很多研究中，对葫芦藓的培养加入了有机添加物:常用植物的天然汁液、椰乳、苹果汁、香蕉、马铃薯等。主要提供氨基酸、激素、酶等。对增值和分化有明显的促进作用。 国内外有报道植物生长调节物质对葫芦藓的生长有不同的促进作用。如萘乙酸(NAA)对葫芦藓的原丝体生长有很大影响。突出表现在原丝体及其分枝的宽度和分 【18】枝的数目上。其机制主要是通过促进细胞的纵向扩大，及伸长过程来实现的。 第二章 葫芦藓培养条件的优化 2.1 实验设计 在分析上述实验结果之后，笔者选用了MS培养基来优化培养条件。培养基的pH值对苔藓植物的影响多由报道，一般情况下苔藓的最适pH值范围在5.0—5.7 [16]之间。为此在下实验中笔者在MS培养基上设计了四个PH梯度来培养葫芦藓，分别为5.0、5.5、6.0、6.5，用以筛选最适于葫芦藓生长的pH值。 2.2 研究材料及方法 2.2.1 实验材料的采集 (同上) 9 滨州学院本科毕业论文 2.2.2 实验方法 2.2.2.1培养基的制备:如上述过程配制MS培养基，并调PH值，用镊子捏住PH试纸在培养基中沾一下，显示培养基大概中性，用1 moL/L的HCl调节。调节PH值时逐滴加入盐酸，防止局部过酸或过碱破坏培养基，边加边搅拌并不时用pH计来测量pH值。将调节好的培养基消毒灭菌(消毒方法同上)。 2.2.2.2接种:方法同上。 2.2.2.3 培养(温度25?，光照强度2000lux，光照12小时，黑暗12小时) 2.2.2.3观察结果并 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 : 三天后观察结果 表1.4 MS培养基上不同pH值下葫芦藓生长状况 培 5.0 5.5 6.0 6.5 养 原 基 丝 体 1号 1 2 0 0 2号 1 2 0 0 3号 0 0 0 0 4号 0 1 0 1 5号 2 0 1 0 一周后观察结果如下: 10 滨州学院本科毕业论文 表1.5MS培养基上不同PH值下生长状况 pH 值 值 原 5.0 5.5 6.0 6.5 丝 体 1号 2 9 6 3 2号 4 7 4 4 3号 5 7 3 6 4号 2 8 4 4 5号 7 7 3 5 *平均值?标准误 4?0.95 7.6?0.40 4?0.55 4.4?0.51 2.3讨论 结果表明:当PH值为5.5时葫芦藓生长状况最好。主要表现为:长出原丝体所需的时间比其他pH值条件下的要短，其原丝体的长度明显要长于其他培养基中的。并且颜色嫩绿显示出良好的生长趋势。 由于本实验设计的是5.0、5.5、6.0、6.5四个间隔的pH梯度，若要进一步精确5.5附近的pH值哪一个最适合葫芦藓的培养，需要做进一步的探讨。建议设置pH值梯度差值为0.1。 MS培养基的初始pH值为6.7，对于培养葫芦藓来说并非是最适合的条件，建议用MS培养基培养葫芦藓时调整pH值为5.5。 结 论 01、本实验表明:在相同的条件(温度为25C、光照为2000lux)下，于三种常见的培养基(Konp培养基，Benecke培养基，MS培养基)上培养葫芦藓，MS培养基中葫芦藓的污染率与死亡率较低，配子体生长状况最好。 2、用MS培养基分别在不同的pH值(5.0、5.5、6.0、6.5)条件下培养葫芦藓，实验结果表明:当pH值为5.5时其生长状况最好，长出原丝体需要的时间最短，数量最多。 11 滨州学院本科毕业论文 参考文献: [1] 吴玉环，程国栋，高谦.苔藓植物的生态功能及在植被恢复与重建中的作用[J]。中国沙漠，2003，23(23):215-220. 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