应用PCR-SSCP检测先天性软骨发育不全患者

应用PCR-SSCP检测先天性软骨发育不全患者 【摘要】 目的 应用PCR-Single-Stronded conformation poly morphism(PCR-SSCP) 技术对先天性软骨发育不全患者进行检测。方法 对3例疑似先天性软骨发育不全患者、1例 确诊患者应用基因组DNA聚合酶链反应-单链构象多态技术进行检测。结果 3例疑似患者中2 例出现和确诊患者同样的异常泳带，此泳带在正常人中不存在。结论 PCR-SSCP技术可实现 对先天性软骨发育不全患者的检测。 【关键词】 先天性软骨发育不全;聚合酶链反应;单链构象多态 Detection of achondroplasia by PCR-SSCP ZHAO Xin,WU Yu,ZHU Xiao-he. 【Abstract】 Objective To detection achondroplasia by PCR-SSCP.Methods The genomic DNA from 1 clinically diagnosed achondroplasia patient and 3 suspicious patients with achondroplasia was diagnosed by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-SSCP).Results 2 in 3 suspicious patients with achondroplasia have the same abnormal band,which does not exist in normal people.Conclusion PCR-SSCP can be usedthe diagnosis of achondroplasia. 【Key words】 Achondroplasia;Polymerase chain reaction;Single-Stronded conformation poly morphism 先天性软骨发育不全(achondroplasia，ACH)是小儿遗传性侏儒症中最常见的类型，在活 产婴儿中的发病率为1/15 000,1/77 000，为常染色体显性遗传，无家族史，约80%患者为 散发型。 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 现为短肢型身材矮小，头大，前额和顶骨圆凸，鼻梁下陷，腰椎前凸，弓形腿， “V”字形手等。至今已发现ACH的3种基因突变，均位于FGFR3跨膜区，多数为1 138位核 苷酸的G?A转换，少数为G?C颠换，还有个别为1 123位核苷酸的G?T颠换。 1 对象与方法 1(1 对象 沈阳市中国医科大学第二附属医院儿科遗传门诊的3例疑似ACH患者、1例 确诊患者和1名无ACH家族史的正常人。 1(2 方法 1(2(1 DNA模板的制备 取受试者静脉血5 ml，加EDTA抗凝剂0(5 ml混匀，用常规 方法，血标本经蛋白酶K处理，苯酚/氯仿抽提，无水乙醇沉淀，沉淀物溶于缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl，pH7(4;1 mmol/L EDTA，pH8(0)。所得DNA用紫外分光光度计检测吸光度，A260/A280 约为1(8。 1(2(2 基因片段PCR扩增 引物合成:上游引物和下游参照文献^[1]，由上 海博亚公司合成，引物序列为:5′-AGGAGCTGGTGGAGGCTGA-3′和 5′-GGAGATCTTGTGCACGGTGG-3′PCR反应体系:每25 μl反应体系中，含10×PCR缓冲液 ,2(5 μl,，dNTP2 μl，上游和下游引物各2(5 μl，TaqDNA聚合酶0(2 μl，去离子 水10(3 μl，模板DNA5 μl。 反应程序:94?变性8 min后，按94?40 s、65?30 s、72?40 s循环30次，最后72?延伸7 min结束反应。 1(2(3 PCR扩增产物鉴定 取PCR扩增产物10 μl，指示剂溴酚蓝1 μl混匀后加入2%琼脂糖凝胶孔中，电泳缓冲液1×TDE，80 V电泳30 min，溴化乙锭染色后紫外灯下观察。检查有无扩增出目的条带及扩增出的目的条带是否理想，如不理想或有非特异性条带存在， 则重新扩增直至得到较理想的扩增产物。 1(2(4 单链构象多态性分析 取PCR产物5 μl，加入等体积的变性液(95%甲酰胺，20 mmol/L EDTA，0(05%二甲苯蓝，0(05%溴酚蓝)混匀，97?变性10 min，使PCR产物解为单链，立即将解链产物置冰浴中骤冷5 min。将此变性产物加入12%非变性聚丙烯酰胺凝胶(49?1)中，室温100 V恒压垂直电泳200 min。待溴酚蓝走至胶底，二甲苯蓝走至约2/3胶长时，停止电泳。溴化乙锭染色，紫外灯下检测电泳条带并照相。 2 结果 2(1 PCR扩增产物鉴定结果 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，观察证实每一标本都扩增出来。 2(2 单链构象多态性分析结果 样品DNA经SSCP分析，3例疑似ACH患者中发现P1、P2存在和阳性对照相同的单链泳动变位，带形一致，说明存在相同的DNA碱基变异。另外1例疑似患者P3以及正常对照未发现单链泳动变位。见图1。 3 讨论 先天性软骨发育不全(ACH)是小儿遗传性侏儒症中最常见的类型，是一种由于软骨内化骨缺陷导致的发育异常，又称胎儿型软骨营养障碍、软骨营养障碍性侏儒等。ACH是完全外显的常染色体显性遗传，无家族史，约80%患者为散发型，为新生突变，与父亲年龄较大有关。近十年来，对此症的基因诊断有了突破性的进展。Shiang等^[1]和Rousseau等^[2]发现成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)跨膜区基因第10外显子1 138位核苷酸的点突变是ACH发病的原因，其中95%以上为G?A转换，尚有少数发生G?C的颠换，该突变使得第380位密码子由编码甘氨酸转变为精氨酸，导致跨膜 区结构发生变化，从而引起成纤维细胞生长因子受体3蛋白异常，最终导致先天性软骨发育不全。1994年，Francomano等^[3]通过连锁分析，将ACH的致病基因定位于4p16(3，研究发现FGFR3也恰在此范围内。FGFR3是一种酪氨酸激酶受体，含有806个氨基酸残基，FGFR3基因长约15 Kb，由19个外显子和18个内含子组成^[4]，其中第10外显子编码FGFR3跨膜区。 国外学者Superti-Furga等^[5]和Ivegawa等^[6]还发现极少数患者不是FGFR3跨膜区380位的突变，而是FGFR3跨膜区375位的突变，即由半胱氨酸替代了甘氨酸。然而这种突变也局限在FGFR3的跨膜区，进一步说明FGFR3跨膜区与软骨发育不全的发病机制有关。 目前用于检测基因点突变的方法有很多，其中Orita等^[7]建立的SSCP技术具有简便、快速和适于大样本筛查等优点，可用于检测单个碱基置换、数个碱基插入或缺失等基因变异。经与PCR技术结合，在突变分析中发挥着重要的作用。PCR-SSCP的原理是PCR产物变性后可产生两条互补的单链，各单链根据自己的一级结构而形成不同的构象。单链DNA的构象主要取决于其碱基序列，长度相同，但碱基序列不同甚至单个核苷酸发生突变，其单 链的构象也随之变化，并导致电泳迁移率的差异，在电泳凝胶上显现出不同带形。影响 PCR-SSCP方法检出突变的因素较多，如扩增片段的长度、突变性质、电泳支持介质及工作条 件等等。用于SSCP分析的核酸片段越小，检测的敏感性越高^[8]，根据资料显示， 对于200 bp的片段，检出率>90%^[9]，本文的扩增片段长度为164 bp，故可期 望获得较高的检出率。PCR-SSCP分析方法检测基因突变的优点在于操作简便、快速、经济、 易于掌握，已被广泛用于筛查已知突变位点，识别未知突变，以及多态性的分析。 同时SSCP作为筛查某一区域DNA点突变的灵敏的分子生物学检测技术，其 检测条件可因DNA片段长度及核苷酸组成有很大差别，电泳条件可因突变类型不同而各异， 故较难掌握;其二，可因加量不适当导致多态性条带，与正常条带重叠不易判断;另外还可 由于变性不彻底而出现双链，特别是异源双链的干扰而影响实验结果的准确性。 参考文献 1 Shiang R,Thompson LM,Zhu YZ,et al.Mutations in the transmembrane domain of FGFR 3 cause the most common genetic form of dwarfism.Achondroplasia.Cell,1994,78(2):335-342. 2 Rousseau F,Bonaventure J,Legeai-Mallet L,et al.Mutations in the gene encoding fibroblast growth factor receptor-3 in achondroplasia.Nature,1994,371:252-254. 3 Francomano CA,Ortiz de Luna RI,Hefferon TW,et 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