体外培养刺五加生产刺五加苷b、e的研究

体外培养刺五加生产刺五加苷b、e的研究 体外培养刺五加生产刺五加苷B、E的研究 体外培养刺五加生产刺五加苷B、E的研究 作者:邢朝斌，王明艳，吴鹏，劳凤云 【摘要】 目的探讨2,4-D 和培养基对刺五加愈伤和体细胞胚胎生产刺五加苷B、E的影响，建 立有利于刺五加苷B、E积累的刺五加体外培养体系。方法将来自同 一外植体的刺五加愈伤组织和体细胞胚胎分别诱导增殖或产生次级 体胚，HPLC法测定培养物中刺五加苷B、E含量和培养物质量，考察 培养物类型、培养基种类和激素对刺五加苷B、E生产的影响。结果 体细胞胚胎的质量虽略低于愈伤组织的质量，但体细胞胚胎生产刺五 加苷B、E的能力优于愈伤组织。2,4-D对刺五加苷B、E含量影响较 小，仅改变了培养物的质量。MS培养基处理中培养物的刺五加苷B、 E产量优于1/2MS培养基。结论刺五加体外培养物可以生产刺五加苷 B、E，其产量取决于培养物类型、培养基种类和2,4-D浓度。 【关 键词】 刺五加; 刺五加苷B; 刺五加苷E; 愈伤组织; 体细胞 胚胎 Abstract:ObjectiveTo discuss the effect of 2,4-D and culture medium to the callus and somatic embryos for the production of eleutherosides B, E, establish in vitro raise system of Eleutherococcus senticosus Harms.MethodsUsing Callus and somatic embryos which came from the same explant to induce multiplication or to produce secondary somatic embryos. Determined the content of eleutherosides B ,E and the wght of culture medium by HPLC. The effect of eleutherosides B ,E by the cultures type, the culture medium kind and the hormone were studied.ResultsEven though the wght of somatic embryos was slightly lower than that of the callus,the ability of somatic embryos to produce eleutherosides B, E was better than the callus. 2,4-D had little effect on eleutherosides B, E, and only changed the weight of cultures. The production of eleutherosides B, E came from the cultures which was dealt with MS medium was higher than that in 1/2 MS medium. ConclusionIn vitro cultures of Eleutherococcus senticosus Harms can produce eleutherosides B, E, whose production is decided by the cultures type, the culture medium kind and the concentration of 2,4-D. Key words:Eleutherococcus senticosus Harms; Eleutheroside B; Eleutheroside E; Callus; Somatic embryos 刺五加Eleutherococcus senticosus Harms是我国医药珍品，根、茎、叶均可入药,1,。历代本草医药记载，其有益气健脾、补肾安神之功效，已载入《 中国 药典》(1977年版)。自20世纪70年代末以来以刺五加为原料生产的各种片剂、冲剂、针剂和刺五加参茶等产品远销国外，因而使刺五加资源消耗与日俱增,1,2,。经过几十年掠夺式的采挖，严重地破坏了野生刺五加资源;在 自然 状态下刺五加结实的株丛少，种子产量低、质量差、传播力弱、休眠程度深,2,，并且扦插成活率低、插穗来源少、程序繁琐,3,，1992年出版的《中国植物红皮书》已把刺五加列为了渐危物种。 植物组织、细胞培养具有快速、高效、低成本的优点，因而近年来利用植物组织、细胞培养快速繁殖刺五加的研究成为。目前多数研究集中于刺五加体细胞胚胎发生,4,和人工种子包埋,5,方面，并取得了可喜成果，对茎尖的快速繁殖、遗传转化也有初步探索,4,。但关于刺五加的体外培养物生产刺五加主要药用成分——刺五加苷B、E的研究尚未见报道。本文以刺五加的体外培养物为试材，探讨了培养物类型、培养基种类、激素对刺五加苷B、E生产的影响。 1 材料与方法 1.1 愈伤组织和体细胞胚胎的获得刺五加野生植株和种子采自吉林省伊通满族自治县西苇镇。种子经层积处理后，将种子的胚剖出，切取胚轴和野生植株萌发15 d以内的幼叶、叶柄作为外植体，接种在包含2,4-D 1.0 mg/L+NAA 1.0或2.0 mg/L MS培养基上，分别诱导产生愈伤组织或体细胞胚胎,4,6,。 1.2 愈伤组织和体细胞胚胎质量的测定 将上述产自同一外植体的愈伤组织和体细胞胚胎分别继代入添加了0,1.0 mg/L 2,4-D的MS和1/2MS培养基中诱导愈伤组织增殖、体细胞胚胎产生次级体胚。培养60，0，180，240 d时分别取出增殖产生的全部愈伤组织和体细胞胚胎。用重蒸水洗净粘附的培养基后，置于滤纸上吸干表面水珠，称取质量。 1.3 刺五加苷B、E含量的测定 HP-1100高效液相色谱仪为安捷 伦科技有限公司生产，乙腈为色谱纯，水为重蒸水，其余试剂为分析纯。对照品购自中国药品生物制品检定所,刺五加苷B编号为111574-200201，刺五加苷E编号为111713-200501。色谱条件:色谱柱:Kromasil ODS柱(4.6 mm×250 mm，5μm);流动相:0.1, 磷酸水溶液-乙腈(0?25 min，90?10?80?20)，流速为0.8 ml?min-1;柱温:室温。刺五加苷 B、苷 E 的检测波长分别是220 nm及206 nm。 取刺五加的体外培养物置于干燥箱中70?烘干后，粉碎。精密称取0.5 g，置于100 ml圆底烧瓶中。参照 文献 ,7,的方法，加入50,甲醇溶液20 ml，回流提取1 h，抽滤，滤液用50, 甲醇溶解定容至25 ml。取滤液适量， 000 r?min-1离心5 min，上清液作为供试品溶液。测定其刺五加苷B、E的峰面积，根据刺五加苷 B 的回归方程Y= 64.584X+2.8729,刺五加苷E回归方程 Y=89.603X+23.808， 计算 刺五加苷B、E含量。 1.4 刺五加苷B、E产量的计算公式为:刺五加苷B、E产量(mg)=刺五加苷B、E含量(mg/100g)×培养物质量(g)/100。 2 结果 2.1 体外培养物类型对刺五加苷B、E产量的影响以相同质量的外植体材料为起始材料，分别按照最佳体细胞胚胎和愈伤组织培养体系经240 d培养后诱导产生的愈伤组织和体细胞胚胎的刺五加苷B、E产量如表1所示。