低氧上调脂筏蛋白stomatin的表达,并增强糖皮质激素对其的诱导作用

低氧上调脂筏蛋白stomatin的 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达,并增强糖皮质激素对其的诱导作用 第二军医大学 硕士学位论文低氧上调脂筏蛋白stomatin的表达，并增强糖皮质激素对其的 诱导作用 姓名:蔡浩昱 申请学位级别:硕士 专业:病理学与病理生理学 指导教师:卢建 20080601 第二军医大学硕士学位论文 ,,,,,,,,,,,,, 缩写 英文名称 中文名称 ,,, ,,,,,, ,,,,, ,,,,,,, 牛血清白蛋白 ,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,, 二甲亚砜 ,，, ,,,,,,, ,,,,;,,,, ,,;,,, 低氧诱导因子 ,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,, 乙二胺四乙酸 ,, ,,,;,;,,,?椋悖铮椋?,,;,,,,, 糖皮质激素受体 ,,, ,,,,,,, ;,,, ,,,,, 新生牛血清 ,, 糖皮质激素 ,， ,,,, ,,,,, 肺系数 ?吣 ,,,,,,, ,,,,,, ,,,,, 湿干比 ,,,, ,,,,,;,,,,,,,, ,,, ,,,;,,,,,,,,,,, 聚丙酰胺凝胶电泳 ,,, ,,,,,,,,,, ;,,,, ,,,;,,,, 多聚合酶链式反应 ,, ,,,,,,, ,,,,,;,,,,,,, 逆转录 ,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,, ;,,,,,, 上皮钠通道 ,,, ,,,,,,,,, ,,，;,,,,,, 退化蛋白钠通道 ,,, ,,,,,,,,,,,,, 地塞米松 ,,, ,,,,,, ,,,;;,, ,,,,,,, 十二烷基硫酸钠 ,,,,, ,，,，,?，,?,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,, 四甲基乙二胺,,, 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本人承担本声明的法律责任。学位论文作者签名:歹莓媪 日期: ,莎年„月岁日 学位论文版权使用授权声明 本人完全了解第二军医大学有关保留、使用学位论文的规定，第二军医大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权第二军医大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名:薷浅显 导师签名: 方,日期:?劝脾,月歹日 日期:,,年‖月歹日 低氧上调脂筏蛋白,,,,,, ,,的表达，并增强糖皮质激素对其的诱导作用 摘要低氧上调脂筏蛋白,,,,,,,,的表达，并增强糖皮质激素 对其的诱导作用 在低氧时肺是最容易受到损伤的器官之一，肺水肿是低氧导致的严重结果，可危及生命，己知跨肺泡上皮的钠转运功能障碍是肺水肿发生的重要机制之一。正常情况下，钠从肺泡腔内的上皮细胞主动转运入血，引起水依渗透压梯度吸收入血，这是肺泡液体吸收的主要机制。低氧能降低肺泡上皮屏障功能，抑制肺泡上皮钠摄取和液体的清除，而外源性给予糖皮质激素(,,,;,;,,,,;,,,，,,)能够加速肺泡腔液体的重吸收和清除，因此在临床上,,,被用来有效治疗严重的肺水肿。近年来的研究表明,,能提高肺上皮细胞钠通道(,,,,,,,,,, ,,,,,, ;,,,,,,，,,,,)的活性，但是,,如何调节,,,,活性的具体机制不详。,,,,,,,,是一种膜上的脂筏蛋白，该蛋白具有脚手架功能，推测能与多种膜蛋白，如离子通道、转运子、骨架蛋白和信号转导蛋白等结合，并影响其功能。国外的研究表明,,,,,,,,在线虫中的同系物,,,(,能够增 加钠通道的开放，提示,,,,,,,,可能在,,调节,,,,方面发挥作用。本研究采用,,,,—,,,, ,,,和,,,,,,, ,,,,的方法，观察了低氧单独或与,,联合作用对人肺癌细胞系,,,,细胞和大鼠肺组织中,,,,,,,,表达的影响，以及这些变化和肺水肿发生的可能关系，以探讨低氧应激时,,,,,,,,的表达改变和可能的机制，为今后进一步研究,,,,,,,,的生物学功能以及作为糖皮质激素,糖皮质激素受体 (,,,,,;,,,,;,,, ,,;,,,,,，,,)调节的靶蛋白在,,低氧适应中的作用打下基础。一、低氧、糖皮质激素单独或者联合作用对,,,,细胞,,,,,,,,表达的影响 我们首先观察了人工合成的糖皮质激素一地塞米松(,,,,,,,,,,,,,，,,,)对,,,,细胞内,,,,,,,,表达的影响。于含,,,去激素血清培养基培养的,,,,细胞中加入不同浓度,,,处理,,,，或者用,,,,浓度,,,处理细胞不同时间后，抽取细胞的,,,，用,,,,,,,,, ,,,方法检测,,,,,,,, ,,,,的表达，结果发现,,,能以时间和浓度依赖的方式诱导,,,,,,,, ,,,,的表达，,,,,浓度,,,处理细胞,,,后，其,,,,,,,, ,,,,的表达量约为对照细胞的,倍(,,,(,,)。用,,,,,,, ,,,,的方法证实,,也能诱导,,,,细胞,,,,,,,,蛋白的表达。我们进一步发现,,的阻断剂,,,,,能明显阻断,,对,,,,,,,,表达的上调作用，表明,,对,,,,,,,,表达的 第二军医大学硕士学位论文 影响是通过,,来实现的。 接下来我们观察了低氧对,,,,细胞内,,,,,,,, ,,,,和蛋白表达的影响。将 生长密度为,,,左右的,,,,细胞培养基换成含,,,去激素血清的培养基，然后将 细胞置于含有,,,,的低氧孵箱，在低氧条件下培养细胞不同时间后测定其,,,,,,,,,,,,和蛋白的表达，结果发现低氧处理,,后,,,,,,,, ,,,,就明显上调,,,(,,)，并随着低氧时间的延长上调更明显，低氧,,,后,,,,,,,, ,,,,的表达量约是对照组的,(,倍(,,,(,,)。蛋白表达的检测结果表明低氧也能以时间依赖的方式上调,,,,,,,,的表达，低氧处理细胞,,后,,,,,,,,蛋白表达即开始上调，低氧,,,后,,,,,,,,蛋白的表达量增加更为明显。 我们进一步观察了低氧、,,单独或联合作用,,,对,,,,细胞,,,,,,,, ,,,,表达的影响。结果发现经低氧、,,,单独处理的,,,,细胞,,,,,,,, ,,,,的表达量分别为对照组的,倍(,,,(,,)、,倍,,,(,,)，而二者联合处理后,,,,,,,, ,,,, 的表达则上升至对照组的,倍左右,,,(,,)。上述处理方式同样能够影响,,,,细胞,,,,,,,,蛋白的表达，,,,单独上调的作用强于低氧单独作用的结果，而两者共同处理后,,,,,,,,蛋白的表达进一步增多。二、低氧和糖皮质激素对大鼠肺组织,,,,,,,,表达的影响 将大鼠放入充有,,,,、,,,,,混合气的低氧舱内低氧暴露不同时间，检测大 鼠肺组织,,,,,,,, ,,,,的表达情况。结果显示大鼠肺组织,,,,,,,, ,,,,的表达在低氧处理,小时后即有上调，约为对照组的,(,倍(,,,(,,)，之后逐渐降低，,,,时接近对照组的水平。已有实验表明低氧暴露的动物血中糖皮质激素明显增高，而我们上述实验已证明,,可诱导,,,,,,,,的表达。为了确定,,在机体上调,,,,,,,,表达的过程中发挥了多大 的作用，我们摘取了大鼠的肾上腺以去除内源性激素对,,,,,,,,表达的影响。我们先观察了低氧,,,正常大鼠的肺组织,,,,,,,, ,,,,的变化，结果表明,,,,,,,, ,,,,的表达明显增加，约为常氧组大鼠的,倍(,,,(,,)，但是当低氧组和常氧组大鼠均去腺后，这种表达差异变的不明显。我们进一步将大 鼠随机分为假手术常氧对照组、其余去腺后分为常氧组、低氧组、,;,组和低氧加,,,共处理组。对肺组织,,,,,,,, ,,,,的检测结果显示，去腺常氧组大鼠,,,,,,,,,,,,的表达与假手术常氧对照组相比略有降低，但差别不明显。去腺低氧组大鼠,,,,,,,,的,,,,与去腺常氧组大鼠相比虽然轻度升高，但差别也不明显。去腺,;,组大鼠肺组织,,,,,,,, ,,,,的表达比单独去腺组明显增高，而去腺大鼠用,,,和低氧联合处理，,,,,,,,, ,,,,的表达增加更为明显。表明在体内低氧上调(,? 低氧上调脂筏蛋白,,,,,, ,,的表达，并增强糖皮质激素对其的诱导作用,,,,,,,,的表达依赖于,,,，而且低氧能明显增强,,,上调,,,,,,,,的作用。三、低氧对肺水肿发生的影响 我们观察了低氧暴露不同时间后大鼠肺水肿发生的情况，并与,,,,,,,,的表达变化进行了比对，以初步探讨其表达与肺组织水肿发生之间可能的相关性。组织学的检测结果显示，低氧处理,,和,,,的大鼠与对照大鼠相比肺血管明显充血，肺泡间隔增宽，肺泡内出现水肿液，证明低氧大鼠出现了肺水肿，低氧处理,,,的大鼠肺水肿有所减轻。我们又检测了判定大鼠肺水肿的另外两个指标一肺组织湿干比、肺系数，结果表明与对照组相比，低氧,,组肺系数增高最明显(,,,(,,)，,,,、,,,组有所降低，与组织学的检查结果一致。另外，我们还发现低氧和,,,联合处理组大鼠肺组织,,,,,,,,的表达水平最高，而肺水肿的表现也最轻，提示,,,,,,,,的增多有减轻肺水肿的作用，推测,,,,,,,,有可能通过调节肺上皮细胞的钠通道促进肺泡水肿液的清除，这方面还需要迸一步实验来证明。 综上所述，低氧、糖皮质激素都能上调,,,,细胞,,,,,,,,的表达，糖皮质激素的作用强于低氧，两者联合作用具有协同效应。低氧也能明显上调大鼠肺组织,,,,,,,,的表达，该作用需要糖皮质激素受体的存在，而且低氧能明显增强,;,上调,,,,,,,,的作用。进一步实验发现大鼠低氧暴露后,,,,,,,,的表达水平与肺水肿的严重程度呈负相关，推测,,,,,,,,有可能通过提高肺上皮细胞钠通道的活性和稳定细胞骨架来促进肺泡水肿液的清除，防止肺水肿的发生和发展。 【关键词】糖皮质激素，糖皮质激素受体，低氧，肺水肿，,,,,,,,,，动物模型 (,。第二军医大学硕士学位论文 ,,,,,,;, ,,,,,,, ,,?,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,, ,,,;,;,,,,;,,,,,,,,,;,, ,,,,,,,,,, ,, ,,,,, ,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,, ,,,,, ,, ,,,,,,, ,,,,,, ,,,, ,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,,,，,,,,,,,,, ,,,,, ,, ,,, ,,,, ,,,,,,, ,,,,,, ,,,,;,, ,, ,,,,,,,(，, ,, ,,,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,;,,,, ,, ,, ,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,, ;,,,, ,,;,,,, 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,,,;,;,,,,;,,, ,,,,;,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,,(,, 低氧上调脂筏蛋白,,,,,, ,,的表达，并增强糖皮质激素对其的诱导作用,,,,,,, ,,,;,;,,,,;,,, ,,;,,,,,(,,, ,,,,,:,,,,,,,，,,,;,;,,,,;,,,，,,,;,;,,,,;,,, ,,;,,,,,，,,,, ,,,,,，,,,,,,,,，,,,,,, ,,,,, (,( 低氧上调脂筏蛋白,, ,,,,,,,的表达，并增强糖皮质敏索对其的诱导作用 刖吾 体内最重要的,峨救激素是糖皮质激素(,,)，应激时,,分泌增多对机体抵抗有害刺激起着极为重要的作用。,,的作用机制非常复杂，迄今的研究表明,,的大部分作用是通过细胞浆巾的糖皮质激素受体米实现的。糖皮质激素受体是配体依敕性的转录因子，能通 过与靶基因的启动子部位巾的话皮质激素反应元件(,,,;,;,,,,;,,,,;,,,,”,, ,,,,,,,，,,,)结合，直接调节靶基因的表达，发挥„,物效应:也能通过和其他转录园于(如,,—,，,,—,,，,,,等)相瓦作用调节(促进或者抑制)基因表达，这种调节摹因表达的方式通常不需要,,赢接与,,,结合，糟皮质激素的抗炎作用主要通过这种方式。,于已有实验显示,,与,,,结合对于小鼠的存活不是必需的，因此,;在应激和适应反应中的作用也可能并非主要依赖,,直接调节靶基因，而是更大程度上与,,,,,精细地调节组织和系统应激反应的其他细胞内信号通路，从而间接调节基因的表达有关。除了,,,,,的基因组作用外，越来越多的实验表明汹体激素,受体还可以通过非基因组机制发挥作用。 近年来的研究表明脂筏(,,,,, ,,,,)是质膜中富含胆固醇和鞘磷脂的膜的微区，腊筏微区中聚集着多种蛋白，如离于通道、转运了、细胞骨架蛋白，特定受体以及,游的信号转导蛋白和脂质特异性的酶类等。脂筏为这些蛋白提供了停泊和相互作用的甲台，因而具有包括泡膜的运输、细胞骨架的重排、粘附与迁移、细胞信号转导、增殖与凋亡的调控等在内的复杂功能。脂筏蛋白是脂筏的组成成分，其功能是作为脚手 架在脂筏的形成 和相关蛋白质的 募集中发挥重要 作用。,,,,,,,, 是分子量为,, 盯磐热 ,川,(? ,,的脂筏蛋白， ,,， 。铲,,,。 由,,,个氮基酸 ,七蠢一 ,,,?,,,,,一“ ?,口“??,…，… ,？,,?……,，口? 残基组成，有一 个短的,(端，一 个相对疏水的膜 …,,,,，,,一 作用区(在细胞 与脂筏蛋白脚手架连接的蛋白示意图〔,, 膜内形成发卡的转折)和一个长的有重要功能的富含丙氨酸和谷氨酸残基的,(端 其相对疏水的,(第二军医大学硕士学位论文端和亲水的,(端均位于胞质侧，它们有可能结合或相互作用【,,,〕。,,,,,,,,在膜上以,到,,个高度有序的同源寡聚物的形式存在【,】，并可被磷酸化和棕榈酰化【,,。 ,,,,,,,,是进化上高度保守的蛋白质，广泛分布于动物、植物和原核生物。在人体内的红细胞、白细胞、多种组织的上皮细胞(如肺和肾脏的上皮细胞)、神经细胞 以及胸腺、脾脏、心脏、胎盘、肝脏、骨骼肌等组织细胞中都有表达。,,,,年，,,,,,,,最先在两例遗传性口形红细胞增多症患者的红细胞膜上发现,,,,,,,,(,,,, ,(,,)的缺失。遗传性口形红细胞增多症是一种常见遗传性红细胞膜先天缺陷疾病，患者的红细胞膜通常表现出对钠、钾一价阳离子的异常通透性，该现象提示,,,,,,,,在调节离子通道的过程中可能发挥了重要的作用。为了进一步证实这一点，,,,,,雒【,,等人将,,,,,,,,在线虫中的同系物,,,(,和退化蛋白钠通道(,,,,,,,,, ,,，;,,,,,,，,,,)共转染入爪蟾卵，结果发现,,,,,增加了,,,的开放。研究也发现在神经细胞中，,,,,,,,,能抑制矿对酸敏感的离子通道(,;,,(,,,,,,, ,,, ;,,,,,,,，,,，,,)的激活作用，减少酸引发的,矿内流，从而参与了对疼痛的感知、缺血性损伤、感知机械刺激以及学习记忆等过程【,。,,。还有报道显示,,,,,,,,能与葡萄糖转运子,,,,,,的,端结合，将其定位于细胞质膜，并作为,,,,,,的掩蔽蛋白，抑制其葡萄糖转运的效能网。此外，研究还发现,,,,,,,,在纤毛细胞中的分布集中于纤毛部位。在上皮细胞中与,;,,,共定位，能结合细胞骨架，为细胞骨架提供锚定点。因而能够使细胞骨架重构，改变膜的稳定性和 细胞形态，参与细胞的粘附,,。它还能作为细胞的机械感受器，进行机械刺激的信号转导和调节机械敏感性离子通道的开放，,,,,,。目前哺乳动物细胞中比较明确的能与,,,,,,,,作用的蛋白还不多，对,,,,,,,,的功能和调节至今了解很有限。由于作为脂筏蛋白，,,,,,,,,能够整合多种重要的膜蛋白(离子通道、转运子、骨架蛋白和信号转导蛋白等)，提示它应该具有重要的生理功能，并有可能参与包括低氧在内的病理生理过程。 缺氧是最重要的应激反应之一，是临床最常见的病理生理过程，与高原性疾病、呼吸系统疾病、心血管疾病、神经损伤、休克、缺血再灌流损伤等的发生发展密切相关。研究表明，机体对缺氧损伤的习服与适应受整体神经内分泌，特别是下丘脑,垂体(肾上腺皮质(,,,)轴以及糖皮质激素(,,)的影响。已证实在低氧条件下机体内,,的分泌增多，,,在低氧适应及维持内环境的稳定中发挥作用。服用,,类药物，如,,,可以减轻高山低氧反应和低氧损伤，减轻高原性肺水肿以及明显减轻缺血缺氧导致的脑损伤【,,,,,】。,,,对低氧环境下机体的保护作用与其在,,介导下调节基因的表达有关。已知低氧可导致广泛的基因转录水平的改变，在受低氧调节的基因中，有一部分也是,,,,,的调节基因，如有报道,,,,,能上调白细胞介素一,(，,一,)一,,( 低氧上调脂筏蛋白,,,,,,,,的表达，并增强糖皮质激素对其的诱导作用的生成，而，,(,是低氧诱导的基因【,,,。已证实一些,,的靶基因启动子中除了具有,,的反应元件外，还有低氧诱导因子(,,(,，,(,,)的反应元件，表明,,,,,和,，,(, ,„具有相同的靶基因，可以共同调节一些基因的表达,,,,。还有报道,,可以在转录水平与,，,(, ,;发生相互作用，增强,，,(, ,【靶基因，如血管内皮细胞生长因子 (,,,,)，葡萄糖转运子,,(,,,,,,)等的转录【,,,，提示这两种转录因子可以通过协同或拮抗作用调节基因表达。此外，还有报道低氧可以上调肾近曲小管上皮细胞上的,,，并增强,,的转录调节作用,,,,。但是迄今对,,,,,在缺氧适应中的作用机制并没有完全阐明，对参与,,发挥低氧损伤保护性作用的靶基因所知不多，对其调节的研究也有待于深入。国外有实验表明，地塞米松、，,(,两者单独或者联合使用可以上调人羊水细胞细胞系,,,细胞,,,,,,,,基因和蛋白的表达【碉。基因芯片的研究也初步证实,,,也可以上调人肺癌,,,,细.