穿孔素与颗粒酶B在鼻NK_T细胞淋巴瘤诊断中的意义

穿孔素与颗粒酶 B在鼻 NK/ T 细胞淋巴瘤诊断中的 意义 石群立1 � 周晓军1 � 孟 � 奎1 � 陈 � 琴1 � 盛春宁1 � 李 � 军2 � 陈 � 鑫2 � 刘 � 镭2 �摘要 � 目的 � 检测鼻 NK/ T 细胞淋巴瘤中的穿孔素、颗粒酶 B表达分布情况 ,为临床治疗和预后判断提供依据。方法 � 运 用免疫组化 S�P 法检测 11 例鼻 NK/ T 细胞淋巴瘤中穿孔素、颗粒酶 B 的表达和分布情况;同时与组织芯片中其他类型淋巴瘤 进行比较研究, 10 例淋巴组织反应性增生作为对照。结果 � 11 例鼻 NK/ T 细胞淋巴瘤中均见穿孔素和颗粒酶 B 过度表达。 以 60 例淋巴瘤制成组织芯片的 42 例 B细胞淋巴瘤中见 11 例少许穿孔素和 14 例少许颗粒酶 B 阳性表达细胞散在分布于瘤 细胞间, 10 例外周 T 细胞淋巴瘤中 8 例少许表达穿孔素和 9 例少许表达颗粒酶 B。2 例间变性大细胞淋巴瘤见少许穿孔素和 颗粒酶 B阳性表达细胞。2 例霍奇金淋巴瘤阴性。NK/ T 细胞淋巴瘤的穿孔素和颗粒酶 B 表达程度与 T、B 淋巴瘤比较, 差异 有显著性(P < 0� 01)。结论 � 穿孔素和颗粒酶 B是鉴定活化的细胞毒性细胞的免疫标记物,可作为 NK/ T 细胞淋巴瘤的诊断 性标记物;其在外周 T 细胞淋巴瘤和 B 细胞淋巴瘤中的表达,反映了机体存在抗肿瘤的免疫反应机制。 �关键词 � 鼻肿瘤; NK细胞;淋巴瘤; 免疫组织化学;穿孔素; 颗粒酶 B �中图分类号 � R737. 31; R730. 261� � �文献标识码 � A � � �文章编号 � 1001 7399( 2004) 05 0580 05 Significance of the expression of perforin and granzyme B in nasal NK/ T cell lymphoma Shi Qunli, Zhou Xiaojun, Meng Kui, Chen Q in, Sheng Chunning, L i Jun, Chen Xin, L iu Lei (Department of Pathology , N anj ing Mil itary General H osp ital of PLA , Nanj ing 210002) � Abstract � Purpose � To detect the expression and distribution of activated cytotox ic cells in types of lymphoma w ith tissue microar� ray, and to provide evidences for clinical treatment and evaluation of prognosis. Methods � Immunohistochemical staining by S�P t echnique was used to detect the expr ession and distr ibut ion of per for in and g ranzyme B in the lymphoma tissue microarray , composed of 60 cases of lymphoma. 9 cases of NK/ T�cell lymphoma routine sections were used for r elative resear ch, and 10 cases of react ive lymphoid hyperplasia w er e also used for comparison. Results� I n the tissue microarray, originated from the nodal and ex tra- nodal sites were 48 cases and 12 cases, r espectiv ely; consisting of 42 cases of B�cell lymphoma, 16 cases of T�cell lymphoma, 2 cases of Hodgkin! s disease. In 42 cases of B�cell lymphoma, few perforin and gr anzyme B positiv e cells scattered among tumor cells, in 11 cases and 14 cases, r espectiv ely. In 10 cases of per ipheral T�cell lymphoma, perforin and gr anzyme B posit ive w ere 8 cases and 9 cas� es, r espectiv ely. I n 11 cases of NK / T�cell lymphoma ( 2 cases in the tissue microarray, 9 cases routine sections) , both perforin and g ranzyme B w ere strongly positive. Both the expression in B�cell lymphoma, T�cell lymphoma and NK/ T�cell lymphoma w as signifi� cantly differ ent( P< 0�01) . Conclusions � Perfo rin and g ranzyme B are immune markers for the identification of activated cytotox ic cells, which also can be used as diagnostic markers of NK/ T�cell lymphoma. Their expr ession in B�cell lymphoma reflectes the anti� tumor immunologic react ion of host. �Key words � nose neoplasms; NK / T�cell; lymphoma; immunohistochemistr y; per for in; granzyme B 收稿日期: 2003 08 13 � 修回日期: 2003 12 01 作者单位: 1 南京军区南京总医院病理科,南京 � 210002 2 陕西超英生物医学研究开发有限公司,西安 � 710061 作者简介:石群立( 1959- ) ,男,主任医师,教授。研究方向: 淋巴造 血系统肿瘤病理。Tel: ( 025) 80861291, E�mail: shiqunli203 @ sohu. com � � 穿孔素( perforin, Pf)和颗粒酶 B ( granzyme B, GrB)主要存在于活化的细胞毒 T 淋巴细胞( Cyto� toxic T lymphocytes, CTL)和 NK细胞( nature killer cell)的胞质颗粒中,是活化的 CTL 和 NK细胞发挥 细胞毒性作用的主要效应分子。近来研究发现, Pf / GrB介导的细胞毒是机体抗肿瘤免疫的主要方式 之一∀1#。目前 Pf和 GrB被作为活化的 CTL 标记物 应用于淋巴瘤的诊断与研究中∀2, 3#。本研究运用免 疫组化技术检测鼻 NK/ T 细胞淋巴瘤中 Pf 和 GrB 的表达和分布情况,并探讨其意义。 1 � 材料与方法 1. 1 � 材料 � 收集南京军区南京总医院 2002年 1月 ~ 2003年 7月间病理活检的鼻 NK/ T 细胞淋巴瘤 标本 9例及陕西超英生物医学研究开发有限公司 ∃580∃ 临床与实验病理学杂志 � J Clin Exp Pathol � 2004 Oct; 20( 5) (简称超英公司)提供的淋巴瘤组织芯片中的 2例鼻 NK/ T 细胞淋巴瘤。诊断 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 按 WHO 淋巴瘤分类 的形态学及免疫组化标准∀4#。复习所有病例的临 床资料。同时与组织芯片中 58 例其他类型淋巴瘤 及 10例淋巴组织反应性增生进行比较研究。 1. 2 � 方法 � 所有肿瘤标本均经 10%中性福尔马林 液固定,常规石蜡包埋。9 例鼻 NK/ T 细胞淋巴瘤 和 10例淋巴组织反应性增生进行常规制片, HE 染 色;同时做 Pf、GrB、CD3、CD20、CD43、CD56、CD79� 免疫组化染色( S�P 法) , 并与组织芯片进行比较研 究。第一抗体及 S�P 试剂盒均购自福州迈新生物技 术开发有限公司。 将超英公司提供的 2 例鼻 NK/ T 细胞淋巴瘤 和 58例其他类型淋巴瘤标本参照 Kononen 等∀5#创 建的方法, 制成%淋巴瘤组织芯片&蜡块∀5, 6#, 连续切 成 4 �m 厚的组织芯片行 HE 染色和免疫组化标记 (采用 S�P 法) , 光镜观察(图 1)。免疫标记的第一 抗体为 Pf、GrB、CD3、CD20、CD43、CD56、CD79�。 GrB、Pf阳性对照为已知肿瘤性 NK细胞;阴性对照 为 10例淋巴组织反应性增生; 空白对照以 PBS 替 代第一抗体。 1. 3 � 结果判断 � Pf、GrB细胞质呈棕黄色颗粒为阳 性。CD3、CD56、CD79�细胞膜和细胞质呈棕黄色 为阳性, CD20 细胞膜呈棕黄色为阳性, CD43 细胞 质呈棕黄色为阳性。 1. 4 � 统计学方法 � 数据采用 2检验。 2 � 结果 2. 1 � 临床资料 � 9例鼻 NK/ T 细胞淋巴瘤中男性 4例,女性 5例。年龄 9~ 53 岁。组织芯片的 60例 淋巴瘤中 2 例鼻 NK/ T 细胞淋巴瘤均为男性。组 织芯片中的 60例淋巴瘤发生在淋巴结内者 48例, 淋巴结外者 12例(分别是胃肠 4例,鼻 2例, 肾脏 2 例,肺、脾、乳腺和扁桃体各 1例)。 2. 2 � 组织学及免疫表型 � 11例鼻 NK/ T 细胞淋巴 瘤病理组织学特征: 瘤细胞呈多形性、异型性(图 2, 3) ,散布或弥漫性分布, 常见瘤细胞嗜血管分布, 并 围绕血管呈%袖套样&改变, 易见凝固性坏死和多种 炎细胞浸润,瘤细胞表达 CD3(图 4)、CD56(图 5)及 CD43。 组织芯片(图 1)中另 58 例淋巴瘤中 B 细胞淋 巴瘤 42例, 其中弥漫性大 B细胞淋巴瘤19例、滤泡 性淋巴瘤 15例、套细胞淋巴瘤 3例、黏膜相关组织 型淋巴瘤 3例、淋巴浆细胞淋巴瘤 1例、脾边缘区淋 巴瘤 1例; T 细胞淋巴瘤 14例,其中外周 T 细胞淋 巴瘤 10例、T 淋巴母细胞淋巴瘤 2 例、间变性大细 胞淋巴瘤 2例。另外有 2例霍奇金淋巴瘤。主要类 型淋巴瘤的组织病理学特征: 弥漫性大 B 细胞淋巴 瘤为形态相对单一的大细胞组成(图 6) , 瘤细胞表 达 CD20和 CD79�。滤泡性淋巴瘤则由中心细胞和 中心母细胞以不同比例混合组成, 常呈明显的结节 状或弥漫性分布, 瘤细胞表达 CD20、CD79�、CD10 和 bcl�2。套细胞淋巴瘤由小~ 中等大小的异形淋 巴细胞组成,常呈弥漫性或结节状生长,瘤细胞表达 CD20、CD79�、CD5和 cyclinD1。外周T 细胞淋巴瘤 瘤细胞呈多形性、异型性, 胞质透亮, 核扭曲或呈佛 手状,瘤细胞表达 CD3、CD43及 CD45RO。间变性 大细胞淋巴瘤由大的明显异型的瘤细胞组成,表达 CD3、CD30、ALK1等。 2. 3 � Pf 和 GrB表达 � 11例鼻 NK/ T 细胞淋巴瘤 中均可见大量表达 Pf (图 7, 8)和 GrB(图 9, 10)阳 性细胞,且表达程度较高(部分阳性细胞数> 50%, 图 8, 10)。组织芯片中 42例 B细胞淋巴瘤有 11例 表达 Pf、14例表达 GrB,其表达程度较低(阳性细胞 数占1% ~ 10%) , Pf和 GrB阳性细胞均散在分布于 瘤细胞间,主要见于 B细胞淋巴瘤中的大 B 细胞淋 巴瘤伴有丰富的 T 细胞或以中心母细胞为主的滤 泡性淋巴瘤。10例外周 T 细胞淋巴瘤中 8 例见 Pf 阳性细胞、9例见 GrB阳性细胞,阳性表达程度也较 低(阳性细胞数占 1%~ 10%)。 2. 4 � 统计学检验 � 11例鼻 NK/ T 细胞淋巴瘤均广 泛表达 Pf和 GrB;而 10外周 T 细胞淋巴瘤中 8例 少量表达 Pf、9例少量表达 GrB, 两者比较, 差异有 显著性( P < 0�01)。42 例 B 细胞淋巴瘤组织中有 11例少量表达 Pf , 14例少量表达 GrB, 与对照组比 较无相关性( P> 0�05) ;而与鼻 NK/ T 细胞淋巴瘤 比较,差异有显著性( P< 0�01)。 3 � 讨论 � � Pf又名孔形成蛋白( pore forming protein) , GrB 属于丝氨酸蛋白酶家族成员, Pf 和 GrB两者协同发 挥杀伤靶细胞的细胞毒性作用。Pf 释放后当 Ca2+ 存在时,在靶细胞膜上聚合形成活性孔道,在靶细胞 膜内外形成明显的渗透压反差, 导致靶细胞胀裂而 死; GrB 也可通过此 Pf 形成的孔道进入靶细 胞 , 诱导靶细胞凋亡∀7, 8#。Pf和GrB均可存在于活 ∃581∃临床与实验病理学杂志 � J Clin Exp Pathol � 2004 Oct; 20( 5) 图 1 � 60例淋巴瘤组织芯片HE染色 � � 图 2 � 鼻 NK/ T 细胞淋巴瘤组织芯片组织学改变 � � 图 3 � 鼻 NK/ T 细胞淋巴瘤瘤细胞呈多样性 图 4 � 鼻 NK/ T 细胞淋巴瘤瘤细胞表达CD3 � � 图 5 � 鼻NK/ T 细胞淋巴瘤瘤细胞表达 CD56 � � 图 6 � 弥漫性大 B细胞性淋巴瘤相对单一 形态的大细胞呈弥漫性浸润 � � 图 7 � 鼻 NK/ T 细胞淋巴瘤瘤细胞表达 Pf � � 图 8 � 鼻 NK/ T 细胞淋巴瘤瘤细胞表达 Pf � � 图 9 � 鼻 NK/ T 细胞淋巴瘤瘤细胞表达 GrB � � 图 10 � 鼻 NK/ T 细胞淋巴瘤瘤细胞表达 GrB 化的 CTL 和 NK细胞胞质颗粒中。活化的 CTL 和 NK 细胞杀伤靶细胞时通常启用两种机制: 一是细 胞裂解( cytolysis) ,二是细胞凋亡( apoptosis)。其中 Pf / GrB介导的细胞毒途径是机体抗肿瘤的主要方 式之一,对于淋巴瘤也是如此∀9#。已有的研究表明 这种细胞毒作用对早幼粒细胞性白血病细胞和人组 织的淋巴瘤系 U937细胞均有明显的杀伤作用∀10#。 因此以 Pf和 GrB作为活化的 CTL 免疫标记物, 观 察它们在淋巴瘤组织中的表达程度和分布特点, 对 NK/ T 细胞淋巴瘤的诊断和鉴别诊断、T 淋巴细胞 在机体中抗肿瘤免疫的情况、判断淋巴瘤的预后及 指导治疗都具有一定的参考价值。WHO 淋巴造血 系统肿瘤的新分类∀4#是以独立疾病为基础进行分 类,在定义淋巴瘤中每一个独立疾病或类型时, 综合 了形态学、免疫表型、遗传学和临床特点。在对 NK/ T 细胞肿瘤分类中运用了 Pf、GrB与 TIA�1等 免疫标记物,通过免疫组化、原位杂交等方法,标记 不同活化程度 T 细胞或 NK 细胞, 以确定肿瘤细胞 ∃582∃ 临床与实验病理学杂志 � J Clin Exp Pathol � 2004 Oct; 20( 5) 的起源,从而指导淋巴瘤的分型及比较各型间区别 和联系∀11~ 14#。本实验表明: 11例鼻 NK/ T 细胞淋 巴瘤中, NK细胞源性和活化 T 细胞源性的肿瘤细 胞100%表达 Pf 和 GrB。所以对于 NK/ T 细胞淋 巴瘤, Pf和 GrB可以作为其诊断性的特异性免疫标 记物。本研究还观察到, 除鼻 NK/ T 细胞淋巴瘤 外,其他类型的淋巴瘤中(包括 9例外周 T 细胞淋 巴瘤、8例大 B细胞淋巴瘤、4 例滤泡性淋巴瘤等) 也见少量 Pf和 GrB阳性表达细胞,这类 Pf 和 GrB 阳性细胞均呈散在分布, 主要为非肿瘤性、反应的活 化的 CTL; 与本组 11例鼻 NK/ T 细胞淋巴瘤比较, 后者的Pf和 GrB阳性细胞呈弥漫性分布,且阳性细 胞均为异型的肿瘤性细胞, 与大 B细胞淋巴瘤、滤 泡性淋巴瘤、外周 T 细胞淋巴瘤有明显的不同。此 提示当肿瘤细胞过度表达 Pf和 GrB时,应考虑为鼻 NK/ T 细胞淋巴瘤或鼻型 NK/ T 细胞淋巴瘤。即 Pf和 GrB 免疫标记物在 NK/ T 细胞淋巴瘤的诊断 和鉴别诊断上具有非常重要的价值。 Pf / GrB介导的细胞毒途径是机体抗肿瘤的主 要方式之一, 观察非 NK/ T 细胞淋巴瘤中活化的 CTL 的表达程度和分布, 反映了机体抗肿瘤免疫的 情况。文献报道∀1, 15, 16#运用原位杂交和免疫组化 技术,检测滤泡性淋巴瘤、不同级别的胃黏膜相关淋 巴瘤( MALT�oma)、皮肤 T 细胞淋巴瘤中的 GrB 和 Pf表达情况,结果表明在非 NK/ T 细胞淋巴瘤中确 实存在活化的 CTL。Guidoboni等∀16#报道在高级别 的胃 MALT�oma 中 CTL 高于低级别的胃 MALT� oma。Weiss等∀17#认为 B细胞淋巴瘤可以提呈自身 的肿瘤相关抗原,而且在滤泡间区这种 CTL 的间接 活化机制是优先的。本研究观察到组织芯片中的 42例 B细胞淋巴瘤有 14例少量表达 Pf或/和 GrB 的细胞, 证实在 B 细胞淋巴瘤中存在着活化的 CTL。但肿瘤中 Pf和 GrB阳性表达细胞的多少、强 弱,是否与机体免疫状况有关,还有待于进一步研究 阐明。如前所述,非 NK/ T 细胞淋巴瘤组织中活化 的 CTL 的表达程度和分布,反映了机体抗肿瘤免疫 的情况,那么这和患者的预后是否有关? 现有的报 道在不同类型淋巴瘤中不尽相同。Diaz 等∀18#认为 当非霍奇金 B细胞淋巴瘤中有大量表达活化的免 疫细胞,即存在大量活化 T 细胞亚群时,患者预后 不良。Oudejans等∀19#认为结节状硬化型霍奇金淋 巴瘤或混合细胞型霍奇金淋巴瘤中的活化 CTL 百 分率高时则强烈地提示预后不良。相反 Vermeer 等∀1#则认为在皮肤 T 细胞淋巴瘤中存在有少部分 的活化的 CD8阳性 CTL,其比例越高, 患者 5年生 存率则越高。本研究发现: 凡中~ 高度恶性淋巴瘤, 如 NK/ T 细胞淋巴瘤、外周 T 细胞淋巴瘤、大 B细 胞淋巴瘤等的 Pf和 GrB表达明显高于惰性淋巴瘤 [如 MALT�oma、滤泡性淋巴瘤( ∋级)等] , 尤其是 11例 NK/ T 细胞淋巴瘤100%表达 Pf和 GrB, 本研 究结果与 Diaz 等∀18#观点相似, 故我们认为淋巴瘤 中活化的 CTL 多者则提示预后不良。但究竟淋巴 瘤中活化的 CTL 与患者预后的关系如何,还有赖于 更大批量病例的研究。我们认为: 以增强淋巴瘤组 织中这种机体自发的但并不一定有效的抗肿瘤免疫 应答,也许可作为临床上一个新的治疗方向,并可通 过重复活检, 检测 Pf / GrB 的表达, 以观察判断疗 效。 参考文献 1 � Vermeer MH, van Doorn R, Dukers D, et al . 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