胰岛素样生长因子1联合外源性转录因子诱导小鼠iPS细胞的研究

胰岛素样生长因子1联合外源性转录因子诱导小鼠iPS细胞的研究 胰岛素样生长因子1联合外源性转录因子诱导小鼠iPS 细胞的研究 分类号 学号 M200975686 学校代码 10487密级 硕士学位论文 胰岛素样生长因子-1 联合外源性转录因子诱导小鼠 iPS 细胞的研究学位申请人: 李 珍 学 科专业: 神经病学 指导教师: 张 苏明 教授 答辩日期: 2012 年 5 月A Dissertation Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements For the Degree of Master of Medicine The induction of mouse ips cells with insulin-like growth factor-1 and exogenous transcription factors Candidate : Li Zhen Major : NeurologySupervisor : Prof. Zhang Suming Huazhong University of Science and Technology Wuhan,Hubei430030, //.na MAY. 2012 独创 性声明 本人声明 所呈交的 学位论文 是我个人 在导师指 导下进行 的研究工 作 及取得的研究成果。尽我所知,除文中已经标明引用的内容外,本论 文 不包含任何其他个人或集体已经发 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 或撰写过的研究成果。对本文的 研 究做出贡献的个人和集体,均已在文中以明确方 式标明。本人完全意 识 到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名: 日期: 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、 使用学位论文的规定, 即: 学 校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版, 允许论 文 被查阅和借阅。 本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内 容 编入有关数据库进行检索, 可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存和 汇 编本学位论文。保密? ,在年 解密后适用本授权书。本论文属于不保密? 。 (请在以上方框内打“?” ) 学位论文作者签名: 指导教师签名: 日期: 年月日日期: 年 月 日 目 录 一、中英 文缩略词„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„1 二、前言„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„2 三、正文„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„4 A.胰岛素样生长因子-1 联合四因子 (OSKM) 诱导小鼠 iPS 细胞的研究„„„4 1、 中文摘要„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„4 2、 英文摘要„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„.5 3、 材料与方法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„6 4、结果„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„.13 5、讨论„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„. „„„„„„„14 6、 参考文献„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„.„16 B.胰岛素样生长因子-1 联合三因子 (OSK) 诱导小鼠 iPS 细胞的研究„„„„19 1、 中文摘 要„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„..19 2、 英文摘 要„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„..20 3、材料与方法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„21 4、结果„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„21 5、讨论„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„22 6、 参考文献„„„„„„„„„„„„„„„„„„. „„„„„„„24 四、 全文 小结„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„26 五、 综述„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„27 六、 致谢„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„39本课题 接受武汉市科技计划项目“ 消除人 胚 胎干 细胞 免疫 原性 开发 通用 型移 植种 子细 胞的研究” 的 资助(200860423216 )中英文缩略词 缩写 英文全名 中文名称 APalkaline phosphatase碱性磷酸酶 BSA Bovine Serum Albumin 牛血清白蛋白 c-Myc myelocytomatosis oncogene myc 基因家族一员DMSO dimethylsulfoxide二甲基亚砜 DMEM Dulbecco modified Eagle medium Dulbecco 改良 Eagle 培养基EBembryoid bodies 拟胚体 ESC embryonic stem cell胚胎干细胞 FBS fetal bovine serum胎牛血清 JAK Janus-associated tyrosine kinaseJansu 相关酪氨酸激酶 GFP enhanced green fluorescence protein 绿色荧光蛋白 iPS induced pluripotent stem 诱导性多潜能干细胞 IGF-1Insulin-like growth factor-1 胰岛素样生长因子-1 Klf4 Kruppel-like factor 4Kruppel 样因子 4LGL- Glutamate L- 谷氨酰胺 LIFleukemia inhibitory factor 白血病抑制因子 MEF mouse embryonic fibroblast 小鼠胚胎成纤维细胞 NEA nonessential acid 非必需氨基酸 Oct-4 Octamer motif 4 POU 转录因子家族PDGFplatelet-derived growth factor 血小板源生长因子 PBS phosphate buffer saline磷酸缓冲液 STAT3 signal transducer and transcription 3信号转导与转录激活因子 3 Sox2SRY sex determining region Y-box 2 SOX 基因家族一员 1胰岛素样生长因子-1 联合外源性转录因子诱导小鼠 iPS 细胞的研究 华中科技大学同济医学院附属同济医院 硕 士研究生: 李 珍 硕 士生导师:张苏明 前 言 使用干细胞移植治疗难治性疾病一直是再生医学关注与研究的热点。 作为干 细胞最佳来源的胚胎干细胞具有自我更新性, 可以分化为任何细胞类型, 被认为 是理想的种子细胞。 但由于它的取材必须破坏胚胎, 在伦理道德上备受争议, 且 存在免疫排斥的可能,这两大瓶颈就极大限制了胚胎干细胞在临床的应用推广。 2006年, 诱导性多潜能干induced pluripotent stem,iPS 细胞技术的成功 问世, 为干细胞移植的临床应用带来了新的曙光。Yamanaka 通过 逆转录病毒载体将4个 与胚胎干细胞多能性密切相关的基因Oct4,Sox2,c-Myc 和Klf4导入到小鼠胚胎成 纤维细胞,成功地将其重编程为具有胚胎干细胞多能性的细胞-iPS 细胞。iPS 细 胞表达胚胎干细胞的标记性基因,如Sox2、Oct4 、Nanog等, 具有经典的胚胎干细 胞形态, 细胞集落扁平、 紧密、 形 状比较规则 近似圆形; 细胞核占胞质的比例很 大,且有明显的核仁。 除了形态方面的相似之处,iPS 细胞与胚胎干细胞在功能执 行上也近乎相同, 两者均具有自我更新性和增殖能力, 具有多能分化潜力, 能够 分化成三个胚层;均可以形成拟胚体,畸胎瘤以及嵌合体小鼠。 iPS 技术可以直接从自身取材 (比如皮肤细胞) , 通过在皮肤细胞中过表达外 源性转录因子(Oct4, Sox2, c-Myc 和Klf4 )使 皮肤细胞逆向分化为具有向三个胚 层分化能力的类胚胎干细胞。 由于其是自体取材, 故而直接避开了伦理学和免疫 原性的问题。但是围绕着iPS 细胞能否替代胚胎干细胞顺利的应用于临床,尚需 解决两大主要问题:1. 诱导效率低下。 传统的诱导效率仅为0.01% , 无法产生足 2够数量的细胞满足临床需要。2. 致癌性。 外源性癌基因 (c-Myc 、Klf4)以及逆 转录病毒载体的使用。 逆转录病毒载体可携带外源基因,将其随机整合到宿主基 因组中,引发宿主基因组DNA 的 插入突变, 导致获得的iPS 细胞在应用过程中具有 产生肿瘤的风险。 研究证明,iPS 细胞诱导成功的关键主要在于阻止靶细胞的衰老和凋亡;促 进细胞周期G1/S 期的转变以保持细胞的增殖; 多能性基因的激活以及染色体功能 性端粒酶保持活性等。 值得一提的是, 胰岛素样生长因子-1((IGF-1 ) 作为机体 发育过程中的一类重要生长因子, 研究表明其能够维持机体多种细胞的功能, 具 有较强的抗凋亡作用; 而且可以维持干细胞的自我更新和多向性分化, 阻止干细 胞的凋亡,促进G1/S 期转变,以及增加端粒酶的活性。 故本实验以小鼠胚胎成纤维细胞为靶细胞,利用IGF-1联合外源性转录因子 (Oct4,Sox2,c-Myc 和Klf4 )诱导iPS 细胞,研究IGF-1可否提高iPS 细胞的诱导效 率; 另外, 在此基础上, 为降低iPS 细胞的致癌性, 去除癌基因c-Myc 的使用, 研 究可否利用IGF-1联合外源性转录因子(Oct4,Sox2,和Klf4 )诱导较安全的iPS 细 胞,为将来的临床应用打下基础。3第一部分 胰岛素样生长因子-1 联合四因子(OSKM )诱导 小鼠 iPS 细胞的 研究 中文摘要 目的 :研究 胰岛素样生长因子-1 (IGF-1) 在 iPS 细胞重编程过程中的作用。 方法 :1.利用含 IGF-1 的成纤维细胞培养基培养小鼠成纤维细胞 3 天,此为实验 组。 2.利用不含 IGF-1 成纤维细胞培养基在相同条件下培养小鼠成纤维细胞 3 天,此为对照组。 3.分别对两组成纤维细胞用含 Oct4 ,Sox2,Klf4 和 c-Myc 因子的四种逆 转录病毒颗粒进行感染,对形成的 iPS 细胞进行鉴定。 结果 :对照组感染 病毒 后 第21 天出 现 类似 胚 胎干embryonic stem ;ES 细胞形态 的克隆,共计4 个克 隆出现 ,诱 导效 率 约为0.01% 。IGF-1 处理后的实 验 组感染病 毒 后第18 天 出现 类似ES 细胞形态的克隆, 共 计15 个克隆 出现 ,诱 导效率 约 为 0.05% 。 实验组的AP 染色及SSEA-1、Oct4染色鉴定均为阳性, 且诱导效 率较对照 组提高近5倍。 结论 :IGF-1 在 iPS 细胞重编程中发挥着重要作用,其可以提高四因子体 系的诱 导效率。 关键词 :胰 岛素样生长因子-1 诱导多潜能干细胞 诱导效率 4PART I Reprogramming of mouse fibroblasts to pluripotent stem cells using Oct4 ,Sox2,c-Myc,Klf4 in combination with insulin-like growth factor-1Abstract Objective: To determine the effects of insulin-like growth factor-1 on nuclear reprogramming Methods: Use fiber cell medium containing insulin-like growth factor-1 to culture mouse fibroblasts (MEF ) for three days; under the same condition,use fiber cell medium without containing insulin-like growth factor-1 to culture MEFfor threedays as a negative control; Finally, infected MEF with retroviruses expressingOct4, Sox2, Klf4, and c-Myc. Evaluate the formed iPS clones Results: The iPS cells were successfully obtained using insulin-like growth factor-1on the eighteenth day after infection.The induction efficiency is about0.05%,whichwas nearly five times.more efficiently than the control group.Morover, APstaining, SSEA-1andOct4 staining of the experimental group were positiveConclusion: Insulin-like growth factor-1 play an important role in the reprogrammingof iPS cells,it can improve the efficiency of four-factors induction system Key words : iPS cells, insulin-like growth factor-1, reprogramming efficiency 5材料与方法 一、 实验材料 (一)主要仪器 超净细胞工作台:苏州苏洁净化设备公司 37?细胞培养箱:Thermo 公司 超纯水机:Millipore 公司 超低温冰箱:SANYO 公司 台式离心机:Sigma 公司 恒温水浴箱:北京医疗设备厂 实验烤箱:上海耐美特公司 倒置荧光显微镜:Olympus 公司 移液枪:Eppendorf 公司 200ml 细胞培养瓶:CORNING 公司 六孔细胞培养板:CORNING 公司 15ml 细胞离心管:CORNING 公司 3.5cm 细胞 培养皿:CORNING 公司二主要材料及试剂 1.主要材料:昆明孕鼠:由武汉大学医学院实验动物中心提供; plat-E 细胞(逆转录病毒包装细胞) :购自广州赛业有限公司; 小鼠胚胎 干 细胞系 ES-D3 :本实验室冻存 含逆转录病毒载体 GFP 菌液:本实验室冻存 含逆转录病毒载体 Oct4 菌液:本实验室冻存; 含逆转录病毒载体 Sox2 菌液: 本实验室冻存; 含逆转录病毒载体 c-Myc 菌液: 本实验室冻存; 含逆转录病毒载体 Klf4 菌液: 本实验室冻存; 2.主要试剂: DMEM/F12 培养基 (Hyclone 公司) ; 优质胎牛血清 (Hyclone 公司) ;DMEM 6高糖培养基 (Hyclone 公司);; 青链霉素 (Hyclone 公司); IGF-1 因子 (peprotechasia 公司); 小鼠胚胎干细胞专用胎牛血清 (Gibco 公司) ;Lipofectamine 2000 脂质体 转染试剂 (Invitrogen 公司)β- 巯基乙醇 (Sigma 公司) ; 非必需氨基 酸 (Hyclone 公司) ;Polybrene : (sigma 公司) ;重组 人白 血病抑 制因 子(Chemicon 公司 ) ; L- 谷氨酰胺 (Hyclone 公司 ) ;0.25% 胰蛋白 酶 (吉诺生 物医药有限 公司 ) ;丝裂 霉素(同济医院药房) ;DMSO (Sigma 公司 ) ;DAPI (sigma 公司 ) ;嘌呤霉素 (本实验保存) ; 杀稻瘟素 (德国默克公司) ; 质粒提取试剂盒 (天根生化科技 有 限公司) ; 碱性磷酸酶鉴定试剂盒 (北京中山金桥生物有限公司) ;Oct-4,SSEA-1 鉴定试剂盒(Chemicon 公司);兔抗小鼠 IgG-FITC (北京中山金桥生物有限公 司) ; 外胚层抗 βIII tubulin 单克 隆抗体 (Millipore 公司 ) ; 兔抗小鼠 IgG-TRIC (购 自北京中山金桥生物有限公司 ) ; 中胚层 抗 α-smooth muscle actin 多克隆抗 体 (Abcam 公司) ;内胚层抗 α-fetoprotein 单 克隆抗体(R&D Systems 公司) ; 3.主要试剂的配置 ?MEF 细胞培养基的配制:DMEM/F12,10%胎牛血清,2%青链霉素。4?保存。 ?小鼠胚胎干细胞培养基的配制:DMEM 高糖,15%FBS,1%NEAA,1%青链霉 素,1%L-G, 1?β- 巯基 乙醇, 保存在 4?冰箱。使用前吸出 50ml 培 养基加入 50ulLIF 配成完 全培养基 LIF 终浓度为 1000U/ml 。 ?无抗培养基的配制:DMEM 高糖, 10%胎牛血清,保存在 4?冰箱。 ?plat-E 细 胞培养基的配制: DMEM 高糖, 10%胎牛血清,0.1?10mg/ml 的嘌呤霉 素,1%青链霉素,1?10mg/ml 的杀稻瘟素,保存在 4?冰箱。 ?含IGF-1因子的MEF 培养基: 50mlMEF 培养 基中加入50ul IGF-1因子(40ng/ul ) , 使其终浓度为40ng/ml, 保存在4?冰箱。 ?MEF 细胞冻存液的配制: 将 MEF 培养基与 DMSO 按 9:1 的比例配制而成 , 保存在 4?冰箱。 ?小鼠胚胎干细胞冻存液的配制:5ml 冻存液中,DMSO 按 10% 的比例即 0.5ml 添加,余下的液体 4.5ml 用小鼠 胚胎干细胞全培养基配置,保存在 4?冰箱。 ?plat-E 细胞冻存液的配制:10ml 冻存液中,DMSO 按 10% 的比例即 1ml 添加, 余下的液体 9ml 用 plat-E 培养基 配置,保存在 4?冰箱。 7?丝裂霉素液配制:将粉末状的丝裂霉素 2mg 加入 4ml 灭菌后的 PBS , 浓度 为 0.5mg/ml ,按 50ul 分装,避光保存在 4?冰箱。制作饲养单层细胞时,2.5ml 细 胞培养基中加入 50ul 丝裂霉素。 ?PBS 液体 的配制:每升超纯水中加入 NaCL 8g/L, KCL 0.2 g/L,Na2HPO4 1.44 g/L,KH2PO4 0.24 g/L ,室温下保存。 ?LB 液体 培养基的配制:100ml 超纯水中加入 1g 胰蛋白胨,0.5g 酵母提取物, 高压灭菌,冷却后保存在 4?冰箱。提取质粒前,加入 100ul 氨苄青霉素。 二、实验方法及步骤 (一)成纤维细胞的培养 A.原代培养: 1.将孕龄 12-14 天的昆明孕鼠快速脱颈处死,用 75%的酒精浸泡 3min。 2 . 打 开腹腔 , 可 以见到 暴露 的子宫 ,剪 开子宫 , 取出胚胎 , 分 离胎膜 ,拿出 胎鼠。 3 . 手持两把弯捏 分离掉 胎鼠的头,尾,四肢,然 后 分离躯 干 部 的皮肤 ,放入 盛有 PBS 的细胞培养皿中清洗 3 遍。 4. 将清洗干净的胎鼠皮肤移到 2ml EP 管中, 手持小直剪剪碎组织,转移至离 心管中,离心 1000rpm,5min。 5.倒掉上层清液后,加入含 EDTA 的 0.25% 的胰酶 3ml ,吹打消化 5min。 6.加入 3mlMEF 细胞培养基进行中和,反复轻柔吹打。 7.将吹打完毕的离心管放入离心机中,1000 rpm,5min 离心。 8. 轻轻倒掉上清, 用吸管吸取残余上清, 再加入适量的 MEF 培养基吹打细胞 沉淀,将细胞悬液接种到 50ml 细胞培养瓶中。 9.放入 37?,5%CO 培养箱培养。 2 B.传代: 1.倒掉旧培养基,加入 PBS 冲洗 2 遍。 2.添加 2ml 含 EDTA 的 0.25%胰蛋白酶, 常温下消化 2-3min, 置于显微镜下 观察,轻轻拍打培养瓶,当细胞变圆并开始脱落时,立刻加入等量的 MEF 培养 基进行中和,同时用吸管反复轻柔吹打,避免吹打出泡。 83.将吹打完毕的细胞悬液吸到离心管中, 放入离心机中, 1000 rpm 5min 离心。 4.轻轻弃掉上清,加入适量的 MEF 培养基吹打细胞沉淀,按 1:2 或 1: 3 的 比例将重悬的细胞加入到培养瓶中,放入细胞培养箱中。 C.冻存(例如冻存6 瓶细胞) : 1.配制含20%DMSO 的冻存液: 总共需要冻存液为6ml,DMSO 的终浓度为10%, 因此加入DMSO 0.6ml,MEF 培养基 2.4ml,配制后放入4?冰箱中。 2.倒掉旧培养基,加入 PBS 清 洗 2 遍。 3.添加 2ml 含 EDTA 的 0.25%胰蛋白酶,常温下消化 2-3min,置 于显微镜 下观察,轻轻拍打培养瓶,当细胞变圆并开始脱落时,立刻加入等量的 MEF 培 养基进行中和,同时用吸管反复轻柔吹打,避免吹打出泡。 4.将吹打完毕的细胞悬液吸到离心管中,放入离心机中,1000 rpm 5min 离 心。 5.轻轻倒掉上清, 用 3mlMEF 培 养液重悬细胞, 分别向 6 只冻存管中均匀加 入 0.5ml 细胞重悬液。 6.取出含20%DMSO 的冻存液,每个冻存管中加入 0.5ml 的冻存液。 7.做好标记, 放入冻存 盒中于-80?保存, 如 需长期保存, 要隔夜后 转到液氮 罐中。 D.复苏 1.从液氮罐中取出冻存的细胞, 将冻存管头部的液氮倒出后, 迅速放入 40? 左右的温水中,摇晃使冻存管中的液体快速溶解。 2.将溶 解的 液体吸 入 15ml 离心 管 中,加 入 3-5ml 的 MEF 细 胞培 养基, 1000rpm,5min 离心。 3.倒掉上清,用 MEF 培养基重悬细胞,接种到 50ml 培养瓶中。4. 放入 37?,5%CO 培养 箱中。 2 (二)饲养单层的制备 1.倒掉旧培养基, 用 PBS 清洗 2 遍。2.5ml 培养基中加入 50ul 丝裂霉素, 于 37?,5%CO 培养箱中放置 2.5h。 2 2.弃掉加入丝裂霉素的培养基,用 PBS 冲洗 6 遍,清洗残余的丝裂霉素。 3.添加 2ml 含 EDTA 的 0.25%胰蛋白酶, 常温下消化 2-3min,置于 显微镜下 9观察, 轻轻 拍打培养瓶 ,当 细胞变 圆 并开始脱 落 时,立 刻加入等量 的 MEF 培养基进行中和, 同时用吸管反复轻柔吹打, 避免吹打出泡。 将细胞悬液吸 入离心管中,放入离心机中,1000 rpm 5min 离心。 4.轻轻弃掉上清,加入适量的 MEF 培养基吹打细胞沉淀,按 1:1 的比例加 入到 50ml 培养瓶中,放置于 37?,5%CO 培养箱中。 2 (三)小鼠胚胎干细胞的培养 A .复苏1. 从液氮罐中取出冻存的细胞, 将冻存管头部的液氮倒出后, 迅速放入 40? 左右的温水中,摇晃使冻存管中的液体快速溶解。 2. 将溶解的液体吸入 15ml 离 心管中,加入 3-5ml 的含 LIF 胚胎干细胞培养 基,800 rpm,5min 离心。 3. 倒掉上清,用含 LIF 胚胎干细胞培养基重悬细胞,接种到饲养层细胞中。 4放入 37?,5%CO 培养箱培养。 2 B. 传代 1.倒掉培养基,PBS 冲洗 3 遍。 2.先用不含 EDTA 的 0.25% 胰蛋白酶常温消化 2min,轻轻晃动培养瓶,于 显微镜下观察, 当大部分小鼠胚胎干细胞从饲养层细胞脱落时, 用吸管将其吸至 离心管内。 3.加入等量的含 EDTA 的 0.25% 胰酶反复轻柔吹打成单细胞悬液 1-2min。 4.加入不含 LIF 的胚胎干细胞培养基进行中和,800 rpm,5min 离心。 5. 轻轻倒掉上清, 加入适量的含 LIF 的胚胎干细胞培养基吹打细胞沉淀, 按 1:4 或 1:6 的比例接种到新的饲养单层上。 6放置到 37?,5%CO2 培养箱中过夜。 (四)PLAT-E 细胞的培养 1. 将 50ml 培养瓶铺上多聚赖氨酸中 37?,5%CO2 培养箱中,静置 2-3h。 2. 每天用 PLAT-E 细胞培养基进行换液。 3. 当细胞 融合度在 60% 左右时,如果明日 要进行转染 ,则换用无 抗培养基 培养。 (五)含逆转录病毒载体质粒Oct4,Sox2,c-Myc ,Klf4 ,GFP 的扩增 101. 用枪头吸取适量菌液, 接种于装有 10 ml LB 培养基 的离心管中, 放入摇 床中,37?,250rpm , 振荡 14-16h。 2. 如 若保存 菌液 ,可 将菌液 转移 到 2 ml EP 管中 。 将剩余的 菌 液 离心, 10000rpm×1min 。 3. 轻轻弃掉上清, 在 2 ml EP 管中加入 500 μL solution ? , 吹打均匀,震荡 1 min。 4. 向上管中加入 500 μL solution ? , 混匀后颠倒 8 次, 于室温下放置 2 min。 5. 加入用冰预冷过的 buffer N3 250 μL , 混匀后上下颠倒,直至出现白色沉 淀,13400rpm×12min 离心。 6. 吸取上清 1250ul 到 1.5ml EP 管中 , 在加入 ETR solution125 μL 后, 上下 颠倒 8 次,置于冰上 10 min 。 7. 在 42?水浴箱中再放置 5min 后 12000rpm×3 min 离心, 可以看到 ETR 沉 在 EP 管底。 8. 吸取上清 1200ul 到 2ml EP 管中, 加入 600μL 无水乙醇, 上下颠倒 8 次, 常温下静置 2min 。 9. 取吸附柱放入一个 2ml 的 EP 管中, 将上述液体加入 700μL 到吸附柱中, 放入离心机中,10000rpm×1 min。 10.重复步骤 9 至过滤完混合液。 11. 弃 掉 EP 管中的废 液, 加入 Buffer HB500μL, 放入离心机 中 10000rpm×1min 。 12. 弃 掉 EP 管 中的 废液, 加入 Wash Buffer700μL , 放 入 离心机中 10000rpm×1min。 13.重复 12 步骤。 14.弃掉废液,将空吸附柱放入离心机中,13000rpm×3min。 15.把吸附柱转移到一个新的 1.5ml EP 管中, 加入 Elution Buffer60μL , 室温 下静置 2min ,再次离心,13000rpm×1min。 (六)逆转录病毒的包装 A.转染 1. 按质粒(μg) :脂质体μL 为 8:20 的比例,计算需加的质粒量。 112.取 4 只 2mlEP 管,向 4 只管中分别加 20ul 脂质体。 3.再加 500ulOPTI ,吹打均匀,静置 4 分钟。 4.再取 4 只 2mlEP 管,做好标记(O 、S 、K 、M ) 5.对应的向 4 只管中加入相应的质粒。 6.再加 500ulOPTI ,吹打均匀。 7.将前 4 只 EP 管中的溶液加入到后 4 只 EP 管中,吹打均匀(不要起泡) , 静置 20min8.取 4 瓶 PLAT-E 细胞(融合度 60%-80% ) , 将培养基倒掉,加入 5ml 无抗 培养基。 9.20min 到时, 将 EP 管中的溶液加到 4 瓶细胞中, 放到 37?,5%CO2 培养 箱中,静置 48hB. 收病毒 1.取 10ml 注射器,将孔径为 0.45μm 的滤放在 15ml 离心管上。 2.用注射器将病毒液吸出,注意要将培养瓶反置,即在不含细胞的平面吸。 3.重复以上步骤,依次过滤完 4 种病毒。 4.在准备感染之前,向过滤后的病毒液加入 8mg/ml 的 polybrene 。 (七)iPS 细胞的诱导 4 1.按 3×10 个细胞/ 孔的密度将成纤维细胞接种到种有饲养单层的六孔板中。 2.用无抗培养基培养,放到 37?,5%CO2 培养箱中培养 24h。 3.每孔中加入四种病毒Oct4 , Sox2, Myc , Klf4 各 250μL 进行感染, 放到 37?,5%CO2 培养箱中静置 12h。 4.弃掉病毒液,换无抗培养基培养 6h,重复上述步骤两次。 5.每天换用含 LIF 的胚胎干细胞培养基培养。 (八)iPS 细胞 AP 鉴定 1.将六孔板内 iPS 细胞培养基吸掉,用 PBS 洗 3×5min. 。 2.用 4%多聚甲醛固定,室温下放置 15min。 3.用 PBS 洗 2×5min 。 4.在 EP 管中分别滴加 50μL 试剂 A 和 50μL 试剂 B , 室温孵育 5min。 5.在上述混合液中加入 2ml 双蒸水。 126.再加入 100μL 试剂 C ,将其混匀,此即为底物混合液。 7.加底物混合液室温孵育 30min 后,显微镜下观察拍照。 (九)iPS 细胞 SSEA-1 鉴定 1.用 PBS 清 洗 3×5min 。 2.添加 4%多聚甲醛在室温下固定细胞 15min。 3.再加 PBS 洗 5min,共 3 次,尽量将多聚甲醛清洗干净。 4. 5%BSA 封闭液封闭,常温下 30min(湿盒中) 。 5. 加入 1:100 稀释的抗 SSEA-1 一抗,放入湿盒中在 4?冰箱中过夜。 6.第二日,加 PBS 洗 5min,共 2 次。 7. 再加 1:100 稀释的 FITC 标记的二抗,室温下避光放置 1 h(湿盒中) 。 8.加 PBS 洗 5min,共 2 次。 9.DAPI 染 核,5min。 10. PBS 洗 5min ,共 2 次。 11.置荧光显微镜观察。 (十)iPS 细胞 OCT4 鉴定1.用 PBS 洗 3×5min 。 2.加入 4%多聚甲醛室温固定 15min。 3.用 PBS 洗 2×5min 。 4.加 0.2%Triton-100,室 温下放置 10min 后,用 PBS 洗 2×5min。 5.余步骤同上。 实验结果 1. iPS 细胞的诱导 对照组感染病毒后第21 天出现类似胚胎干embryonic stem ;ES 细胞形态的 克隆,共计 4 个克隆出现,诱导效率约为 0.01% 。IGF-1 处理后的实验组感染病 毒后第 18 天出现类似 ES 细胞形态的克隆, 共计 15 个克隆出现, 诱导效率约为 0.05% 。 。 对照组感染病毒后第 21 天及实验组感染病毒后第 18 天出现的 iPS 细胞 形态见图 A 、图 B 。 132.实验组 iPS 细胞的 AP ,SSEA-1 ,Oct4 染色鉴定 对 iPS 细胞进行 AP 染 色,Oct4 及 SSEA-1 染色,结果(图 C )均为阳性。 AB 图 A :用四因 子(Oct4, Sox2, Klf4 和 c-Myc)诱导 iPS 细胞 图 B :用IGF-1 联合四因 子诱导 iPS 细胞 AP 鉴定 SSEA-1 染色 DAPI 染色 Oct4 染色 DAPI 染色 图 C IGF-1 联合四因子诱导获得的 iPS 细胞的 AP,SSEA-1 和Oct4 鉴定 讨 论 本实验成功的运用胰岛素样生长因子-1联合四因子 (OSKM) 将小鼠成纤维细 胞诱导为iPS 细胞, 与传统的诱导效率相比提高近5倍, 为深入研究胰岛素样生长 因子-1如何在iPS 细胞诱导中发挥作用奠定了基础。 近年来围绕着如何解决iPS 诱导效率低下和致癌性这两大难题,开展了多方 14面的探索,比如进一步寻找新的诱导因子,建立新的诱导载体,简化诱导体系, 以提高诱导的效率和安全性。 最近研究发现一些小分子化合物可以通过调控细胞 [1] 内源性转录因子的表达数量,来提高诱导效率。VPA (组蛋白脱乙酰化酶抑制 [2] [3] 剂),5-aza-cytidine ( DNA 甲基 转移酶抑制剂) ,BIX-01294 (组 蛋白甲基转 [4] 移酶抑制剂)以及vitaminC ,它们的使用均可以使iPS 细胞的诱导效率大大提 高。某些小分子化合物甚至可以替代4种转录因子中的部分因子的功能, 减少参 与的重编程因子数量, 如丙戊酸VPA, 它是一种组蛋白脱乙酰基酶抑制剂,可以 诱导基因组水平的乙酰化,引起细胞的染色体结构松弛,这种结构就有利于下游 次级转录因子的结合, 从而提高重编程效率。VPA同Oct4、 Sox2一起作用还可将 [5] 人成纤维细胞重新编程为iPS 细胞 。这种方法不仅提高了诱导效率,而且大大 降低了iPS细胞的致癌性。 本实验中采用的胰岛素样生长因子-1 是机体发育过程中的一类重要的生长 [6-8] [9-11] 因子, 在生理情况下参与维持细胞的多种功能 , 有较 强的抗凋亡作用 , 可 [12,13] 以维持干细胞的自我更新和多向性分化,阻止干细胞的凋亡 。研究证明 iPS [14,15] 细胞诱导成功的关键之一在于阻止靶细胞的衰老和凋亡 , 于是我们设想是否 可以将胰岛素样生长因子-1 引入到iPS 诱导体系中, 从而提高细胞的诱导效率。 通过对多个培养细胞, 转基因动物模型和临床样本的研究, 表明 IGF-1 能够激活 [16] G1/S 期的转变和维持细胞增殖 ,IGF-1 和 PDGF 共同 作用激活 c-Myc 的表达, [17] 促进 DNA 的合成和细胞增殖 ,而且 IGF 能够促进 iPS 细胞诱导过程中所需的 [18] 组蛋白 H3 和 H4 乙酰化 ;同时,IGF-1 受 体的激活还能增强 Oct4 等多能性干 细胞标记因子的表达, 通过增加细胞增殖和阻止细胞凋亡, 促进胚胎干细胞的扩 增。 此外,IGF-1 还能够调节白细胞, 肌细胞, 祖细胞和干细胞等多种细胞的端 [19,20] [21] 粒酶活性 ,其可通过 PI3 激酶/Akt 信号通路使端粒酶的活性提高 14 倍 。 故 IGF 有可能通过激活和增强 c-Myc 及 Oct4 等基因的表达, 促进 G1/S 期转变, 以及增加端粒酶的活性等多方面作用来促进 iPS 细胞的诱导, 提高 iPS 细胞诱导 效率。 本实验的成功充分肯定了胰岛素样生长因子-1 在 iPS 细 胞诱导中所发挥 的 积极作用。但是 胰岛素样生长因子-1 联合四因子的诱导体系相比传统而言 过于 复杂, 我们试图在此实验的基础上进一步优化 iPS 细胞的诱导体系, 采用 胰岛素 15样生长因子-1 联合三因子(OSK)诱导 iPS 细胞的方法,去除癌基因 c-Myc,力 求降低 iPS 细胞的致癌性。 16参考文献 [1] Huangfu D,Maehr R,Guo W, et al. 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