166 C址n J G en S u 攻 , Mav 199 8 , V OI . 13 , N o . 3
大 鼠肝细胞的分离 、短期培养及异体移植
治疗实验性急性肝功能衰竭
彭吉润 于聪慧 魏韬哲 魏玉华 朱继业 冷希圣
目的 研究分离 Sp r agU e 一Daw ley (sD )大鼠肝细胞的方法及短期培养后对细胞活力的影响 , 并研究新
鲜分离的同种异体肝细胞移植对实验性急性肝功能衰竭的治疗作用 。 方法 采用胶原酶原位循环灌注
法分离肝细胞 ; 游离肝细胞在合成 R PM I 164 0 培养基内培养 6 天并测定细胞内生化指标 ;用 D 一氨基半乳
糖将 60 只雄性 SD 大鼠制成急性肝功能衰竭模型并随机均分为移植组和对照组 , 将新鲜离体肝细胞悬
液注人移植组大鼠腹腔内 , 对照组则注人等量生理盐水 , 观察两组长期存活率的差异并进行扩检验 。
结果 游离肝实质细胞 (heP at oc yt e )的纯度可达 95 % , 细胞活率约 85 % 一 95 % , 平均每只大鼠移植肝细
胞 2 . 5 x lo “一 2 . 8 x l沪个 ; 经过短期培养 , 肝细胞内的丙氨酸转氨酶 、碱性磷酸酶仍具有较高活力 , 且肝
细胞仍具有合成蛋白质及胆红素的能力 ; 接受肝细胞移植的大 鼠存活率 (40 . 0 % )显著高于对照组
(13
.
3 % )(尸 < 0 . 0 1)。 结论 用上述方法分离的肝细胞纯度 、细胞活率均较高 , 行同种异体肝细胞移植
对大鼠急性肝功能衰竭有明显的治疗作用 。
关键词 肝细胞 肝功能衰竭 细胞移植
T he 七旧l心 o n , s h o rt 一te恤 c u】tu r e o f h ePat oc yte s an d al lo g rsft tr a盯‘p l朋加6皿 of fr e sh Pre Pa re d r a t be p .
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e ll tra n s plan tat ion
为 了获得可用于异体移植治疗实验性急性
肝功能衰竭 的肝细胞 , 作者用胶原酶原位灌注
法对大鼠肝细胞进行 了分离 、纯化及短期培养 ,
进行了异体移植肝细胞治疗实验性急性肝功能
衰竭的初步研究 。 现报告如下 。
材料与方法
本课题为国家自然科学基金资助项 目
作者单位 : 1侧叉目鸿 北京 医科大学人民医院普通外科 (彭吉
润 、于聪慧 、魏玉华 、朱继业 、冷希圣 ); 河南医科大学第一 附属
医院普通外科 (魏韬哲)
一 、材料
1
. 动物 : 雄 性 孙ra gu e 一D aw ley 大 鼠 , 体重
200
一
30 0 9
, 购 自北京医科大学动物中心 。
2
. 主要试剂 :胶原酶 (Co ll昭e n as e w ) , D NA
中华普通外科杂志 1 998 年 5 且第 13 卷第 3 期
酶 (D N as e l ) 及 D 一氨 基 半乳 糖 (D 一G a la e -
to s
am i
n e
)均购 自 5 1脚a 公 司 , R p M I164 0 培养基
为 G IB CO 产品 。
3
. 仪器 : H~
u , 二氧化碳恒温孵育箱 (上
海产 ) , 岛津 CK 一7仪K) 型 自动生化分析仪 (日本
产) , 奥林帕斯 ix 一70 倒置相 差 显 微镜 (日本
产 ) , 科尔 ·帕默恒 温水浴箱 (美 国产 ) , LD S一ZA
型离心机 (北京产 ) , D D B 一 300 型 多通 道电子蠕
动泵(浙江产 )。
二 、肝细胞的分离及纯化
参照 Se glen 的方法并做了部分改进〔’〕。 大
鼠用 2 % 戊巴 比妥钠溶液 30 m g/ k g 体重腹腔注
射麻醉 , 同时腹腔内注射 Zoo U 肝素钠溶液 。 消
毒皮肤后 , 取正 中切 口 切开腹腔 。 显露游离 门
静脉后在距肝门 2 c m 处插人一 18 号导管 , 用
D一an k。 液 (含 0 . 0 1% E D以 、 3 7℃ 、 pH 7 . 4 , 通
以含 9 5 % O : 及 5 % CO : 的混合气体 )以 2 0 m l/
m in 的速度灌入 , 随后 于肝下后腔静 脉插人一
16 号导管放出积血积液 , 并剪开胸腔 , 夹闭肝
上后腔静脉 。 灌注 5 分钟后将灌注液 改为含
0
.
0 5 % C oll
a罗n as e 及 0 . 0 1% D N as e l 的 H a n k s
液 (37℃ 、PH 7 . 4 , 通以含 9 5% 0 : 及 5 % CO : 的
混合气体)持续灌注 5 分钟。 取下肝脏 , 置于含
4℃ H a n ks 液的平皿中 , 剪去肝被膜 , 梳下肝细
胞 , 以单层无菌纱布过滤 , 制成混合细胞悬液 。
将灌注剩余的胶原酶溶液加人 悬液 中 , 并 以
Han k。液将总量调至 100 ml , 置于 37 ℃ 恒温水
浴中孵化 10 分钟 , 然后 , 将此悬液 以 100 目及
2(X) 目不锈 钢网过 滤 , 分 装于 3 一 4 个离心 管
中。 以 5 00 rp lrl 离心 2 分钟 , 弃上清 , 以 4℃
H an k , 液重悬 , 清洗并反复离心 3 次 , 再 以 4 ℃
H an ks 液重悬 , 做细胞涂片行 H E 染色判断肝实
质细胞纯度 , 用 0 . 4 % T口p a n Bl u e 染色判断细
胞活率 , 用血细胞记数板记数细胞浓度并计算
细胞产量 。
三 、肝细胞的短期培养
将上述分离 、纯化的肝细胞用合成培养基
(含 RP Mn 64 0 80 nil , 新生小牛血清 20 ml , 地
塞米松 10 一 7M , 牛胰岛素 10 一 SM , 青霉素 loo U /
m l
,链霉素 l(X) U /m l)稀释成 0
.
5 x 106 / m l
, 在
3 7℃ 、 5 % C0 2 条件下培养 6 天 , 每 2 一 3 天更换
一次培养基 , 每天在倒置相差显微镜下观察其
生长情况 。
四 、细胞生化测定
取 5 x l06 个新 鲜肝细胞加 人 10 % T ri to n
和生理盐水各半 , 将活的肝细胞制成匀浆〔2〕, 用
自动生化分析仪测定活的肝细胞 内的天冬氨酸
转氨酶 (AST ) 、碱性磷酸酶 (A LP ) 、总蛋 白(T P )
及总胆红素(T 一Bi l) 的含量 , 并于培养后第 1 、 2 、
4
、
6 天各取 同样数 目的肝 细胞 进行 同样 的检
测 。
五 、异体肝细胞移植治疗 实验性急性肝功
能衰竭
用 10 % D 一氨基半乳糖 (l . 7 9 / k g 体重 , 腹
腔内注射 )将 6 0 只雄性 SD 大 鼠诱导成急性肝
功能衰竭模型并随机均分为移植组和对照组 ,
于注药后第 48 小时将 Z ml 按上述方法制备的
新鲜离体肝细胞悬液 (细胞数为 2 x ro 7 / m l) 注
人移植组大 鼠腹腔 内 , 对照组则 注人等量生理
盐水 , 观察两组长期存活率的差异 (将存活至两
思以上者视为长期存活 )并进行 扩检验 。
结 果
一 、肝实质细胞活率 、纯度及产量
用上述方法分离 出的肝实质细胞 (H eP at o -
c yt e )活率为 85 % 一 95 % , 纯度可达 95 % , 平均
每只大 鼠肝脏可分离出 2 . 5 x 10 8 一 2 . 8 x 10s 个
肝实质细胞 。
二 、细胞培养及细胞内生化测定结果
倒置显微镜下观察 , 经过 24 小时培养 , 大
部分肝细胞即开始贴壁 , 至 48 小时绝大多数细
胞贴壁牢固 , 其形状渐伸展为上皮样并与周围
细胞连接成片 , 只有极少数活力欠佳的细胞悬
浮于培养液中 , 可 于更换 培养基时将其大部吸
除。
经过短期培养 , 肝细胞内的 AST 、A廿 含量
尽管低于新鲜肝细胞 , 但仍有较高活力 。 培养
6 天的肝细胞也仍具有一定 的合成蛋 白和合成
胆红素的能力 (附表 )。
三 、肝细胞移植结果
C坛n J G e n Surx
,
Mav 199 8
,
V o l
.
13
,
N o
.
3
移植组的长期存活率为 40 % (12 / 30) , 而对
照组的长期存活率为 13 . 3 % (4乃0 ) , 二者差异
有显著统计学意义 (p < 0 . 0 1 )。
附表 肝细胞内生化测定结果 (n = 6 )
时间 AST (IU/ L ) ALP (IU几)T 一B il (IU几) ”(g / L )
新鲜细胞 32 5 0 士 l(X) 8 2 2 土 10 1 . 7 上 1 . 0 1 . 6 士 0 . 4
第 l 天 2 33 2 士 8 2 7 18 土 6 1 . 0 土 0 . 3 1 . 1 土 0 . 3
第 2 天 1 75 1 士 3 8 9 17 士 6 1 . 3 土 0 . 6 0 . 9 土 0 . 2
第 4 天 13 5 8 士 5 3 5 17 士 6 1 . 2 士 0 . 5 1 . 1 士 0 . 4
第 6 天 12 13 土 2 1 6 16 土 7 1 . 4 土 0 . 6 1 . 1 土 0 . 1
讨 论
Se gl en 所描述的两步灌注分离肝细胞的方
法 , 是在进行第二步灌注 之前把肝脏取下〔’〕。
由于该方法容易撕裂肝脏包膜从而影响肝脏的
消化 , 因此 , 我们始终保持了肝脏原位灌注 , 不
但避免了上述危险的发生 , 并且简化了操作步
骤 。 此外 , 我们 在第二灌注液 中加人了 0 . 01 %
D N as e l
, 目的是为 了减少 已经分离的肝细胞
重新凝聚成 团闭 。 通过上述改进 , 我们得到了
纯度 、活率及产量均较高的肝实质细胞 。
T巧Pa n Bl u e 拒染法只是判断细胞活力的一
种初步方法 , 若要进一步判明所获得的离体细
胞活力 ,则需进行细胞培养 。 上述的肝细胞培
养观察及细胞内生化测定结果进一步
证明
住所证明下载场所使用证明下载诊断证明下载住所证明下载爱问住所证明下载爱问
, 我
们所得到的肝实质细胞具有较高活力 , 适于进
行肝细胞移植研究 。 尽管在肝细胞培养中对培
养基的选择尚有不同意见 [’, 5〕, 但我们应用 RI, -
M n 6 4 0 培养基加人 2 0 % 小牛血清并参照 Di ch
等人 的实验结果加 人 了 10-- “M 牛胰岛素及
10
一 7M 地塞米松 , 使肝细胞生长 良好并保持了
一定的功能困 , 说明这也是一种培养肝细胞的
可行方法 。
我们的肝细胞移植结果进一步证明同系异
体肝细胞移植对急性肝功能衰竭具有 明显的治
疗作用 , 肝细胞移植逆转急性肝功能衰竭的作
用机理可能有 : (l) 移植肝细胞可能为受体提供
暂时的却是有效的肝脏功能支持 , (2 )移植肝细
胞的裂解产物可能具有刺激和促进病肝再生和
恢复的作用 。 其确切的机理 , 尚需进一步研究 。
参 考 文 献
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HeP 川 o lo gy , 19 8 8 , 8 : 3 9 .
(收稿 : 19 9 7 一1 2一 17 修回 : 199 8 刁2 . 1 1)
〔本文编辑 : 萍 雷)
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择优寄发报到通知 。 来信请详细注明联系地址 、电话或传真 。
报名截止 日期 : 第一期为 1998 年 4 月 1 日 , 第二 、三期为 1 998 年 7 月 31 日(以邮件到达 日为准)。
报名信和推荐信请寄 : 江苏省南京市中山路 305 号 南京总院普通外科研究所 刘永武(邮编 : 21 (X旧2 ) , Fa x :
0 25
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4 80 39 56
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