黄曲霉毒素测定法
1 简述
黄曲霉毒素可以有曲霉菌黄曲霉、寄生曲霉、集封曲霉和伪溜曲霉4种真菌产生，是一组化学结构类素的二呋喃香豆素的衍生化合物，中药在贮藏、制备、运输过程中如保存不当有受潮霉变而污染黄曲霉毒素的可能。黄曲霉毒素是目前世界上已知的毒性最强的化合物之一，其致癌性肯定。对中药中黄曲霉毒素残留量进行严格控制对保证药用安全具有重要意义。
本法的基本原理为样品经有机溶剂提取、免疫亲和柱净化后，利用高效液相色谱分离，柱后碘衍生-荧光检测器检测进行分析测定。
2 仪器与用具
2.1 高速匀浆机、振荡器
2.2 高效液相色谱单元，配荧光检测其（具360nm激发波长和大于420nm发射波长）
2.3 柱后衍生系统
2.4 离心机
2.5 超纯水处理系统
2.6 黄曲霉总量（B1、B2、G1、G2）免疫亲和柱
2.7 固相萃取装置
2.8 离心管，具塞锥形瓶，刻度浓缩瓶，移液管，容量瓶等。
3 试药与试液
3.1 甲醇、乙腈均为色谱纯。
3.2 水位高纯水。
3.3 黄曲霉毒素混合对照品。
3.4 0.05%的碘溶液：取碘0.5g，加入甲醇100ml使溶解，用水稀释至1000ml即得。
4.色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-水（40:18:42）为流动相，流速每分钟0.8m；采用柱后衍生法检测，（1）碘衍生法：衍生溶液为0.05%的碘溶液（取碘0.5g，加入甲醇100ml使溶解，用水稀释至1000ml制成），衍生化泵流速每分钟0.3ml，衍生化温度70℃；以荧光检测器检测，激发波长λex =360nm，发射波长λem =450nm。进样量：20~50μl（视灵敏度进行调整）。
按上述条件操作，理论板数以B1计应不低于5000，两个相邻色谱峰的分离度应大于1.5。
5.操作方法
5.1 混合对照品溶液的制备 精密量取黄曲霉毒素混合
标准
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品（黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标示浓度分别为1. 0μg/ml、0.3μg/ml、1.0μg/ml、 0.3μg/ml、）0.5ml，置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为储备液。精密量取储备液1ml，置25ml量瓶中，用70%甲醇稀释至刻度，即得。
5.2 供试品溶液的制备 取供试品粉末约15g(过二号筛)，精密称定，加入氯化钠3g，置于均质瓶中，精密加入70%甲醇溶液75ml，高速搅拌2分钟（搅拌速度大于11，000转/分），离心5分钟（离心速度2500转/分），精密量取上清液15ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，量取续滤液20.0ml，通过免疫亲合柱，流速每分钟3ml，用水20ml分两次洗脱，洗脱液弃去,使空气进入柱子,将水挤出柱子,再用1.5ml甲醇分次洗脱，收集洗脱液，置2ml量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
5.3 测定法 分别精密吸取上述混合对照品溶液5μl、10μl、15μl、20μl、25μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线。另精密吸取上述供试品溶液20～25μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，从标准曲线上读出供试品中相当于黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的量，计算，即得。
6 注意事项
6.1 本实验应有相应的安全、防护
措施
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，并不得污染环境。
6.2 残留有黄曲霉毒素的废液或废渣的玻璃器皿，应置于专用贮存容器（装有10%次氯酸钠溶液）内，浸泡24小时以上，再用清水将玻璃器皿冲洗干净。实验废液也需加入次氯酸钠进行处理。
6.3 紫外线对低浓度黄曲霉素有一定的破坏性，所以混合黄曲霉毒素对照品储备液应配制在棕色容量瓶中，并避光保存。混合黄曲霉毒素对照品溶液则需临用新配吗，并注意避光。
6.4 当供试品试液进样量超过20μl时，为保证获得良好的额色谱峰形，供试液制备中最后可用水稀释至刻度。
6.5 随行回收绿：加标浓度＜1.0μg/Kg，回收率应在50%~120%；加标浓度1~10μg/Kg，回收率应在70%~110%。
6.6 方法检出限以黄曲霉毒素B1 计应不得高于0.5μg/Kg。
7 附注：光化学衍生法
除上述《中国药典》2010版已收载的柱后碘衍生-荧光检测测定方法外，柱后光化学衍生-荧光检测测定方法在仪器性能和测定的稳定性方面也有明显的优势。
7.1 仪器与用具
光化学衍生器
7.2 色谱条件与系统适应性 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；柱温：40°C；以甲醇-乙腈-水为流动相，按下表进行梯度洗脱，流速1.1ml/min；采用柱后光化学衍生：光化学衍生器（254nm）；以荧光检测器检测，激发波长λex =360nm，发射波长λem =450nm。进样量：20~50μl（视灵敏度进行调整）。
表 HPLC梯度洗脱程序
时间（min）
A：乙腈（%）
B:甲醇（%）
C:水（%）
0
17
20
22
23
10
10
10
10
10
25
45
65
65
25
65
45
25
25
65
其他同碘柱后衍生法。
浙公网安备 33021202002483