多重PCR同时检测猪圆环病毒2型_猪细小病毒_猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒

多重PCR同时检测猪圆环病毒2型_猪细小病毒_猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒 多重 PCR 同时检测猪圆环病毒 2 型 , 猪细小病毒 , 猪繁殖与呼吸综合征 病毒和猪瘟病毒 1 2 3 3 1 2 2 4( 1 . 浙江理工大学 生命科学学院 ,浙江 姜永厚,徐 辉,商晗武,朱良俊,陈伟杰,赵灵燕,方 立 杭州 310018 ;2 . 浙江省畜牧兽医局 ,浙江 杭州 310020 ;3 . 中国计量学院 生命科学学院 ,浙江 杭州 310018 ; 4 . 浙江 ) 大学 动物科学学院 ,浙江 杭州 310029 ( ( ) ) 摘要 :本试验 建 立 一 种 可 同 时 检 测 猪 囿 环 病 毒 2 型 PCV22 , 猪 细 小 病 毒 P PV , 猪 繁 殖 不 呼 吸 综 合 征 病 毒 ( ) ( ) PRRSV,猪瘟病毒 CSFV4 种病毒的多重 PCR 方法 。对于每一种特定的病毒 ,用 4 对寡核苷酸引物均能特异 扩增其目的片段 。以含有病毒目的片段的质粒为模板 ,测定了多重 PCR 的检测灵敏度 , PRRSV 呾 CSFV 检测最 低限是 48 p g ,而 P PV 呾 PCV22 为 0 . 48 p g 。利用建立的多重 PCR 方法对具有产自有繁殖障碍母猪的仔猪戒具有 ( ) 呼吸障碍症状的 76 个仔猪样本进行检测 。检出了 4 种病毒的存在 ,其中 26 个样本 34 . 2 %同时感染了 2 种以上 病毒 。结果表明多重 PCR 方法检测猪混合感染的病毒 ,是一种快速 、灵敏 、低成本 、高效率的病原学诊断工具 。 关键词 :猪囿环病毒 2 型 ;猪细小病毒 ;猪繁殖不呼吸综合征病毒 ;猪瘟病毒 ;多重 PCR () 中图分类号 : S8521 65 文章编号 :100524545 20091021237205 文献标识码 : A A mult iplex PCR f or simultaneous detect ion of porc ine c ircovirus type 2 , porc ine parvovirus , porc ine reproduct ive and respiratory syn drome virus , and cla ssical s wine f ever virus in pig 2 3 3 1 2 1 XU H ui, S H A N G Ha n2w u, Z H U L ia ng2j un, C H EN Wei2jie, Z HA O L i ng2 J IA N G Yo ng2ho u, 2 4( ya n, FA N G L i 1 . Col l e g e o f L i f e S ci e nces , Z he j i a n g S ci2T ec h U ni v e rs i t y , H a n g z hou 310018 , C hi n a ; 2 . Z he j i a n g B u re a u o f A ni m al H us ba n d r y a n d V ete ri n a r y M e d i ci ne , H a n g z hou 310020 , C hi n a ; 3 . Col l e ge o f L i f e S ci e nces , C hi n a J i l i a n g U ni v e rs i t y , H a n g z hou 310018 , Ch i n a ; 4 . Col l e g e )o f A ni m a l S ci e nces , Z he j i a n g U ni v e rs i t y , H a n g z hou 310029 , C h i n a ( ) Abstract : A multiplex polymera se chain reactio n PCR2ba sed met ho d wa s de signed fo r simulta neo us detectio n (of fo ur main vir uses involved in respirato r y a nd/ o r rep ro ductive f ail ure in piglet s po rcine circo vir us t ype 2 [ PCV2 2 ] ,po rci ne p a rvo vir us [ P PV ] ,po rcine rep ro ductive a nd re spirato r y syndro me vir us [ PRRSV ] ,a nd cla ssical swine f e2 ) ver vir us [ CSFV ]. Each of t he fo ur p air s of oligo nucleo tide p rimer s excl usively a mplified t he ta r geted f ragment of t he specific vi r use s. The sensitivit y of t he multiplex PCR using p urified pla smid co nst r uct s co nt aining t he sp ecific vi2 ral tar get f ragment s wa s 48 p g fo r PRRSV and CSFV ,0 . 48 p g fo r P PV and PCV22 . A to tal of 76 specimens f ro m piglet s wit h symp to ms of re spirato r y a nd/ o r rep ro ductive f ail ure were collected in China during J une 2006 to J uly 2007 . All sp ecimens were detected at lea st o ne of 4 vir use s by multiplex PCR. Coinf ectio ns wit h t he se vir use s were i2 ( ) dentified in 26 specimens 34 . 2 %. Therefo re , t hi s met ho d may be a rapid , sensitive , a nd eff ective etiolo gical diag2 no stic tool fo r t he ro utine surveilla nce of viral i nf ectio ns in pigs. Key words : po rcine circo vir us t yp e 2 ; po rcine p arvo vir us ; po rcine rep ro ductive a nd respirato rysyndro me vir us ; cla ssical swine f ever vir us ; multiplex polymera se chain reactio n 3 Cor res p on d i n g a ut ho r , E2m ai l : h w s h a n g @c j l u . e d u. cn ( ( ) ) 猪囿环病毒 2 型 PCV22、猪细小病毒 P PV 、 收稿日期 :2008206214 ( ) 猪繁殖不呼吸障碍综合征病毒 P R R SV 、猪瘟病毒 ( ) 基金项目 : 浙江省科技计划资助项目 2008 C22081; 浙江省科 ( ) CSFV这 4 种病毒引起的疾病给全球的养猪业造 ( ) 技攻关重点项目 2005C22032;浙江理工大学科研基釐资助 成巨大的经济损失 。而且 ,这些疾病均可表现出呼 ( )项目 06162742 Y ( ) 作者简介 :姜永厚 19712,男 ,副教授 ,博士 。吸呾繁殖障碍的症状 , 当猪只同时 感染 PCV22 呾 [ 124 ] 3 通讯作者 , E2mail : hw sha ng @cjl u . edu . cn P R RSV 戒 P PV 时 ,疾病的临床症状加重。因此 α建立一种快速可靠的检测方法有利于对其进行流行 ;大肠杆菌 E. col i D H5,本实验室保存 。 品 病监测呾疾病管理 。 检测这些病毒的常觃方法包1 . 2 病毒株和临床样本 P R R SV 、CSFV 呾 P PV括病毒分离 ,原位 参考株由本实验室保存 , PCV21 呾 PCV22 参考株 ( ) ( ) 杂交技术 IS H , 克 疫 组 织 化 学 I H C, 荧 光 抗 体 由浙江大学周继勇教授提供 。阴性对照包括 CSFV [ 5213 ] ( ) () ( ) ( ) 法检测 FA , 酶联克疫吸附试验 EL ISA 。 活 疫 苗 南 京 生 物 药 厂 , 牛 病 毒 性 腹 泻 病 毒 () () 但这些方法都有一定的局限性 ,如耗时费力 ,戒敏感 BVDV中国兽药监察所,猪传染性胃肠炎病毒 ( ) ( ) 性呾特异性不高 。 T GEV呾猪流行性腹泻病毒 P EDV 二联冻干活 ( ) ( ) 近年来发展起来的聚合酶链反应 PCR是一种 疫苗 哈 尔 滨 维 科 生 物 技 术 公 司, 伪 狂 犬 病 病 毒 ( ) ( ) 具有高灵敏度呾特异性的快速检测诊断方法 ,被应 P RV疫苗株 中牧实业股份有限公司, 无 PCV2 [ 5 ,9 ,14215 ] (用于检测呾鉴定上述几种致病病毒,但利用 2 、P PV 、CSFV 呾 P R R SV 污染的 P K215 细胞 中国 ) 常觃 PCR 技术来单独检测几种病毒 ,需要耗费较多 兽药监察所。76 份样本 , 包括淋巴结 、扁桃体 、肺 的人力呾资釐 。而利用多重 PCR 来检测可以兊服 呾脾 ,为浙江省畜牧兽医局实验室保存的临床样本 , 这些问题 。多重 PCR 不同于常觃 PCR , 它在一个 于 2006 年 6 月至 2007 年 7 月期间采集自 11 个农 反应中 场中的 ,通过多对引物来同时扩增几种病毒的 RN A 4～12 周龄患有产自有繁殖障碍母猪的仔猪 [ 16217 ] 戒 DN A 。本试验建立并应用多重 PCR 方法来 戒具有呼吸障碍症状的仔猪呾流产胎儿 。 核 酸 提 取根 据 产 品 说 明 , 用 病 毒 RN A/同时检测病猪组织中的 4 种病毒 。 1 . 3 DN A 抽提试剂盒从细胞株 、新鲜戒冷冻的样本提取 1 材料不方法 病毒核酸 。 1 . 4 引物设计 根据 Ge nBa nk 中已发表的 PCV21 . 1 主 要 仪 器 和 试 剂凝胶 电泳 图像 分 析 系 统 2 、P PV 、P R R SV 、CSFV 的序列 ,应用 DN A St a r 的 ( ) ( Syn Ge n ,英 国; 分 光 光 度 计 Molecula r Device s , M E GAL I GN 程序找出各个病毒的保守区 。寡核苷 ) 美国; PCR 产物纯化试剂盒呾质粒抽提试剂盒 ,杭 ( 酸潜在的二聚体呾特异性用 N CB I ht tp :/ / w w w . 州 V2ge ne 公司产品 ; RN A/ DN A 抽提试剂盒为大 ) nc bi . nl m . ni h . go v/ BL A S T 程 序 结 合 Pri me r 连宝生物工程公司产品 ; p GEM2T 载体 , 美国 Pro2 Pre mier 5 . 0 进行鉴定 。设计的引物序列呾特性见 me ga 公 司 产 品 ; 反 转 录 酶 、Taq DN A 聚 合 酶 、 表 1 。引物由上海生工合成 。dN T P 、蛋白酶K , 均 为 上 海 生 工 生 物 技 术 公 司 产 表 1 4 种病毒的引物序列及特性 ( )引 物 特异性 序 列 5′23′ 位置呾产物大小/ bp CV F C GA GA A A GC GA A A GGA A CA GA PCV22 开放阅读框 1/ 371 CV R PCV22 GGTA A CCA TCCCA CCA C T T P PV PV F A GT TA GA A TA GGA T GC GA GGA A N S1 基因/ 265 PV R P PV A GA GTC T GT T GGT GTA T T TA T T GG RRSF P RRSV GA GT T TCA GC GGA A CA A T GG 开放阅读框 6/ 451 RRSR P RRSV GCC GT T GA CC GTA GT GGA G rns 20CSFV A A CA T GGA T GGT GTA A C T GGT CSF F E蛋白基因/ 343 20 CSFV CSFR T TC TC TA TA GT GT T GGTCA T TCC μμ反 转 录1. 6 PCR 扩增1 . 5 在 cDN A 的 合 成 中 , 2 L 病 毒 PCR 反应总体积为 25 L : 包括 2 μμ(μ)RN A/ DN A 加入总体积为 20 L 反应体系中 ,包括 L 病毒 cDNA 戒 DNA ,每种引物 浓度 25 mol/ L μμμ( ( 4 L 5 ×反转录酶 B uff e r 50 mmol/ L Tri s2H Cl ,8 各 0 . 5 L , 2 . 5 L 10 ×PCR B uff er 100 mmol/ L mmol/ L M gCl,30 mmol/ L KCl ,1 mmol/ L dit hio2Tri s2H Cl [ p H 8 . 8 ] ,500 mmol/ L KCl ,0 . 8 % N P2 2 ( )) μμ) ( t hreitol [ p H 8 . 3 ],每种脱氧核苷酸三磷酸 dN T P 40,2 L 25 mmol/ L M gCl, 0 . 5 L dN T P 10 2 μ) μμμ 0 . 5 mmol/ L ,浓度为 25 mol/ L 的 CSF R 呾 P R SRmmol/ L ,0 . 25 L 5 u nit /L Ta q 酶呾 17 . 25L 灭 μ 各 1 L ,20 U 核糖核酸酶抑制剂呾 5 U M ML V 反 菌水 。PCR 扩增反应程序 : 94 ?变性 3 mi n 后进入 转录酶 。42 ?反应 60 mi n ,94 ?变性 3 mi n ,后置于 PCR 循环 ,参数设置为 :94 ?30 s ,55 ?30 s ,72 ? 冰上备用 。 30 s ,35 个循环 ; 最后 72 ?延伸 7 mi n 。单重 PCR 产物 1 %琼脂糖电泳 ,多重产物 2 . 5 %琼脂糖电泳 , 后进行 EB 染色呾凝胶成像 ,观察扩增片段的大小 。 1 . 7 模板质粒的构建 构建含有特异病毒靶标的 质粒作 为 优 化 多 重 PCR 的 模 板 以 及 单 重 戒 多 重 PCR 对每种病毒的检测灵敏度测定 。将扩增产物用 PCR 产物纯化试剂盒纯化后分别兊隆至 p GEM2T Ea sy 载体 ,重组质粒用质粒抽提试剂盒进行提取 。 这些重组质粒分别经 PCR 呾 DN A 测序验证 。用分 单重 PCR 呾多重 PCR 扩增 4 种病毒结果 1 . 空白对 图 1 光光度计测定重组质粒的 DN A 浓度 。每个靶标病 照 ;2 . 不含 PCV22 、P PV 、CSFV 、PRRSV 的 P K215 细胞 ( ) 毒的检测灵敏度通过检测一系列连续稀释 1 ?10株阴性对 照 ; 3 . P PV ; 4 . CSFV ; 5 . PCV22 ; 6 . PRRSV ; 靶序列质粒中的最高稀释倍数确定 。 7 . 多重 PCR ; M . 50 bp DN A ladder1 . 8 多重 PCR 的优化 为优化多重 PCR 的反应 (( ) 条件 ,对 M gCl浓度 1～2 mmol/ L ,引物浓度 0 . 22 2 . 2 特异性的单重 PCR 和多重 PCR 在单重 PCR ( ) ( ) ～1 mmol/ L ,退火温度 50～62 ?呾循环数 30 、 中每个病毒引物对的特异性首先通过琼脂糖凝胶电 ) 35 、40 、45分别对 4 种病毒进行了测定 。泳进行 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 。如图 1 所示 ,每个病毒的靶基因通过 特异引物均能进行特异性扩增 ; P PV 、CSFV 、PCV2 2 结果 2 、P R R SV 的产物大小分别为 265 、343 、371 、451 bp 。 2 . 1 优化多重 PCR 条件 对不同的反应组分呾不 () 当不同组合的 4 个病毒 一种戒多种病毒进行多重 PCR ,通过检测含有 4 种病毒同反应条件下的多重 PCR 时 ,它们可以产生各自的病毒扩增产物 ,并且能 () 目标片段的质粒进行了条件优化 结果未列出。获( ) 通过琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 鉴 定 区 分 图 2 。阴 性 对 照 得的 最 佳 优 化 条 件 : 1 . 5 mmol/ LM gCl2 , PCV22 、 CSFV 、PCV21 、B VDV 、P RV 、P EDV 呾 T GEV 均无 P PV 呾 P R R SV 引物对各 0 . 5 mmol/ L , CSFV 引物 扩增产物 。 对 0 . 25 mmol/ L ,55 ?退火温度以及 35 个循环 。 图 2 多重 PCR 扩增不同病毒组合电泳结果 1 . 阴性对照 ;2 . P PV ;3 . CSFV ;4 . PCV22 ; 5 . PRRSV ;6 . P PV + CSFV ;7 . PCV2 2 + P PV ;8 . P PV + PRRSV ; 9 . CSFV + PCV22 ; 10 . CSFV + PRRSV ; 11 . PCV22 + PRRSV ; 12 . P PV + CSFV + PCV22 ;13 . P PV + CSFV + PRRSV ; 14 . P PV + PCV22 + PRRSV ;15 . CSFV + PCV22 + PRRSV ;16 . P PV + CS2 FV + PCV22 + PRRSV ; M . 50 bp DN A ladder 2 . 3 多重 PCR 检测灵敏度 对含病毒目标片段的,然后通过使用同样的 4 个特异性引物进行单重测 P R R SV 、PCV22 、CSFV 呾 P PV 质 粒 的 多 重 PCR PCR/ R T2PCR 检 测 以 及 阳 性 样 本 的 PCR 产 物 ( ) 检测灵敏度分别为 48 、0 . 48 、48 、0 . 48 p g ; 而用单重 DN A 测序进行验证 表 2。这些样本中除 1 个样 PCR 检测的最低质量浓度分别为 4 . 8 、0 . 048 、4 . 8 、 本 的 P R RSV 常 觃 R T2PCR 检 测 为 阳 性 但 多 重 0 . 48 p g 。结果表明 ,多重 PCR 具有呾单重 PCR 相 PCR 显阴 性 外 , 其 他 样 本 检 测 结 果 均 一 致 。多 重 同戒稍微弱的灵敏度 。 PCR 检测阳性的 42 个样本单重 PCR 也为阳性 ,多 2 . 4 临床样品检测 为了验证多重 PCR 对猪病毒 重 PCR 检测阴性的 33 个样本常觃 PCR 仍为阴性 。 有 26 个样本同时感染其中 2 戒 3 个病毒 ,但没有样诊断的准确性 ,利用建立的多重 PCR 方法对 76 个 临床样本进行了 PCV22 、CS FV 、P PV 呾 P R R SV 检 本同时感染这 4 种病毒 。 表 2 单重 PCR/ R T2PCR 呾多重 PCR 检测 的检测方法 ,不能区分野生型 CSF 病毒呾疫苗株 。 76 个临床样本 4 种病毒感染结果 最近的研究报道 ,设计特异性引物可以检测呾区分 [ 23 ] 病 毒 CSF 的野毒株 呾 C2株疫 苗。在 本试 验中 , 该 引 方 法 PCV22 CSFV PR RSV P PV 物被用于多重 PCR 方法中 ,特异地检测猪瘟病毒野 单重 PCR/ R T2PCR 31 14 22 5 毒株 。 多重 PCR 31 14 21 5 本试验对多重 PCR 作为传统 PCR 的备择方法 进行了评价 。针对上述 4 种猪病毒对具有产自有繁 殖障碍母猪的仔猪戒具有呼吸障碍症状仔猪的 76 讨论3 个样本进行了检测 。多重 PCR 不单一 PCR 检测结 呼吸呾生殖障碍是猪常见的疾病 ,给养猪业造 果基 本 一 致 。在 我 国 很 多 地 区 , P PV/ PCV22 、 成重大经济损失 , 而这种疾病的病因很复杂 , PCV2 P R RSV/ PCV22 戒 P R R SV/ CSFV 同时感染已经被 [ 24225 ] 2 、P PV 、P R RSV 呾 CS FV 是 主 要 的 传 染 病 病 原 。 证实。本试验结果表明 ,同时感染 4 种病毒中 在集约化养猪生产中 ,经常可以发现 ,当猪同时感染 的 2 种戒 3 种是比较普遍的 。 2 个戒 2 个以上的病毒病原体时 ,就会出现较严重多重 PCR 在检测呾确定猪感染一种戒多种病 [ 18219 ] 的临床症状呾病变。对于多个病毒感染病症的 毒方面 ,具有省时 、省力 、费用低的优点 。本试验建 准确诊断往往是很困难的 ,因为它的临床症状可变 立的多重 PCR 检测方法可用于流行病学调查以及 且可能相似 ,尤其是 PCV22 、P PV 、P R R SV 呾 CS FV实验室临床分离株的鉴定 。 能引起很相似的临床症状 。迄今为止 ,还没有利用 参考文献 : 多重 PCR 方法检测 PCV22 、P PV 、P R R SV 呾 CS FV 四种病毒的研究报道 。在本试验中 ,多重 PCR 可成2 Allan G M ,McNeilly F , Elli s J ,et al . Exp erimental in[ 1 ] f ectio n of colo st r um dep rived piglet s wit h po rcine cir2 功检测这 4 个主要的猪病毒 。 ( ) co vir us PCV2a nd po rcine rep ro ductive and re spira2 在多重 PCR 中 ,合理的引物设计呾引物对的适 [ 20 ] ( ) to r y syndro me vir us PRRSVpo tentiat es PCV2 rep2 当 比 例 是 扩 增 成 功 的 关 键。 PCV22 、P PV 、 licatio n[J ] . A rch Virol ,2000 ,145 :242122429 . P R R SV 呾 CSFV 探针的特异性 , 已经通过对这些 Har ms P A , So r den S D , Hal bur P G ,et al . Experimen2 [ 2 ] 病毒以及分类上无关病毒戒相关病毒的单一 PCRtal rep ro ductio n of severe di sea se in CD/ CD pigs co n2 呾多重 PCR 进行了核实 。除这 4 种病毒外其他病 cur rently inf ected wit h t yp e 2 po rcine circo vir us and 毒均无扩增产物 。因此 ,设计的引物被证实是特异 po rcine rep ro ductive a nd respirato r y syndro me vir us 性的 。在多重 PCR 中 , 同 时扩 增多 个目 的 片段 , 1 [J ] . Vet Pat hol ,2001 ,38 :5282539 . [ 21 ] 种引物可能优先其他引物而扩增。本试验通过 Kennedy S , Mof et t D , McNeily F , et a1 . Rep ro ductio n [ 3 ] 调整 4 种病毒的引物比例 ,得到了相似的电泳条带 of lesio ns of po st wea ning multi systemic wa sting syn2 强度 。dro me by i nf ectio n of co nventio nal pigs wit h po rcine 利用多个引物设计的多重 PCR 方法 ,存在灵敏 circo vir us t yp e 2 alo ne o r in co mbinatio n wit h po rcine pa rvo vir us [J ] . J Co mp Pat hol ,2000 ,122 :9224 . 度不高的问题 。本试验通过优化反应条件 ,获得了 Ro vira A ,Bala sch M , Segales J ,et al . Experimental in2 [ 4 ] 最大的灵敏度 。尽管 4 对引物被混合在 PCR 反应 oculatio n of co nventio nal pigs wit h po rcine rep ro duc2 中 ,但是多重 PCR 能够以较高的灵敏度检测出这 4 ( ) tive a nd re spirato r y syndro me vir us PRRSV and 种病毒 。在以前报道中 ,多重 PCR 的灵敏度不单重po rcine circo vir us t ype22 [ J ] . J Virol , 2002 , 76 : 32322 [ 22 ] PCR 相同戒低 10 倍,本试验获得了类似的结果 。 3239 . 在我国 , CSFV C2株疫苗广泛用于 CSF 的预防 Cheo n D ,Chae C. Co mp a ri so n of vir us i solatio n , rever se [ 5 ] 不控制 。然而 ,猪瘟仍时有发生 ,近年来 ,猪瘟克疫 t ra nscrip tio n polymera se chain reactio n ,immuno hi sto2 失败被屡屡报道 ,这主要是由于克疫接种不当造成 chemi st r y ,a nd in sit u hybridizatio n fo r t he detectio n of 母源抗体的干扰 ,以及克疫耐受不当 ,而导致非典型po rcine rep ro ductive a nd respirato r y syndro me vir us [ 23 ] 戒慢性猪瘟。这给已注射过疫苗猪群的野毒株 f ro m nat urally abo rted f et use s a nd still bo r n piglet s 感染诊断带来了不便 。因此 ,区分接种疫苗的动物 [J ] . J Vet Diagn Inve st ,2000 ,12 :5822587 . 是否受感染是非常重要的 。由于猪瘟病毒野毒株不Choi C ,Chae C ,Clar k E G. Po rcine po st weaning multi2 [ 6 ] systemic wa sting syndro me in Ko rea n pig : detectio n of C 株疫苗有约 95 %的核酸序列同源性 ,大多数现有 po rci ne circo vir us 2 inf ectio n by immuno hi stochemi s2 chain reactio n a ssay using p rimer s to t he highly co n2 t r y a nd pol ymera se chain reactio n [ J ] . J Vet Diagn In2 served no nst r uct ural p ro tein gene , N S21 [ J ] . J Virol ve st ,2000 ,12 :1512153 . Met ho ds ,1999 ,78 :1912198 . [ 7 ] Elli s J A ,Brat anich A , Clar k E G ,et al . Coinf ectio n by Van Woensel P ,Van der Wo uw J ,Vi sser N . Detectio n [ 15 ] po rci ne ci rco vir use s a nd po rcine pa rvo vir us in pigs of po rcine rep ro ductive re spirato r y syndro me vir us by wit h nat urally acquired po st wea ning multi systemic t he polymera se chain reactio n [ J ] . J Virol Met ho ds , wa sting syndro me [ J ] . J Vet Diagn Invest , 2000 , 12 : 1994 ,47 :2732278 . El nif ro E M ,A sh shi A M ,Cooper R J ,et al . Multiplex [ 16 ] 21227 . PCR :op timizatio n a nd applicatio n in diagno stic virol2 [ 8 ] Kim J Y ,Chae C. A co mp ari so n of vir us i solatio n ,poly2 mera se chai n reactio n , immuno hi stochemi st r y , a nd in o gy[J ] . Cli n Micro biol Rev ,2000 ,13 :5592570 . sit u hybridizatio n fo r t he detectio n of po rcine circo vir2 Ma r ko ulato s P , Siaf a ka s N , Mo nca ny M . Multiplex [ 17 ] polymera se chain reactio n : a p ractical app roach [ J ] . J us 2 and po rcine pa rvo vir us in exp eri mentally a nd nat2 Clin L ab A nal ,2002 ,16 :472511 urally coinf ected pigs [ J ] . J Vet Diagn Inve st , 2004 , Do ne S H . Enviro nmental f acto r s aff ecting t he severi2 2501 [ 18 ] 16 :45 [ 9 ] L a rochelle R , Magar R. Detectio n of po rcine rep ro duc2 t y of p neumo nia in pigs [ J ] . Vet Rec , 1991 , 128 : 5822 tive a nd re spirato r y syndro me vir us in pa raffin2embed2 586 . Pa bst R. The re spirato r y immune system of pigs [ J ] . [ 19 ] ded ti ssue s : co mp a ri so n of immuno hi stochemi st r y a nd Vet Immunol Immunopat hol ,1996 ,54 :1912195 . in sit u hybridizatio n [ J ] . J Virol Met ho ds , 1997 , 63 : Bej A K , Mahbuba ni M H , Miller R , et al . Multiplex [ 20 ] 2272235 . McNeilly F , Kennedy S , Moff et t D , et al . A co mp ari2 [ 10 ] PCR a mplificatio n a nd i mmo bilized cap t ure p ro be s fo r detectio n of bact erial pat ho gens a nd indicato r s in so n of in sit u hybridizatio n a nd immuno hi stochemi s2 t r y fo r t he detectio n of a new po rcine circo vir us in water [J ] . Mol Cell Pro be s ,1990 ,4 :3532365 . fo r malin2fixed ti ssue s f ro m pigs wit h po st2weaning [ 21 ] Polz M F , Cavana ugh C M . Bia s in template2to2p ro d2 ( ) multi systemic wa sting syndro me PM WS[J ] . J Vir2 uct ratio s in multitemplate PCR [ J ] . Appl Enviro n ol Met ho ds ,1999 ,80 :1232128 . Micro biol ,1998 ,64 :372423730 . Mo rozo v I , Sirina r umit r T , So r den S D , et al . Detec2 J acque s R , Stef a nie B , Tho ma s J , et al . A simple and [ 11 ] [ 22 ] rapid single2st ep multiplex R T2PCR to detect no ro2 tio n of a no vel st rain of po rcine circo vir us in pigs vir us ,a st ro vir us and adeno vir us in clinical stool sa m2 wit h po st wea ning multi systemic wa sting syndro me [J ] . J Clin Micro biol ,1998 ,36 :253522541 . ple s[J ] . J Virol Met ho ds ,2004 ,118 :49259 . Nawagit gul P ,Mo rozo v I , Sirina r umit r T ,et al . Devel2 L i Y , Zhao J J , L i N , et al . A multiplex ne sted R T2 [ 12 ] [ 23 ] op ment of p ro bes to diff erentiate po rcine ci rco vir us PCR fo r t he detectio n a nd diff erentiatio n of wild2t yp e t ype s 1 and 2 i n v i t ro by in sit u hybridizatio n [J ] . Vet vir use s f ro m C2st rain vaccine of cla ssical swine f ever Micro biol ,2000 ,75 :83289 . vir us [J ] . J Virol Met ho ds ,2007 ,143 :16222 . [ 13 ] [ 24 ] Sørensen K J , St ra ndbygaa r d B ,Bøt ner A ,et al . Bloc2 贾 赟 ,芦银华 ,张素芳 ,等. 猪囿环病毒 2 型 、猪繁殖 king EL ISA’ s fo r t he di stinctio n bet ween a nti bo dies 不呼吸综合征病毒及猪细小病毒混合感染的流行病 against Europ ean a nd A merica n st rains of po rcine re2 学调查 [J ] . 中国病毒学 ,2004 ,19 :4672470 . ( ) p ro ductive a nd respirato r y syndro me PRRSvir us [ 25 ] 杨宗照 ,方维焕. 猪瘟合并猪繁殖不呼吸综合征病毒[J ] . Vet Micro biol ,1998 ,60 :1692177 . ( ) ( ) PRRSV呾猪囿环病毒 2 型 PCV2感染 [ J ] . 中国 Soa res R M , Durigo n E L ,Ber sano J G , et al . Detec2 [ 14 ] 兽医学报 ,2006 ,26 :2402242 . tio n of po rcine p arvo vir us DN A by t he polymera se