牛血清白蛋白的抗血清在免疫学沉淀反应实验中的应用
牛血清白蛋白的抗血清在免疫学沉淀反应
实验中的应用
医学理论与实践2005年第18卷第3期JMedTheor&PracVo1.18,No.3,Mar2OO5
?实验研究?
牛血清白蛋白的抗血清在免疫学
沉淀反应实验中的应用
蔡玲斐
杭州师范学院医学院形态中心实验室,浙江省杭州市310012
摘要目的:制备牛血清白蛋白(BSA)抗血清,以探讨获取高效价抗血清的方法.方法:用BSA配制一定的浓
度,免疫家兔,以制备兔抗一BSA血清.利用免疫电泳,双向琼脂扩散试验分析和测定抗血清的效价.结果:
双向琼脂扩散在BSA0.5g/mL的浓度时,测得抗血清效价为1:32,对流免疫电泳结果显示BSA0.5g/mL与抗
BSA在1:16时形成一条清晰可见的沉淀线.结论:BSA免疫家兔可获取效价较高的抗血清.
关键词牛血清白蛋白(BSA)效价沉淀线免疫
中图分类号:R392.7文献标识码:A文章编号:1001—7585(2005)03—0254—02
~imtionofAntisertmaofBovineSerumAlbumininlmnmnopredpitatloBR0nExperiment
CAJIJno~fei.MedicalSchool,l,l鲁Teachers’College,H,~oucZ~Prov/nce310012
A】BsTObjective:ToprepareantiserumofbovineselMmalbumin(BSA)forobtaininghishfiterantiserum.M
eth-
ods:8elMillofanti—BsJwaspr印ardbyimmunizingrabbitswithBSA.nlefiterofantiserumwasdet~tedbyiml’llu—
noeleetrophoresisanddoubleimmtmodiffusion.Ret~ts:nlefiterofantiserumwas1:32indoubleimmun
odiffusionand
counterimmunoelectrophoresisshowedaclearprecipitationlineintheratio1:16forBSA:anti—BSA(allat0.5g/na
BSA).Conduslon:耵highertiterofantiserumisobtainedbyimmunizingrabbitswithBSA.
KEYW0】RDSBovineserumalbumin(BSA),Titer,Precipitationline,Immunity
可溶性抗原(如血清,细菌浸出液,外毒素等)和
相应抗体结合,在适量电解质存在下,经过一定时
间,在二者比例适当时形成肉眼可见的沉淀物.可
分环状沉淀试验,絮状沉淀试验,琼脂扩散试验(单
向琼脂扩散试验,多向琼脂扩散试验),免疫电泳…1.
由于沉淀反应抗原多系胶体溶液,沉淀物主要是由
抗体蛋白所组成,制备可溶性抗体的物质有很多,但
处理的方法繁琐或价格昂贵,并且效价不高.因此,
寻找简单,快速,易操作的方法提供给教学单位实际
应用具有重要的现实意义.在免疫学的教学中,沉
淀反应是必不可少的,而在本科学生中此实验的操
作又必列其中.目前市场上生物制品缺乏某种可溶
性抗原与可溶性抗体的配备供应,且价格昂贵.为
了节约经费,使用方便,提高实验课的教学质量,笔
者采用牛血清白蛋白(BSA)免疫家兔,以获取较高
的BSA的抗血清,现将方法介绍如下.
1
材料
关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料
与方法
1.1BSA抗原的制备牛血清白蛋白(BovineSerum
Albumin,BSA),批号为O204,由杭州华美生物工程公
司提供.实验时以无菌生理盐水配制成20mg/mL
浓度的应用液,4?冰箱保存备用.
1.2进口琼脂粉由杭州华美生物工程公司提供.
1.3弗氏完全佐剂(Frenud)的制备石腊油40mL,
无水羊毛脂10g左右,经15镑20min高压灭菌制成
混悬液,加卡介苗1支(75mg/mL),用前在80~C水浴
中加热1h,将菌杀死.
1.4主要仪器(1)水平离心机,LD5—3A型.北
京医用离心机厂生产制造;(2)37?温箱,HH一400
型,北京医疗器械厂生产;(3)电泳仪.DYY一6B型
稳压稳流电泳仪,北京六一仪器厂制造.
1.5免疫动物的方法及途径
1.5.1试验动物:家兔(12只),无免疫接种史,体重
2.0,2.5kg,雌雄并用,由杭州师范学院医学院动物
室提供.采用皮下多点免疫法,牛血清白蛋白浓度
为40mg/兔.
1.5.2福氏完全佐剂抗原的制备_2J:取羊毛脂,石
腊油为1:4,1:6混合后高压灭菌,与等体积的
20mg/mL牛血清白蛋白混合,并按lmL加0.25,
lmg卡介苗加入研钵中共同研磨使之成为油包水的
乳液.
1.5.3免疫方法l_3j:首次取福氏完全佐剂抗原液
2mL/只兔,四足趾注射,约每点O.5mL,5d后,取同剂
量不完全佐剂(不加卡介苗)抗原液作脊部,颈部皮
下,腹股沟等处皮下多点注射.2周后于双侧后肢肿
医学理论与实践2005年第18卷第3期JMedTheor&PracVo1.18,No.3,M8r2005
大的腋窝淋巴结内各注入hnLBSA抗原制剂,第3,
5,7周按上述方法再次在兔的背部皮内注射抗原
2mL,末次注射2周后,白兔耳静脉采血测试效价,若
效价不够高,可用不加佐剂的抗原(瑚L)通过耳
静脉以加强免疫,1周内注射3次,分别为0.1mL,
0.3mL,0.5mL,1周后再次采血测试效价.在收获免
疫血清前,应测定抗体效价,若效价在1:16以上即可
达到要求,应及时采血,否则抗体将会下降.
1.6双相琼脂扩散法[]在每块干净的玻片上铺
5mL1.5%琼脂(生理盐水配制,内含1:1000叠氮
钠),约1.5mm厚,凝固后打孔(直径3mm),孔间距
10mm,中心孔加10抗原0.5g%(BSA),周围孔内
每孔加10ptL抗血清(作系列稀释1:2,1:4,1:8,
1:16,1:32,1:64),将玻片置于湿盒内,36~C扩散
24h.结果:在抗血清效价为1:32出现一条完全融
合的沉淀线.
1.7单向琼脂扩散法[]取一块干净的玻璃片,将
已融化并在56~C水浴中保温的3%琼脂(用0.Olrnol
pH7.41磷酸盐缓冲液配制)中加入BSA抗血清,二
者等量混合,此时抗血清的浓度为1:80,琼脂浓度
为1.5%.充分混匀后取6mL铺在玻璃片上(图1),
待凝固后打孔(直径3mm),孔间距为1.21.5cm,
挑出孔内琼脂.将0.5g%BSA用PBS作系列稀释
(1:2,1:4,1:8,1:16)加人孔中,每孔约10止,将玻片
置于湿盒内,36?扩散24h,测出各孔沉淀环直径.
以各种稀释度
标准
excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载
抗原的沉淀环为纵坐标,相应孔
中BSA含量为横坐标,绘制标准曲线(图2),沉淀圈
直径与抗原浓度成比例关系,从而可以定量测出抗
原含量.
2O
l5
l0
5
0
图1单向琼脂扩散试验
200400800
BSA含量pg/I)
图2单向琼脂扩散法标准曲线
1.8对流免疫电泳【J将1%琼脂糖(用pH8.6,
0.05mol/LTris一巴比妥缓冲液配制)5mL铺于干净
的玻片上(厚约1.5mm),待凝固后,用打孔器成
对打孔,孔径3mm,孔间距3mm,排距8mm,在
孔中分别加入0.5g%BSA抗原和BSA抗血清(作
系列稀释1:2,1:4,1:8,1:16,1:32),在电场中
电泳30min(5v/cm),观察结果.
2结果
双向琼脂扩散法BsA抗血清效价在1:32出现
清晰的白色沉淀线.对流免疫电泳在1:16出现清
晰的沉淀线.单向琼脂扩散沉淀圈直径与抗原浓度
成比例关系,从而可以定量测出抗原含量.
3注意事项
(1)电泳时电流不宜过大,以免蛋白质变性.(2)
抗原,抗体的电极方向不能放反.(3)抗原,抗体
相对浓度要适当,抗原太浓或太稀都不易出现沉淀
线.(4)电泳所需时间与孔间距离有关,距离越
大,电泳时间越长.
4讨论
BSA抗血清作为一种免疫学试剂,应用于免疫
学沉淀反应中具有特异性强,纯度好,效价高,成
本低,操作简便等优点,达到实验的要求.在实验
时加样应加满d,:fL但不能溢出,扩散时间要适当,
时间过短,沉淀线不能出现;时间过长,会使已形
成的沉淀线解离或散开.抗血清易被细菌污染,所
以使用的各种器材,用具要彻底清洗和消毒.为了
保持抗血清效价,所收集的抗血清必须进行小量分
装及置低温(一20?)冰箱保存备用.结果证明,
BSA用于免疫学沉淀反应试验可取得较高的抗血清
效价,并且自制的抗血清不需要耗费太多的材料,
可为学生节约实验经费,实验效果又好,还可以保
证学生的安全.
参考文献
l余贺,谢少文,杨桂贞,许以平,编着.临床免疫技术.上海:
上海科学技术出版社,1982.23.
2蔡玲斐,袁红,史丽云.两种淋球菌抗血清制备及效价的观察.
杭州医学高等专科学校学报,1998.2:31—32.
3朱立平,陈学清,主编.免疫学常用实验方法.北京:人民军
医出版社,2000.76—81.
收稿日期20o4—09—09
(编辑太行)